王 眾，李可心，孫妍玉，吳 晉

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210011

腦卒中是成人因病致死和致殘的主要原因之一，缺血性卒中占70%以上［1］。目前臨床針對(duì)該類疾病的有效治療藥物是使用組織型纖溶酶原激活劑對(duì)患者進(jìn)行溶栓治療，但是由于種種條件的限制，僅約6%的患者能夠接受溶栓療法［2］。隨著機(jī)械取栓技術(shù)的成熟，更多的缺血性卒中患者得到救治，病死率逐年下降，大部分幸存者轉(zhuǎn)化為慢性局灶性功能障礙［2］，遺憾的是目前臨床尚缺乏促進(jìn)卒中后功能修復(fù)的藥物。

微小RNA-124（microRNA-124，miR-124）是一種在大腦皮層和小腦中特異性表達(dá)最豐富的miRNA［3］，在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)水平較低，而在分化成熟的神經(jīng)元中顯著高表達(dá)，在神經(jīng)元的突觸聯(lián)系和發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。缺血性腦卒中后，miR-124 在體液和組織中的表達(dá)發(fā)生明顯改變，廣泛參與缺血性卒中后的多種病理生理過程，靶向調(diào)控分子水平和病理過程以減輕腦缺血損傷，促進(jìn)功能修復(fù)［4-7］。本文就miR-124 對(duì)缺血性卒中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展做一綜述，旨在為缺血性卒中提供新的標(biāo)志物和可能的治療思路。

1 miR-124作為治療預(yù)后標(biāo)志物

Sun等［8］選取急性缺血性卒中患者與健康人群，檢測血清miR-124表達(dá)水平，結(jié)果提示在缺血后24 h內(nèi)miR-124 迅速下降，48～72 h 內(nèi)逐漸升高，這與既往在動(dòng)物MACO模型中檢測到的miR-124變化情況略有差異，但變化趨勢完全相同。多項(xiàng)研究證明，卒中患者的血清、血漿、腦脊液以及死于卒中的患者大腦樣本中miR-124的表達(dá)水平均顯著升高［8-11］，且miR-124表達(dá)水平與卒中后的梗死體積和腦損傷程度呈正相關(guān)［10-11］。缺血性卒中后血清miR-124水平升高是腦組織受損后釋放miR-124 進(jìn)入體液的結(jié)果，因而miR-124 水平與病變大小顯著相關(guān)。同時(shí)，Rainer 等［12］發(fā)現(xiàn)缺血性卒中超早期（＜6 h）血漿miR-124 的變化程度可以預(yù)測患者3個(gè)月的復(fù)發(fā)率和死亡率。這些研究證明miR-124有望成為缺血性卒中早期敏感的輔助診斷和評(píng)估治療預(yù)后的生物標(biāo)志物。

2 miR-124的作用機(jī)制

缺血性腦損傷后，組織中氧、糖獲得障礙，觸發(fā)原發(fā)和繼發(fā)性損傷，包括多種類型的細(xì)胞反應(yīng)、缺血再灌注損傷以及血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞等，最終導(dǎo)致局灶性神經(jīng)功能缺陷，甚至死亡［9，13］。中風(fēng)后根據(jù)時(shí)間分為3個(gè)不同的時(shí)期：急性期（2周內(nèi)）、恢復(fù)期（2周～3個(gè)月）和后遺癥期（3個(gè)月后）［14］，miR-124有望治療缺血性卒中的機(jī)制在于其發(fā)揮了減輕急性期腦缺血損傷和促進(jìn)恢復(fù)期功能修復(fù)的作用（圖1）［9］。

圖1 miR-124調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡和功能修復(fù)的信號(hào)通路Figure 1 Signaling pathways underlying the roles of miR-124 in regulating oxidative stress，neuroinflammation，apoptosis and functional repair

2.1 miR-124與氧化應(yīng)激

在血流缺失的超早期（＜24 h），過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生介導(dǎo)了氧化應(yīng)激過程并激活急性期神經(jīng)內(nèi)源性炎癥反應(yīng)，ROS 和炎癥因子的釋放破壞了細(xì)胞外基質(zhì)和連接蛋白，產(chǎn)生廣泛性細(xì)胞損傷，神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行性死亡［15］。ROS 主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）作用生成，ROS 過量產(chǎn)生引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)激活了NF-κB 通路，合成早期促炎細(xì)胞因子，增強(qiáng)神經(jīng)炎癥［13］，在NOX 家族的7 個(gè)成員中，NOX2 和NOX4被認(rèn)為是再灌注8～16 h內(nèi)ROS的主要來源。體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，神經(jīng)元中的miR-124-5p 直接與CYBB（合成NOX2的基因）的3′UTR結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)NOX2水平［16］，減少ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)、核酸的過氧化，并抑制NF-κB 通路誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，縮小梗死面積［6］。泛素特異性蛋白酶14（ubiquitin-specific proteases14，Usp14）是一種去泛素化的蛋白質(zhì)，是蛋白酶體活性的主要調(diào)節(jié)因子，Min等［17］證實(shí)miR-124靶向抑制Usp14，改變細(xì)胞靜息狀態(tài)，增強(qiáng)蛋白酶體活性，從而減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。miR-124平衡了自由基的產(chǎn)生和消除，避免了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的直接損傷。

2.2 miR-124與神經(jīng)炎癥

缺血后炎癥反應(yīng)是缺血性卒中急性期廣泛性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵病理生理機(jī)制，炎癥反應(yīng)早期小膠質(zhì)細(xì)胞激活，向不同表型M1型和M2型極化［18］。早期小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，清除細(xì)胞碎片，釋放神經(jīng)保護(hù)性營養(yǎng)因子和抗炎介質(zhì)，卒中晚期具有促炎性的M1 型細(xì)胞釋放促炎因子，對(duì)組織造成炎癥損害。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度反應(yīng)、調(diào)節(jié)M1/M2的極化有益于神經(jīng)恢復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過外泌體能靶向遞送大量miR-124 至腦組織，直接抑制腦損傷后的Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4），促進(jìn)其向M2 極化，改善功能恢復(fù)［5］。同樣，缺血性卒中后腦內(nèi)注射miR-124通過促使小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸2抗炎表型釋放抗炎因子，如白介素（interleukin，IL）-10、IL-4和IL-13，并激活T細(xì)胞來抑制炎癥的發(fā)展［19］。miR-124 顯著降低炎癥因子如TLR4、NF-κB和小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物IBA1的表達(dá)，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥［20］，改善缺血性中風(fēng)后的抗炎作用和長期功能預(yù)后。上述研究提示miR-124可能作為一種新的抗炎調(diào)節(jié)劑。

2.3 miR-124與細(xì)胞凋亡

隨著早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生，細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞激活，卒中后1 周遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡（凋亡）啟動(dòng)，JAK2/STAT3 通路是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的典型調(diào)節(jié)通路［21］，Hu 等［22］發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷急性期miR-124 靶向抑制JAK2 的激活及下游STAT3 的磷酸化，發(fā)揮抗凋亡作用，提高神經(jīng)細(xì)胞存活率。雖然缺血再灌注損傷后，miR-124的表達(dá)水平升高，但隨著缺血再灌注損傷的加重，其代償作用減弱。而注射外源性miR-124 直接抑制STAT3 蛋白，顯著降低了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)［23］。同時(shí)，miR-124通過靶向激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)、抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)來減少大鼠腦缺血區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，減少功能缺損［24］。miR-124 激活Wnt/β-catenin 通路后抑制腦缺血再灌注區(qū)神經(jīng)元的凋亡而改善氧化應(yīng)激的神經(jīng)損傷，顯著提高神經(jīng)干細(xì)胞的再生水平［25］。這些結(jié)果證明了miR-124 具有早期抗凋亡作用，降低腦損傷體積。

不同研究者對(duì)miR-124調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡作用的認(rèn)識(shí)有差異［4，26-27］。Wang 等［4］觀察到miR-124 激活PI3K/Akt 發(fā)揮抗凋亡作用，通路激活后上調(diào)Bcl-2，減輕缺血性卒中細(xì)胞損傷和壞死。同時(shí)，miR-124 激活PI3K/Akt/Nrf2 途徑增加熱休克蛋白的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激和凋亡過程，保護(hù)PC12細(xì)胞免受氧-糖剝奪復(fù)氧（OGD/R）損傷［26］。而另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，梗死后升高的miR-124負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Bax和炎癥因子Caspase-3的表達(dá)，加重神經(jīng)元活力下降和軸突損傷［27］。因此，miR-124調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚需更多研究來證實(shí)。

2.4 miR-124與功能修復(fù)

卒中后僅通過損傷后代償性激活的神經(jīng)元前體向神經(jīng)元分化來對(duì)受損腦組織進(jìn)行修復(fù)是不夠的，一個(gè)有希望的途徑是優(yōu)化卒中急性期至后遺癥期的神經(jīng)分化、增殖過程，以促進(jìn)自我修復(fù)。miR-124可以通過靶向抑制DACT1 的表達(dá)來激活Wnt/βcatenin 通路，最終促進(jìn)損傷后早期神經(jīng)干細(xì)胞存活和向神經(jīng)元分化［28］。在實(shí)施OGD/R 前預(yù)先抑制miR-124 表達(dá)，可顯著激活PI3K/Akt/mTOR 通路，加強(qiáng)蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)損傷后軸突生長［29］。而Wang 等［30］也證實(shí)了miR-124 靶向調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，持續(xù)調(diào)控神經(jīng)元再生、發(fā)育和可塑性。Song等［31］應(yīng)用miR-124抑制Usp14，調(diào)節(jié)突觸活性，促進(jìn)突觸重塑、神經(jīng)元連接和神經(jīng)血管再生。這些研究提示miR-124是改善早期神經(jīng)功能恢復(fù)的重要靶點(diǎn)。

急性期之后是炎癥反應(yīng)減弱和可塑性最大的恢復(fù)期，在嚙齒類動(dòng)物中持續(xù)大約1個(gè)月，在人類腦卒中后持續(xù)長達(dá)3個(gè)月，隨著時(shí)間進(jìn)展，可塑性逐漸降低，在后遺癥期誘導(dǎo)康復(fù)的潛力有限［14］。卒中恢復(fù)期JAK2/STAT3 的激活促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞生長，膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)增強(qiáng)，形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)元再生。miR-124 與STAT3 的3′UTR 結(jié)合，直接抑制STAT3 表達(dá)，在MCAO 小鼠模型中，注射外泌體搭載的miR-124 后，STAT3 和p-STAT3（STAT3的活化形式）水平較注射前明顯降低，膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，神經(jīng)瘢痕形成減少［7，31］。Notch 通路是細(xì)胞增殖、分化和成熟組織的凋亡中的重要調(diào)節(jié)通路，同時(shí)也是維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育功能的主要調(diào)節(jié)因子［32］。miR-124 通過調(diào)節(jié)Notch 通路來促進(jìn)缺血損傷后的神經(jīng)干細(xì)胞的定向增殖和分化，優(yōu)化神經(jīng)生發(fā)過程，以調(diào)節(jié)腦功能和促進(jìn)視覺系統(tǒng)的再生，加快自我修復(fù)［28，33］。其中可能的機(jī)制是缺血誘導(dǎo)后，升高的miR-124 直接靶向和抑制Notch1 受體，增加下游轉(zhuǎn)錄因子Sox2 水平，觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞中潛在的神經(jīng)再分化程序，將星形膠質(zhì)細(xì)胞逆轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)一步分化為功能完善的神經(jīng)元，減少膠質(zhì)瘢痕產(chǎn)生，直接參與卒中后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建［7］。

3 miR-124治療缺血性卒中臨床轉(zhuǎn)化的可能性

雖然有證據(jù)支持miR-124是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的一種有前途的治療藥物，但BBB限制了其進(jìn)入大腦，如體外實(shí)驗(yàn)顯示負(fù)載miR-124 的納米顆粒增加了體外神經(jīng)元細(xì)胞的存活和神經(jīng)元分化，但在動(dòng)物體內(nèi)并沒有改善中風(fēng)預(yù)后［34］。因此在使用miR-124 治療急性卒中之前，需要明確其給藥方式。目前的問題是需要設(shè)計(jì)一種跨越BBB 的miR-124 遞送系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)組織/細(xì)胞特異性靶向，已經(jīng)開發(fā)了幾種方法將miRNA 輸送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)用于治療炎癥、腦卒中和帕金森病，包括外泌體、納米顆粒、腺相關(guān)病毒［35］。裝載miR-124的外泌體能被特異性遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生［35］。

外泌體是30～100 nm 的囊泡，是細(xì)胞外小泡的主要類型［20］。外泌體顆粒的小尺寸和高脂成分有助于它們通過BBB 轉(zhuǎn)運(yùn)活性物質(zhì)（胞漿蛋白、脂質(zhì)和RNA 等），在細(xì)胞間高效穿梭或運(yùn)送小分子到大腦中特定的靶細(xì)胞群，以介導(dǎo)疾病和損傷后的大腦重構(gòu)，同時(shí)神經(jīng)細(xì)胞分泌的外泌體被發(fā)現(xiàn)有助于缺血性中風(fēng)后局部突觸的重塑［36］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外泌體可將幾種miRNA 模擬物和抑制劑有效輸送到大腦，并可以保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受損傷［37］。而將攜帶miR-124 的外泌體注射到梗死區(qū)，可極大地促進(jìn)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化，減輕缺血性卒中后的皮層損傷［38］。miR-124 在M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體中含量豐富，可靶向送至腦內(nèi)被神經(jīng)元攝取，促進(jìn)神經(jīng)生發(fā)，并下調(diào)Usp14來減輕神經(jīng)元凋亡，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血再灌注損傷［31］。除了促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，靜脈注入外泌體miR-124還可以抑制神經(jīng)細(xì)胞炎癥和神經(jīng)元自噬，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，改善腦損傷后的認(rèn)知和預(yù)后［5，39］。這些研究表明，外泌體可能成為外源性miRNA進(jìn)入腦內(nèi)的載體，外泌體搭載miR-124可能是治療缺血性卒中的潛在方法。

4 總結(jié)與展望

缺血性腦損傷涉及的細(xì)胞和分子變化提供了大量潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)?；趍iRNA調(diào)控多種分子及信號(hào)通路表達(dá)的特性，miRNA 研究已經(jīng)成為治療缺血性腦損傷的熱門領(lǐng)域。盡管miR-124 在缺血性卒中的治療中仍有不同的結(jié)論，有待進(jìn)一步研究，但miR-124 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的生物學(xué)意義和治療作用日益明顯，同時(shí)外泌體有望作為藥物載體和跨BBB 的輸送載體。為了使miR-124更安全、有效地用于缺血性卒中的診治，需要實(shí)現(xiàn)其組織/細(xì)胞特異性靶向，提供更高的穩(wěn)定性和避免潛在的靶外效應(yīng)，以及根據(jù)個(gè)體特征確定治療窗口和治療模式，基于miRNA藥物的系統(tǒng)藥代動(dòng)力學(xué)也許能提供新的思路?？傊?，現(xiàn)有的研究表明miR-124為缺血性卒中的診治提供了新思路。