孫晨皓，羅 婷，馬海東，程 佳，路宏朝，張 濤，曾文先

（陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001）

非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（non-human primates，NHPs）的基因組和生理結(jié)構(gòu)最接近人類(lèi)，且規(guī)避了倫理的限制［1］，使其在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中具有不可替代性。獼猴屬（Macaca）隸屬靈長(zhǎng)目猴科，其下分為22個(gè)種，包括恒河猴（Macaca mulatta）、食蟹猴（Macaca fascicularis）和藏酋猴（Macaca thibetana）等［2］，目前常用的實(shí)驗(yàn)猴主要為恒河猴和食蟹猴。我國(guó)是野生靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物分布較為豐富的國(guó)家之一，獼猴屬動(dòng)物的人工飼養(yǎng)也在迅速發(fā)展［3］；但近年來(lái)隨著生物制藥的熱度越來(lái)越高，以及在新冠病毒肆虐全球的嚴(yán)峻形勢(shì)下，全球制藥企業(yè)及科研機(jī)構(gòu)對(duì)于非人靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物旺盛的需求導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)猴供應(yīng)緊張。自然條件下獼猴屬動(dòng)物性成熟年齡為3～4歲，孕期約6個(gè)月，自然妊娠率低，且基本上為一年一胎，恒河猴繁殖有較明顯的季節(jié)性，但食蟹猴繁殖不具有季節(jié)性［4-6］。獼猴屬動(dòng)物種群數(shù)量很難滿(mǎn)足現(xiàn)在的市場(chǎng)需求，因此人工授精技術(shù)顯得尤為重要。人工授精（artificial insemination，AI）是較為簡(jiǎn)單的輔助生殖技術(shù)，將新鮮精子、冷凍保存解凍后的精子或附睪精子轉(zhuǎn)移到雌性生殖道中。AI在包括人類(lèi)在內(nèi)的許多哺乳動(dòng)物繁殖中取得了成功，但在獼猴屬動(dòng)物中應(yīng)用較少，從側(cè)面反應(yīng)出獼猴屬動(dòng)物研究成本昂貴及其特殊性。為提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的利用率和降低成本，可使用冷凍精子完成AI，精子冷凍保存也可以保存種質(zhì)資源，跨越時(shí)間和空間的限制，提供穩(wěn)定且質(zhì)量較好的精子，待需要時(shí)解凍精子。

1 精子的采集

人工授精技術(shù)的第一步是精子的采集。獼猴屬動(dòng)物的采精方法有陰莖電刺激法（penile electrical stimulation method，PEM）［7-9］和直腸探頭電刺激法（rectal probe electrical stimulus method，REM）［10-13］等。相較于陰莖電刺激法，REM操作步驟較繁瑣，且電壓是否灼傷直腸不易觀察，同時(shí)有研究表明REM收集的精子樣本質(zhì)量不如PEM［14］，因此獼猴屬動(dòng)物采集精子多使用PEM。

用于冷凍保存的精子樣本應(yīng)滿(mǎn)足精子活力≥70%［15］，精子密度調(diào)整范圍5.0～10.0×107個(gè)／mL［16］。采精不宜過(guò)于頻繁，同一只公猴一周采集不應(yīng)超過(guò)2次。電刺激法可能誘使公猴出現(xiàn)自淫現(xiàn)象，若發(fā)現(xiàn)有自淫現(xiàn)象應(yīng)及時(shí)調(diào)換實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以避免影響后續(xù)精子樣本質(zhì)量。

2 精子的冷凍保存

精子可在超低溫下長(zhǎng)期保存，但在冷凍和解凍復(fù)蘇的過(guò)程中會(huì)對(duì)精子細(xì)胞造成一定程度的損傷。冷凍損傷可能的機(jī)制有冷休克、冰晶形成、滲透壓應(yīng)激［17-18］和氧化應(yīng)激［19］等，但其具體機(jī)制仍不完全清楚。精子冷凍保存涉及一系列連續(xù)步驟，每一步都與解凍后的精子質(zhì)量息息相關(guān)，因此應(yīng)探尋最適用于猴精子的冷凍保存液和冷凍保存步驟以提高冷凍后的精子質(zhì)量。

2.1 精子密度

L.T.Denis等［20］對(duì)松鼠猴的研究表明，精子濃度可能影響解凍后精子的質(zhì)量。Dong Q.等［16］研究表明，在較高密度下冷凍保存恒河猴精子，解凍后的精子活率較高。建議恒河猴精子冷凍保存時(shí)將精子濃度調(diào)整為（5.0～10.0）×107個(gè)／mL。

2.2 冷凍保存稀釋液液成分

因暫無(wú)商業(yè)化的猴精子冷凍保存稀釋液，冷凍保存稀釋液多現(xiàn)配現(xiàn)用。常用的兩種基礎(chǔ)液是TTE（Tes-Tris-egg yolk）稀釋液［15，21-22］和TCG（Triscitric acid-glucose）稀釋液添加卵黃［23］。

2.2.1 精子冷凍保存液中糖的作用 作為精子能量代謝的底物，糖通過(guò)糖酵解途徑或者三羧酸循環(huán)分解產(chǎn)生ATP，為精子提供能量，同時(shí)也調(diào)節(jié)稀釋液的滲透壓［24］。SiW.等［25］對(duì)比單獨(dú)或聯(lián)合添加葡萄糖（單糖）、乳糖（雙糖）和棉籽糖（三糖）對(duì)恒河猴精子冷凍和解凍過(guò)程中精子質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)多種糖聯(lián)合使用能比單獨(dú)使用棉籽糖具有更好的保護(hù)作用，低濃度（0.15 mol／L）時(shí)，葡萄糖和棉籽糖聯(lián)合使用比乳糖和棉籽糖提供更好的保護(hù)效果。最近有研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物甲基乙二醛（methylglyoxal）會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，且甲基乙二醛的產(chǎn)生與葡萄糖濃度成正比［26-27］。冷凍保存稀釋液中低濃度的葡萄糖可能產(chǎn)生更少的甲基乙二醛，有利于種馬精子的冷凍保存［28］。由于不同物種間的差異性較大，糖毒性作用是否適用于獼猴屬動(dòng)物精子還需進(jìn)一步探索。

近年來(lái)，冷凍保護(hù)液中添加海藻糖（trehalose）的研究越來(lái)越多。海藻糖是一種天然的非滲透性雙糖，在精子冷凍保存過(guò)程中一方面提供高滲環(huán)境，在冷凍操作前使細(xì)胞適度脫水，可減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成［29-31］；另一方面通過(guò)與膜磷脂反應(yīng)并使細(xì)胞膜更快地降到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，穩(wěn)定膜的完整性和頂體 狀 態(tài)［31-33］。目 前 研 究 者 已 在 豬［34］、羊［31，35］、兔［36］和牛［37］等動(dòng)物精子稀釋液中添加一定濃度的海藻糖，均可減少凍后精子細(xì)胞膜和頂體的損傷，但未在獼猴屬動(dòng)物精子冷凍保存中驗(yàn)證。

2.2.2 動(dòng)物源蛋白的添加 自從研究者發(fā)現(xiàn)卵黃有利于維持公牛精子功能與結(jié)構(gòu)的完整性［38］之后，在動(dòng)物精子冷凍保存稀釋液中通常添加卵黃。卵黃對(duì)精子的保護(hù)機(jī)制尚不完全明確，有學(xué)者推測(cè)低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）可能是提供保護(hù)的主要成分［39-41］。LDL有兩方面作用：一方面可以結(jié)合或附著在精子膜上，在精子膜表面形成保護(hù)膜［42］或取代已丟失的磷脂［43-44］；另一方面LDL可能通過(guò)減少精漿中脂結(jié)合蛋白對(duì)精子膜的有害影響而間接保護(hù)精子［45］。精漿中存在一些脂結(jié)合蛋白，可與精子膜結(jié)合，導(dǎo)致膽固醇和磷脂外流［46-47］，進(jìn)而降低精子在冷凍保存過(guò)程中的抗打擊能力。但在恒河猴的精子冷凍保存過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，精子在精漿中存留5 h不會(huì)降低精子冷凍后的活率，推測(cè)卵黃對(duì)恒河猴精子冷凍可能有其他保護(hù)機(jī)制［48］。

卵黃的成分復(fù)雜，含有很多未知的化合物，而且可能帶有禽類(lèi)的病原微生物，有疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要研發(fā)不添加卵黃的稀釋液。Dong Q.等［48］研究表明，冷凍保護(hù)劑中添加不同濃度卵黃對(duì)恒河猴精子解凍后的質(zhì)量并無(wú)顯著影響，但添加組均高于不添加組。Yan Y.P.等［49］和陳衍等［50］研究使用不含卵黃的人用精子冷凍保存液，成功保存了食蟹猴精子，但與含卵黃冷凍保存液相比精子凍后活率較低。

除卵黃外，也有研究在馬、牛和山羊等的精子冷凍保存液中添加脫脂牛奶［45］，但牛奶對(duì)精子具體的保護(hù)機(jī)制仍不清楚。抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）可以減少冰晶的形成和精子復(fù)蘇時(shí)水重結(jié)晶的形成［51］，Wang S.N.等［52］報(bào)道，在食蟹猴精子冷凍保存研究中用AFPⅢ代替卵黃是可行的，但高濃度AFPⅢ（100μg／mL）對(duì)精子頂體完整性有不利影響，其具體影響機(jī)制尚不清楚。

2.2.3 滲透性抗凍劑的作用 甘油、二甲基亞砜、乙二醇和丙二醇等都是滲透性抗凍劑。有研究表明乙二醇在精子冷凍保存過(guò)程中發(fā)揮的作用與甘油相當(dāng)［23，53］，但二甲基亞砜不適用于獼猴精子的冷凍保存［54］。Li Y.H.等［15］的研究對(duì)比了不同甘油濃度（1%、3%、5%、10%和15%）和平衡時(shí)間（10，30，60，90 min）對(duì)精子活率和精子細(xì)胞膜完整性的影響，結(jié)果表明，添加5%甘油并平衡30 min，解凍后精子活力和精子細(xì)胞膜完整性最高。其他研究也表明甘油的最適添加濃度為3%或5%［21-22，55］。加入甘油時(shí)的溫度、冷凍降溫速率和稀釋液其他成分等也影響冷凍效果，因此不同稀釋液或不同冷凍降溫程序選擇的甘油濃度可能不同。

由于甘油等滲透性抗凍劑對(duì)精子也可能造成損害［56-57］，因此考慮是否能不加入抗凍劑。Dong Q.等［58］首次證明，在不含甘油或乙二醇等冷凍保護(hù)劑的情況下可以成功冷凍保存獼猴精子，但解凍后的精子活率較添加甘油差。因此，還需進(jìn)一步優(yōu)化稀釋液配方，如加入抗凍蛋白等替代抗凍劑的作用。

2.2.4 抗氧化劑的作用 精子在降溫、冷凍和解凍過(guò)程中活性氧（ROS）不斷累積，而過(guò)量ROS會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對(duì)恒河猴精子產(chǎn)生不利的影響［59］，引起精子DNA損傷［60］。因此，可在冷凍保存液中添加抗氧化劑，以彌補(bǔ)精子自身自由基清除系統(tǒng)的有限性［61-62］，改善凍后精子的質(zhì)量。根據(jù)抗氧化劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將其分為酶類(lèi)和非酶類(lèi)［63］，其中常見(jiàn)的酶類(lèi)抗氧化劑有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶；非酶類(lèi)抗氧化劑有自由基清除劑，如維生素E（α-生育酚）、維生素C（抗壞血酸）、褪黑素和L-肉堿等［64-65］。獼猴屬動(dòng)物精子冷凍保護(hù)液中抗氧化劑的添加鮮有報(bào)道，將來(lái)應(yīng)更深入探究添加不同抗氧化劑的冷凍保存液對(duì)獼猴屬動(dòng)物精子凍后質(zhì)量的影響。

2.3 精子冷凍程序

甘油只需要幾秒鐘就能滲透到精子細(xì)胞［66］，加入甘油后的平衡時(shí)間較為重要。F.Cho等［67］在稀釋液中加入甘油，對(duì)比甘油未平衡和平衡0.5 h的效果，發(fā)現(xiàn)未平衡組精子冷凍后活率更低。有研究對(duì)比恒河猴精子冷凍保存前在4℃中預(yù)冷與不預(yù)冷時(shí)精子解凍后的活率，結(jié)果預(yù)冷組有小幅度提高［16］。從精子對(duì)降溫的適應(yīng)來(lái)說(shuō)，建議加入預(yù)冷這一步驟。

目前，獼猴屬動(dòng)物的精子冷凍程序基本上與T.L.Tollner等［22］的報(bào)道相似，即采用緩慢的冷卻和快速冷凍相結(jié)合，先用稀釋液將精子第一次稀釋?zhuān)缓笾糜?℃冷卻室中預(yù)冷2～4 h［68］；再添加含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第2次稀釋?zhuān)b入塑料細(xì)管，平衡后置于液氮蒸氣上熏蒸10 min，最后放入液氮中保存。由于熏蒸時(shí)距液氮面的高度及液氮容器大小等均影響冷凍效果、實(shí)驗(yàn)人員的操作誤差，難于標(biāo)準(zhǔn)化制作冷凍精子，優(yōu)先考慮用程序降溫儀冷凍精子［52］。

3 人工輸精

獼猴屬動(dòng)物子宮頸管的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，屬內(nèi)不同種間的結(jié)構(gòu)也存在差異，如恒河猴子宮頸管呈“S”形，食蟹猴子宮頸管雖沒(méi)有恒河猴那么彎曲，但子宮頸管處具有較深的隱窩等［69-70］，使得獼猴屬動(dòng)物的人工輸精比較困難，無(wú)法直接使輸精器達(dá)到宮腔內(nèi)。一般精子是從雌性生殖道探入宮腔內(nèi)［71-73］，也可以在B超引導(dǎo)下通過(guò)腹壁穿刺將精子直接注射到子宮腔內(nèi)［74-75］，但該腹壁穿刺輸精對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作要求較高。

食蟹猴月經(jīng)周期與人類(lèi)相似，也可分為月經(jīng)期、卵泡期、排卵期和黃體期，但因?yàn)閭€(gè)體差異，周期長(zhǎng)短不同［76］。輸精時(shí)間應(yīng)選擇在排卵前，一般在月經(jīng)周期的8～15 d［77］。其具體排卵期還應(yīng)結(jié)合生殖激素測(cè)定，如雌二醇、促黃體生成素、孕酮等［68，73］或B超觀察卵泡發(fā)育情況判斷。另外，一些研究人員通過(guò)陰道涂片法［78］和基礎(chǔ)體溫／體重［79］判斷排卵日期，但這兩種方法收集數(shù)據(jù)較困難，準(zhǔn)確性較差，不宜作為常規(guī)判斷排卵期的方法使用。

4 小結(jié)及展望

隨著疾病治療藥物開(kāi)發(fā)需求的增加，對(duì)獼猴屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的需求量隨之增加。通過(guò)人工授精技術(shù)增加種群數(shù)量，有助于減少實(shí)驗(yàn)猴供應(yīng)的壓力。目前人工授精的難點(diǎn)在于精子冷凍保存，包括精子冷凍保存稀釋液成分的選擇和冷凍程序。使用冷凍精子有助于提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的利用率，改善雄性動(dòng)物的福利，并保護(hù)瀕危的物種。目前獼猴屬動(dòng)物精子冷凍保存研究取得了一定的進(jìn)展，但是研究還不深入。精子冷凍后活率低、受孕率低，還需繼續(xù)改良獼猴屬動(dòng)物精子冷凍保存液配方，如不同糖對(duì)精子的保護(hù)作用、動(dòng)物源蛋白對(duì)精子的具體保護(hù)機(jī)制、植物源蛋白是否可以替代動(dòng)物源蛋白和冷凍保存液中抗氧化劑的添加等；嘗試開(kāi)發(fā)適用于獼猴屬動(dòng)物的商業(yè)化精子冷凍保存劑；繼續(xù)優(yōu)化冷凍保存程序，如甘油的添加方式和時(shí)間、精子預(yù)冷及復(fù)蘇時(shí)間等，從而最大程度地利用好優(yōu)秀的種質(zhì)資源。