席 月，夏 雯

(1. 江蘇大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 鎮(zhèn)江高等專(zhuān)科學(xué)校 醫(yī)藥技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212028)

肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia,Mp)是引起人類(lèi)原發(fā)性非典型肺炎的主要病原體，也是誘發(fā)社區(qū)獲得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP)的重要病原體，可以造成部分患者重癥支原體肺炎甚至死亡[1]。研究表明，重癥支原體肺炎患者體內(nèi)存在著大量過(guò)度表達(dá)的各種促炎細(xì)胞因子，如IL-1β，TNF-α和IL-6等，類(lèi)似于“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)支原體細(xì)胞膜表面含有豐富的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(Lipid-associated membrane proteins, LAMPs)，LAMPs在支原體黏附和侵入宿主上皮細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并進(jìn)一步導(dǎo)致宿主細(xì)胞受損[2-3]。LAMPs還可以影響巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和腦星形膠質(zhì)細(xì)胞功能，從而誘發(fā)上述細(xì)胞過(guò)度表達(dá)促炎細(xì)胞因子，并引起免疫細(xì)胞的壞死或凋亡，導(dǎo)致感染的惡化。但LAMPs誘發(fā)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚不清楚。本研究純化LAMPs并刺激人單核-巨噬(THP-1)細(xì)胞，通過(guò)分析THP-1細(xì)胞各種炎癥因子表達(dá)以及NF-κB信號(hào)通路活化情況，初步揭示肺炎支原體誘發(fā)患者嚴(yán)重肺損傷機(jī)制，為尋找臨床重癥支原體肺炎治療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

1.1.1 細(xì)胞

人單核-巨噬(THP-1)細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室自行保種和培養(yǎng)。肺炎支原體(M129)標(biāo)準(zhǔn)株由南華大學(xué)朱翠明教授惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司。2×Taq PCR預(yù)混液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SYBR Green染料法)、總RNA提取試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊公司。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。ELISA試劑盒，兔組蛋白H1，NF-κB p65，鼠抗β-肌動(dòng)蛋白抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗兔或鼠抗體購(gòu)自美國(guó)ABclonal生物科技公司。ECL顯色液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.1.3 儀器

恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。熒光定量PCR儀、免疫印跡系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。梯度PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2穩(wěn)定傳代至第6代后用于本研究。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 肺炎支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)提取

參照Hu等[4]方法培養(yǎng)Mp，并離心收集Mp沉淀置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將Mp沉淀重懸于8 mL TBSE緩沖液(含50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, pH8.0)，再加入終濃度為2 mL·L-1Triton X-114，4 ℃靜置1 h，再置于37 ℃水浴中孵育10 min。棄上層水相，加入等體積的TBSE緩沖液，重復(fù)上述水相分離操作1次。第2次水相分離結(jié)束后棄去水相，再加入等體積TBSE使之恢復(fù)至最初體積，在整個(gè)體系中加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，于-20 ℃過(guò)夜沉淀LAMPs。次日以14 000 r·min-1離心20 min后棄去上清，沉淀經(jīng)PBS緩沖液充分重懸即為L(zhǎng)AMPs溶液。BCA法測(cè)定所抽提的LAMPs濃度，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞分組及處理

實(shí)驗(yàn)分組包括正常對(duì)照組、0.5 μg·mL-1LAMPs組和5 μg·mL-1LAMPs組。不同濃度LAMPs刺激THP-1細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清用于后續(xù)研究。

1.2.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液各1 mL，4 ℃，1 000 r·min-1離心20 min除去沉淀。采用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IL-1β，IL-18和TNF-α表達(dá)水平，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度值，繪制出各種細(xì)胞因子檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各組細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子含量。

1.2.5 qRT-PCR法檢測(cè)THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥復(fù)合體炎性表達(dá)

使用Trizol試劑抽提THP-1細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)測(cè)定細(xì)胞炎性相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)總體系共20 μL，包括SYBR Green Master預(yù)混液10 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，cDNA模板2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性3 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)公式2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.6 細(xì)胞核漿蛋白分離和免疫印跡法檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)

按上述細(xì)胞分組處理后收集細(xì)胞，棄上清，用4 ℃的PBS清洗2次。按照胞漿胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取胞漿蛋白及胞核蛋白，蛋白變性后采用Western blotting法進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞漿蛋白以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，核蛋白以組蛋白H1為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧含量

采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針?lè)z測(cè)THP-1細(xì)胞中活性氧水平。無(wú)血清培養(yǎng)基按照1 ∶1000比例稀釋DCFH-DA至終濃度為10 μmol·L-1。細(xì)胞重懸于稀釋后的DCFH-DA探針溶液中，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min，隔5 min顛倒混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針，再以無(wú)菌PBS緩沖液重懸細(xì)胞后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)

ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中IL-1β，IL-18和TNF-α含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。與正常對(duì)照組比較，終濃度0.5 μg·mL-1和5 μg·mL-1的LAMPs均可以顯著提高THP-1細(xì)胞IL-1β，IL-18和TNF-α表達(dá)量(P<0.05)，且5 μg·mL-1LAMPs組表達(dá)量明顯高于0.5 μg·mL-1組(P<0.05)。

*： P<0.05，與對(duì)照組比較； #： P<0.05，與0.5 μg·mL-1組比較

2.2 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥復(fù)合體活化

熒光定量PCR法檢測(cè)THP-1細(xì)胞NLRP3和Caspase-1 的mRNA表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組比較，0.5 μg·mL-1組和5 μg·mL-1組細(xì)胞NLRP3和Caspase-1 mRNA表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，且5 μg·mL-1組NLRP3的mRNA表達(dá)量顯著高于0.5 μg·mL-1組(P<0.05)，而Caspase-1的mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較； #： P<0.05，與0.5 μg·mL-1組比較

2.3 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中NF-κB p65蛋白核轉(zhuǎn)位

免疫印跡法檢測(cè)THP-1細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路活化水平，結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常對(duì)照組比較，0.5 μg·mL-1組和5 μg·mL-1組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，且5 μg·mL-1組顯著高于0.5 μg·mL-1組(P<0.05)。而0.5 μg·mL-1組和5 μg·mL-1組細(xì)胞胞漿中NF-κB p65蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較； #： P<0.05，與0.5 μg·mL-1組比較

2.4 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞活性氧生成

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧生成量，結(jié)果見(jiàn)圖4。與正常對(duì)照組比較，0.5 μg·mL-1組和5 μg·mL-1組細(xì)胞活性氧生成量顯著升高(P<0.05)，且5 μg·mL-1組顯著高于0.5 μg·mL-1組(P<0.05)。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較； #： P<0.05，與0.5 μg·mL-1組比較

3 討論

3.1 肺炎支原體及LAMPs的致病機(jī)制

肺炎支原體是呼吸道感染常見(jiàn)病原體，它可以引起人類(lèi)肺炎、氣管支氣管炎、咽炎和哮喘。約25%的社區(qū)獲得性肺炎由Mp所致，雖然大部分患者可自愈，但仍有少部分患者會(huì)發(fā)展為重癥支原體肺炎[5-6]。有研究表明，支原體肺炎惡化的原因在于患者體內(nèi)產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，如IL-1β，TNF-α和IL-6等，類(lèi)似于嚴(yán)重細(xì)菌感染時(shí)發(fā)生的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”現(xiàn)象，患者體內(nèi)發(fā)生過(guò)度免疫反應(yīng)，進(jìn)而造成正常組織和細(xì)胞炎癥的損傷。由于肺炎支原體缺乏細(xì)胞壁，不產(chǎn)生類(lèi)似革蘭陰性菌的脂多糖，因此肺炎支原體誘發(fā)患者強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)的機(jī)制目前仍不清楚[7-8]。

肺炎支原體細(xì)胞膜的主要成分為脂質(zhì)雙分子層和膜蛋白。膜蛋白包括膜本體蛋白和外周膜蛋白。其中膜本體蛋白能夠不同程度地插入到脂質(zhì)雙分子層之間，可以通過(guò)去污劑(如Triton X-114)萃取，而主要靠次級(jí)鍵整合到細(xì)胞膜上的外周膜蛋白則易于釋放。膜本體蛋白和外周膜蛋白統(tǒng)稱(chēng)為L(zhǎng)AMPs。LAMPs大量暴露于肺炎支原體表面，可以直接刺激宿主免疫細(xì)胞活化并誘導(dǎo)炎癥損傷。筆者研究純化了LAMPs并將其體外刺激THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LAMPs可以使THP-1細(xì)胞NF-κB p65蛋白從細(xì)胞漿移位至細(xì)胞核，激活NF-κB信號(hào)通路，并且刺激細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子，從而加重炎癥反應(yīng)。

3.2 LAMPs對(duì)THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活作用

NLRP3炎癥體是一種細(xì)胞內(nèi)感受器，由NOD樣受體家族3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白Caspase-1組成的大分子多蛋白復(fù)合體[9]。NLRP3炎癥小體能被多種刺激物活化，包括微生物組分和內(nèi)源性分子(如活性氧等)[10]。筆者發(fā)現(xiàn)，LAMPs可以誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞活性氧生成，且高濃度LAMPs誘導(dǎo)能力顯著高于低濃度LAMPs。大量活性氧進(jìn)一步誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活，活化的NLRP3炎癥小體進(jìn)而活化Caspase-1，促進(jìn)IL-1β前體和IL-18前體的切割以產(chǎn)生成熟的 IL-1β和IL-18，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。因此NLRP3炎癥小體的激活和調(diào)控具有十分重要的生理和病理意義。通常認(rèn)為，適量的促炎細(xì)胞因子有助于清除侵入的肺炎支原體；但當(dāng)NLRP3炎癥小體過(guò)度活化時(shí)，會(huì)誘發(fā)大量促炎細(xì)胞因子的過(guò)量表達(dá)，并造成大量正常細(xì)胞和組織損傷，進(jìn)而嚴(yán)重威脅患者生命[11]。與低濃度LAMPs比較，高濃度LAMPs誘發(fā)THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體和各種促炎細(xì)胞因子表達(dá)能力更強(qiáng)，其造成的免疫損傷也更為嚴(yán)重。這一點(diǎn)與臨床中肺炎支原體嚴(yán)重感染時(shí)誘發(fā)重癥支原體肺炎相似，LAMPs可能是肺炎支原體的重要毒力因子。

4 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，大量肺炎支原體所產(chǎn)生的高濃度LAMPs可能是誘發(fā)重癥支原體肺炎的主要原因。高濃度LAMPs誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞生成大量活性氧，誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路活化，激活NLRP3炎癥小體，進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量促炎細(xì)胞因子，最終造成正常組織和細(xì)胞的嚴(yán)重炎癥損傷。因此在肺炎支原體感染初期即應(yīng)接受治療，以免肺炎支原體大量增殖造成病情惡化。