王曉麗，王 敏，岳愛琴，郭數(shù)進，王 鵬，王利祥，楊婷婷，張海生，張永坡，高春艷，張武霞，牛景萍，杜維俊，趙晉忠

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 基礎(chǔ)部，山西 太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

氮素是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，在植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)形成過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。因此，提高氮素吸收效率、適當(dāng)增施氮肥是大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要保障。當(dāng)?shù)毓?yīng)不足時，植物新陳代謝發(fā)生紊亂，體內(nèi)物質(zhì)合成和轉(zhuǎn)化受到影響，氮素利用下降，生長發(fā)育會受到影響。Chun等[2]研究表明，在低氮誘導(dǎo)下，水稻中葉片的生長素含量上升，另外，根長、根的密度和根冠比增加。低氮脅迫導(dǎo)致植物葉片的光合作用受到抑制，從而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。李強等[3]研究表明，耐低氮玉米能夠緩解低氮脅迫對光合作用的影響，從而使得較高的氮素含量在植物體內(nèi)積累。孫年喜等[4]研究表明，不同氮素水平對玉米光合特性具有不同的影響，隨著供氮水平的增加，其光合速率和葉綠素值(SPAD值)均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。當(dāng)植物受到低氮環(huán)境脅迫時，可將氮素從衰老的葉片中運輸?shù)捷^年輕的葉片中，從老葉中輸出的氨基酸用于正在發(fā)育中的幼葉中酶、核苷酶、葉綠素和調(diào)節(jié)蛋白等物質(zhì)的合成，以維持植物正常生長發(fā)育[5]。

豆科植物不僅可以從大氣土壤中吸收氮素營養(yǎng)，還能夠與根瘤菌共生固氮，為其自身提供氮素。大豆作為重要的共生固氮糧食作物，其生長所需氮素營養(yǎng)的50%～90%是由根瘤菌-大豆共生體系固定的，接種根瘤菌后其種子周圍和土壤中的根瘤菌數(shù)量增加，其根部能夠獲得更多根瘤，進而提高作物產(chǎn)量[6]。梁福琴等[7]研究表明，在大豆中，當(dāng)?shù)嘏c根瘤菌共同作用時，其生理指標(biāo)能夠達到最佳值，使得大豆獲得豐產(chǎn)。研究表明，大豆播種前施用適量氮肥，能夠促進根瘤原基形成和根瘤生長，提高土壤中根瘤菌性能，促進植株生長，為共生固氮提供有效的碳匯和能量匯[8]。因此，在氮素循環(huán)中，豆科作物與根瘤菌共生固氮互作體系充當(dāng)著非常重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，輕度缺失硝態(tài)氮的情況下能促進根系生長，重度缺失硝態(tài)氮或硝態(tài)氮濃度較高時會抑制根系生長[9]。而豆科植物共生固氮的特點使其有別于其他植物，Gan等[10]研究不同氮濃度對大豆結(jié)瘤性狀的影響發(fā)現(xiàn)，氮濃度高于10 mmol/L時，無論供氮形式是硝態(tài)氮、銨態(tài)氮還是硝酸銨，均顯著降低了大豆根瘤數(shù)、根瘤質(zhì)量以及總固氮量，硝態(tài)氮對根瘤生長發(fā)育及固氮酶活性抑制作用較銨態(tài)氮更強。

大豆既可通過主動運輸?shù)姆绞轿绽猛饨绲貭I養(yǎng)，也可通過其根部特化組織根瘤進行共生固氮(Symbiotic nitrogen fixation，SNF)，獲取氮素營養(yǎng)[11]。目前，豆科植物氮素營養(yǎng)的吸收和根瘤菌接種對大豆結(jié)瘤固氮和生長的影響鮮有研究。

本研究通過對大豆不同濃度氮處理及接種根瘤菌劑同時處理，以探究大豆結(jié)瘤固氮情況和不同組織器官中氮素積累情況以及對葉表型性狀的影響，旨在為大豆氮素高效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試大豆品種為Williams 82；大豆根瘤菌株(Bradyrhizobiumjaponicum)采用中國農(nóng)業(yè)大學(xué)CCBAU提供的USDA110。

1.2 試驗方法

試驗在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆溫室進行。

1.2.1 根瘤菌株的活化 在超凈工作臺中，用接種環(huán)挑取1環(huán)甘油菌在YMA培養(yǎng)基上劃線，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；后挑取1環(huán)活化后的菌株接種至裝有200 mL YMA培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，并于28 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔1 d觀察根瘤菌株USDA110培養(yǎng)液渾濁情況，需要培養(yǎng)5 d左右。

1.2.2 不同氮濃度處理 根據(jù)大豆生長發(fā)育所需氮素營養(yǎng)，以KNO3為氮源，分別設(shè)置無氮(0 mmol/L，NN)、低氮(0.25 mmol/L，LN)和高氮(10 mmol/L，HN)3個不同濃度的硝酸鹽營養(yǎng)液，將Williams 82分別種植在含有不同濃度硝酸鹽營養(yǎng)液浸濕的蛭石基質(zhì)中，均以不接菌為對照，3次重復(fù)。

1.2.3 接種根瘤菌處理 蛭石滅菌裝入10 cm×10 cm的營養(yǎng)缽中。將大豆Williams 82于92%的酒精中滅菌5 min，再用5%的NaClO進行表面消毒5 min，之后用無菌水清洗10次，于營養(yǎng)液浸濕的蛭石中發(fā)芽(基礎(chǔ)營養(yǎng)液配制參照文獻[12])。7 d之后進行間苗，每個營養(yǎng)缽留有2株長勢一致的大豆，放置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，16 h光/8 h暗，光照溫度25 ℃，黑暗溫度16 ℃，光照強度10 000 lx，相對濕度70%；待第1片真葉完全展開后，將大豆慢生根瘤菌USDA110(OD600=0.08)輕輕接在大豆幼苗根系周圍，每株大豆接30 mL菌液，分別在接菌后0.5 h(根毛識別根瘤菌)、1 d(根毛卷曲)、4 d(結(jié)瘤原基形成)、16 d、28 d(2個結(jié)瘤早期發(fā)育時期)[13]觀察其結(jié)瘤情況，取葉片、根、根瘤樣品，測定每個植株的根干質(zhì)量、根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量，以不接菌為對照，接種USDA110作參照菌株，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 葉形態(tài)特征的測定 植物樣品葉片形態(tài)特征采用智能葉面積測量系統(tǒng)(YMJ-C/CH)進行測定。

1.3.2 氮含量的測定 試驗樣品氮含量測定采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法凱氏定氮法進行。將樣品放置在烘箱中105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干，稱取等質(zhì)量樣品，用球磨儀將樣品粉碎，過200 mm篩備用。取樣品0.1 g置于消化管底部，以硫酸銅和硝酸鉀作為催化劑，向消化管中加入3 g的混合催化劑，然后加入5 mL濃硫酸搖勻，消解植物樣品；待消煮管中液體呈現(xiàn)綠色透明顏色時，將消煮管取下進行凱氏定氮法測定氮含量，在高溫下將植物葉片中的含氮化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，然后用氫氧化鈉堿化，加熱蒸餾出氨，此時消化管中液體顏色為褐色表明反應(yīng)完全，經(jīng)硼酸吸收后，用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計算含氮量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0和Excel 2016對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；采用R語言進行作圖；使用CS 6.0對試驗圖片進行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮水平接種根瘤菌對大豆根瘤數(shù)目、根瘤干質(zhì)量和根干質(zhì)量的影響

待第1片真葉完全展開后，對不同氮濃度處理的大豆實生苗接種根瘤菌，28 d后觀察其表型，結(jié)果顯示(圖1)，接種根瘤菌后的結(jié)瘤情況表現(xiàn)為NN>LN>HN，無氮接菌下結(jié)瘤數(shù)最多，隨著氮濃度的增加，根瘤數(shù)逐漸減少。此外，不同氮濃度下根瘤數(shù)目和根瘤干質(zhì)量均呈現(xiàn)相同的變化趨勢，無氮處理顯著高于低氮處理(P<0.05)，低氮處理顯著高于高氮處理(P<0.05)(表1)；而根干質(zhì)量呈現(xiàn)相反的變化趨勢，無論接菌與不接菌，高氮處理下根干質(zhì)量均顯著高于低氮和無氮處理(P<0.05)，而在低氮和無氮處理間則不存在顯著差異。由不同氮濃度接種根瘤菌對大豆根系的影響數(shù)據(jù)表明，不同施氮水平對根瘤數(shù)目、根瘤干質(zhì)量和根干質(zhì)量都有不同程度的影響。

圖1 不同氮濃度處理下接種根瘤菌的結(jié)瘤情況Fig.1 Nodular situation of rhizobia inoculated under different nitrogen concentrations

表1 不同氮濃度下接種根瘤菌對大豆根部的影響Tab.1 Effect of inoculation of rhizobia with different nitrogen concentration on soybean root

2.2 不同氮水平下接種根瘤菌大豆植株氮素積累變化

在不同施氮水平下，大豆不同器官氮素含量在接種和不接種間表現(xiàn)出不同的變化趨勢，且不同器官氮素含量整體呈現(xiàn)葉>根>莖的現(xiàn)象(圖2)。對于葉組織中氮素含量而言，無論接菌與不接菌，高氮處理下葉組織的氮素含量均顯著高于低氮處理(P<0.05)，而在不接菌的情況下，低氮處理下的氮素含量顯著高于無氮處理(P<0.05)，接菌后二者之間差異不顯著；對于莖組織的氮素含量，無論接菌與不接菌，其氮素含量在不同氮濃度處理下表現(xiàn)為相同的變化趨勢，即高氮>低氮>無氮，且差異均達顯著水平(P<0.05)。根組織中的氮素含量變化趨勢與葉組織一致。

不同小寫字母表示接菌或不接菌下不同氮水平上存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一氮水平上接菌和不接菌間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicated significant differences between inoculated and non-inoculated nitrogen levels(P<0.05)；Different capital letters indicated significant differences between inoculated and non-inoculated at the same nitrogen level(P<0.05).

2.3 不同氮素水平條件下接種根瘤菌不同葉位葉綠素值(SPAD)的變化

由圖3可知，不同處理條件下，不同葉位SPAD值均呈現(xiàn)不同的變化趨勢。除了在接菌下，第1葉的SPAD值表現(xiàn)為HN>LN>NN，且存在顯著差異(P<0.05)外，其他葉位的SPAD值在不同氮水平處理下均為高氮處理顯著高于低氮和無氮處理(P<0.05)，而在低氮和無氮處理之間不存在顯著差異。此外，不同葉位之間SPAD值在不同氮素水平下也呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，其中，在無氮水平下，SPAD值依次為第1對真葉>第1葉>第2葉，且彼此之間存在顯著差異(P<0.05)；無論在接菌還是不接菌在低氮水平下，第1對真葉和第1葉時SPAD值顯著高于第2葉(P<0.05)，而在第1對真葉和第1葉之間差異不顯著；在接菌情況下，高氮處理的SPAD值在第1葉中含量顯著高于第1對真葉和第2葉(P<0.05)，說明高氮處理可以促進地上部氮素向第1葉轉(zhuǎn)運。無論是在不同氮素水平上，還是不同葉位之間，接菌與不接菌都呈現(xiàn)相同的變化趨勢，說明接菌不影響葉片之間氮素的轉(zhuǎn)運。

不同小寫字母表示同一氮水平上不同葉位間存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一葉位上不同氮水平間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicated significant differences between different leaf positions at the same nitrogen level(P<0.05)；Different capital letters indicated significant differences between different nitrogen levels at the same leaf position(P<0.05).

從圖4植株的生長狀況也可以看出，高氮處理下植株的長勢明顯優(yōu)于無氮和低氮處理，且從葉片的顏色也可以看出，無氮和低氮處理葉片整體發(fā)黃，而在高氮處理下，葉片呈現(xiàn)青綠色，尤其是第1葉更為明顯，這也與圖3結(jié)果相吻合。

圖4 不同氮水平條件下接菌后的植株生長Fig.4 Plant growth after inoculation under different nitrogen levels

2.4 不同氮素水平下接種根瘤菌葉形態(tài)指標(biāo)的變化

由表2可知，在不接菌情況下，不同葉位在不同氮素水平上葉形態(tài)指標(biāo)均呈現(xiàn)相同的變化趨勢，葉面積、葉周長、葉長和葉寬在低氮和高氮處理均顯著高于無氮處理(P<0.05)；在接菌情況下，第1對真葉形態(tài)指標(biāo)在不同氮素水平上呈現(xiàn)HN>NN>LN，而第1葉葉面積、葉周長和葉寬在不同氮素水平上沒有顯著差異，第1葉葉長在無氮水平下顯著高于低氮(P<0.05)。在不接菌情況下，葉長在低氮和高氮水平下顯著高于無氮處理(P<0.05)；第2葉的葉面積、葉周長、葉長、葉寬在低氮和高氮水平下均顯著高于無氮(P<0.05)。此外，在同一氮素水平上，不同葉位的葉形態(tài)也表現(xiàn)出不同的變化趨勢，在不接菌情況下，無氮處理條件下除了葉長呈現(xiàn)第1葉>第1對真葉>第2葉外，其他葉形態(tài)指標(biāo)(葉面積、葉周長、葉寬)均表現(xiàn)為第1對真葉和第1葉顯著高于第2葉(P<0.05)，且第1對真葉和第1葉之間差異不顯著；而在低氮和高氮處理下，不同葉位之間的葉形態(tài)指標(biāo)(葉面積、葉周長、葉長、葉寬)均差異不顯著；在接菌情況下，在無氮處理下，第1葉的葉面積、葉周長均顯著高于第1對真葉和第2葉(P<0.05)，第1葉的葉長顯著高于第1對真葉，第1葉的葉寬顯著高于第2葉(P<0.05)，而在高氮處理下，不同葉位之間差異不顯著。

表2 不同處理下不同葉位的葉形態(tài)指標(biāo)的變化Tab.2 Leaf morphological indexes changes of different leaf positions under different treatments

3 結(jié)論與討論

有研究表明，根瘤數(shù)目和質(zhì)量與施氮量的增加呈負(fù)相關(guān)[14]；但當(dāng)外源氮素水平較高時，會對結(jié)瘤起到抑制作用[15]。本研究為了研究不同氮素水平下接種根瘤菌對大豆根部及其結(jié)瘤的影響，在幼苗期接種根瘤菌28 d后，對根干質(zhì)量、根瘤性狀與植物各組織氮含量進行測定表明，隨著施氮量的增加根瘤數(shù)逐漸減少，無氮處理下根瘤最多，高氮處理下根瘤最少；在高氮處理下，大豆根瘤出現(xiàn)氮阻遏現(xiàn)象，可能是由于氮素濃度過高，破壞了根瘤菌菌體結(jié)構(gòu)，降低了固氮酶的活性，抑制了根瘤的生長，這與鄭永美等[16]的研究結(jié)果相一致。此外，過度結(jié)瘤會導(dǎo)致中午光合作用降低，從而降低總根向蒸發(fā)組織提供水的能力。能夠結(jié)瘤的豆科植物通過蒸騰作用彌補水分損失的能力有限，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，從而降低光合速率[17]；在這種情況下，寄主植物和根瘤之間爭奪碳水化合物的競爭會加劇，導(dǎo)致植物生長和種子產(chǎn)量進一步下降[18]。事實上，大豆結(jié)瘤固氮和氨同化需要大量的光合作用產(chǎn)物，以提供根系結(jié)瘤所增加的呼吸負(fù)擔(dān)和氮有機合成所需的碳骨架[19]。無氮處理的根干質(zhì)量最小，根瘤數(shù)最多，而高氮處理的根干質(zhì)量最大，根瘤數(shù)最少。隨著氮濃度的增加，根干質(zhì)量與根瘤數(shù)呈負(fù)相關(guān)，這可能與大豆植株結(jié)瘤減少了根系生物量有關(guān)。有報道表明，根瘤是較強的碳水化合物匯，因此，根瘤可以減少糖向根細(xì)胞的轉(zhuǎn)運，減少根系的生長[20]。

大豆在生育前期，子葉所含的氮素不足以支持大豆生長發(fā)育，而根瘤的固氮作用尚未完全建成，在短時間內(nèi)會出現(xiàn)氮素的缺乏，因此，要通過氮素的添加來滿足大豆生長發(fā)育[21]。本研究表明，無論在根、莖還是葉中，氮含量在高氮處理時均大于低氮處理，低氮處理大于無氮處理。在大豆苗期時，施氮能夠明顯增加大豆植株前期的氮素積累，氮濃度越高促進效果越明顯[22]。不管是接菌還是不接菌處理，葉中氮含量均大于根中氮含量，根中氮含量均大于莖中氮含量。葉綠體是進行光合作用的場所，氮素是葉綠素的重要組成成分，適當(dāng)增施氮肥有利于葉綠素的合成，研究表明，葉綠素含量越高，氮含量越高[23]。不接菌時，低氮處理的葉和莖的氮含量顯著高于無氮處理，接菌后，低氮處理莖的氮含量顯著高于無氮處理，此時根瘤開始固氮，并向地上部運輸。Sun等[24]研究表明，低氮脅迫會抑制植物葉片的光合作用，葉片所吸收的光能產(chǎn)生了過量的活性氧和丙二醛等物質(zhì)，使植物體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)，生物膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)遭到破壞，植物最終失去光合能力。

有研究表明，較高的葉片氮含量，能夠提高葉綠素含量并參與光合電子傳遞的蛋白質(zhì)水平，提高初級光化學(xué)反應(yīng)的效率和光合能力[25]。本研究中，在不同葉位，不同接菌處理條件下，高氮處理的SPAD值最大，葉片墨綠，植株高大；低氮與無氮處理，植株矮小，葉片發(fā)黃，分枝變少，這是由于當(dāng)?shù)毓┙o不足時，植株體內(nèi)核酸、葉綠素、蛋白質(zhì)合成受到阻礙，導(dǎo)致植物出現(xiàn)缺綠癥；降低其光合速率及光合產(chǎn)量。研究表明，氮含量越大，葉綠素含量越大，SPAD值越大[9]。在氮誘導(dǎo)下，氮的積累根據(jù)植株葉片生長程度的不同而存在差別，具體表現(xiàn)為成長中葉片(第1葉)>新生葉片(第2葉)>成熟葉片(第1對真葉)，植株氮素構(gòu)成的變化直接影響著新生莖、葉氮素構(gòu)成變化，老葉通過葉肉降解，提供給幼葉營養(yǎng)物質(zhì)，維持幼葉正常生長發(fā)育[26]。無氮處理下，不同葉位的SPAD值自下而上依次遞減，此時，由共生固氮合成的氮素逐漸向缺氮部位轉(zhuǎn)運。另外，葉片性狀是決定植物品質(zhì)的重要因素，主要包括葉面積、葉周長、葉長、葉寬等[27]。有研究表明，良好的群體葉面積指數(shù)、葉面積持續(xù)時間(光合面積持續(xù)期)、光合勢是大豆獲得高產(chǎn)的基礎(chǔ)[28]。本研究中，第1葉的葉片性狀最好，與其SPAD值相吻合。在無氮處理條件下，接菌之后，不同葉位葉面積均顯著增加，高于低氮接菌處理；在低氮和高氮處理條件下，接菌之后，葉面積均減少。研究表明，更多的結(jié)瘤提供的更高的氮利用率(氮含量)可以促進植物的生長，因為生物量的產(chǎn)生依賴于氮來合成多種分子，如葉綠素和Rubisco，以及蛋白質(zhì)、核酸和各種酶輔助因子[29]。

綜上所述，大豆共生固氮不需要外界施加過量氮素營養(yǎng)，施氮量越多，根瘤數(shù)越少，共生固氮效果越差。根瘤可以減少糖向根細(xì)胞的轉(zhuǎn)運，減少根系的生長；施氮量越多，根瘤數(shù)越少，根干質(zhì)量越大。在大豆苗期，施氮能夠明顯增加大豆植株前期的氮素積累，促進葉表型性狀，氮濃度越高促進效果越明顯，適當(dāng)增加氮素營養(yǎng)可以提高大豆各器官中氮素的積累量。