李 曼，史曉蕾，邸 銳，劉志芳，孟慶民，付 才，楊春燕，王冬梅，張孟臣，張 潔，閆 龍

(1.華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，國(guó)家大豆改良中心石家莊分中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；3.河北省種子總站，河北 石家莊 050031；4.河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051)

大豆(Glycinemax(L.)Merrill)為人類提供了1/3的植物蛋白和食用油，在農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中地位重要。近年來(lái)，我國(guó)大豆種業(yè)市場(chǎng)日趨活躍，大豆種子企業(yè)初具規(guī)模，育成品種(如黑河43、齊黃34、中豆63等)也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)品種權(quán)高價(jià)轉(zhuǎn)讓。但種子純度低、套名裝袋等不規(guī)范行為在市場(chǎng)上屢有發(fā)生。大豆種質(zhì)資源保存過(guò)程中，同名異種、同種異名等現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生[1]。

我國(guó)各級(jí)區(qū)域試驗(yàn)要求利用分子標(biāo)記鑒定種子純度、并建立品種指紋圖譜[2-3]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequencing Repeat，SSR)標(biāo)記[4]、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphic，SNP)標(biāo)記[5]和插入/缺失片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Insertion/Deletion，InDel)標(biāo)記[6-8]等，可用于大豆品種純度檢測(cè)和指紋圖譜構(gòu)建[9]。SSR標(biāo)記是目前各級(jí)區(qū)試品種純度檢測(cè)中普遍使用的分子標(biāo)記，但利用SSR標(biāo)記進(jìn)行基因型分析時(shí)，多數(shù)位點(diǎn)產(chǎn)生的等位變異數(shù)目多，導(dǎo)致不同批次試驗(yàn)結(jié)果間可比性差。插入/缺失標(biāo)記是由于在不同個(gè)體間，等位基因位點(diǎn)的DNA序列發(fā)生核苷酸片段的插入/缺失產(chǎn)生的多態(tài)性變異[10-11]，具有分布廣、全基因組密度高、等位變異數(shù)量少等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)某個(gè)標(biāo)記的插入/缺失片段長(zhǎng)度達(dá)到一定閾值后，其等位變異差異即可以通過(guò)PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳分辨，從而開發(fā)成穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)便的分子標(biāo)記。

為鑒定黃淮海地區(qū)各育種單位育成品系的農(nóng)藝性狀、增產(chǎn)潛力以及適應(yīng)區(qū)域[12]，自2010年以來(lái)，黃淮海大豆育種協(xié)作網(wǎng)對(duì)有關(guān)育種單位選育出的新品系在西北春大豆區(qū)、黃淮夏大豆區(qū)覆蓋的10個(gè)省市開展了聯(lián)合多點(diǎn)鑒定，共有1 380份品種(含對(duì)照)參加聯(lián)合試驗(yàn)。多點(diǎn)鑒定試驗(yàn)報(bào)告已經(jīng)成為推薦參加黃淮海地區(qū)各省級(jí)區(qū)試和國(guó)家區(qū)試主要的試驗(yàn)依據(jù)。

本研究旨在開發(fā)在基因組中均勻分布、擴(kuò)增效果好、插入/缺失片段大、可用于大豆品種指紋圖譜構(gòu)建、操作簡(jiǎn)便的插入/缺失標(biāo)記，并利用所開發(fā)的標(biāo)記，構(gòu)建2018年黃淮海聯(lián)合鑒定的96份大豆參試材料的指紋圖譜，進(jìn)行遺傳多樣性分析，為大豆種質(zhì)資源評(píng)價(jià)利用和品種純度鑒定等提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 用于開發(fā)InDel標(biāo)記的試驗(yàn)材料 用于開發(fā)InDel標(biāo)記的材料包括：一年生野生大豆ZYD02738，美國(guó)引進(jìn)品種Hobbit，我國(guó)東北地區(qū)育成品種綏農(nóng)14、吉育101，黃淮海地區(qū)育成品種(系)冀豆17、冀豆12、冀HJ117、中黃13、中黃42、齊黃34、鄭196、徐豆16。

1.1.2 用于遺傳多樣性分析的鑒評(píng)材料 從2018年大豆黃淮海多點(diǎn)聯(lián)合鑒定試驗(yàn)材料中，按照選育單位來(lái)源，選取96份材料，構(gòu)建指紋圖譜并進(jìn)行遺傳多樣性分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 按照康為世紀(jì)Nuclear Plant Genomic DNA Kit 新型植物基因組DNA提取試劑盒提取參試大豆材料的DNA。收集提取的DNA溶液后，用Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)樣品DNA濃度和質(zhì)量(OD260/OD280≈1.8)，將檢測(cè)合格的DNA樣品濃度調(diào)至20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大豆基因組重測(cè)序 提取植物材料DNA利用超聲波將質(zhì)檢合格的植物材料DNA片段化，然后將片段化的DNA進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、鏈接測(cè)序接頭，用瓊脂糖凝膠電泳選擇片段長(zhǎng)度大小，PCR擴(kuò)增建立測(cè)序文庫(kù)，用Illumina HiSeqTM2500對(duì)質(zhì)檢合格的文庫(kù)進(jìn)行10倍深度重測(cè)序。對(duì)測(cè)序得到的原始reads進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，過(guò)濾得到Clean reads，用于后續(xù)的基因組序列拼裝[13-14]。重測(cè)序由北京諾禾致源科技有限公司完成。

1.2.3 InDel位點(diǎn)挑選與引物設(shè)計(jì) 將12份材料重測(cè)序結(jié)果與參考基因組序列(Glyma.Wm82.a2v1)進(jìn)行對(duì)比，使用GATK軟件[15]，挖掘大豆基因組中的InDel標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，挑選長(zhǎng)片段插入/缺失位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，選擇標(biāo)準(zhǔn)為：在大豆每條染色體選擇均勻分布的位點(diǎn)；插入/缺失片段長(zhǎng)度≥20 bp；每個(gè)位點(diǎn)有且只有2個(gè)等位變異；多態(tài)性信息含量大于0.25。利用BioXM 2.6[16]設(shè)計(jì)引物，由金唯智公司合成。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系與引物篩選 PCR擴(kuò)增采用康為世紀(jì)公司的2×EsTaqMasterMix(Dye)，20 μL PCR反應(yīng)體系為：DNA(20 ng/μL)1 μL，2×EsTaqMasterMix 10 μL，上游、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL，將各組分充分混勻后，置于PCR儀中，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。120 V電泳35 min，凝膠成像儀下觀察。能夠擴(kuò)增出條帶穩(wěn)定、多態(tài)性高、且可用肉眼觀察插入/缺失類型條帶的引物可作為分子標(biāo)記加以應(yīng)用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 InDel位點(diǎn)檢測(cè)注釋與分析 使用SnpEff軟件[17]對(duì)InDel進(jìn)行注釋，統(tǒng)計(jì)分析基因間隔區(qū)、外顯子、內(nèi)含子等區(qū)域內(nèi)分布的InDel標(biāo)記的數(shù)量。

1.3.2 遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算 利用Popgene 32[18]軟件對(duì)引物在供試材料的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算每對(duì)引物的遺傳多樣性指數(shù)。

期望雜合度(Expected heterozygous number)[19]：即基因多樣性He=1-∑Pi2，其中，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的期望雜合度，取平均值代表該群體的期望雜合度；

Nei指數(shù)(Nei diversity index)[19]：Nei=nHe/(n-1)，其中，n為樣品數(shù)，He為期望雜合度；

香農(nóng)指數(shù)(Shnnon wiener index)[19]：SHI=-∑(Pi×lnPi)，其中Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，分別計(jì)算獲得各位點(diǎn)的SHI，取平均值代表該群體的SHI；

多態(tài)性信息含量(Polymorphysm information content，PIC)[19]：

其中Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

1.3.3 Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用基于貝葉斯法的Structure 2.3.4軟件[20]對(duì)96份材料進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。步驟如下：①利用Excel整理電泳結(jié)果，變異類型為插入的位點(diǎn)記為1，變異類型為缺失的位點(diǎn)記為0，未檢測(cè)到變異類型的位點(diǎn)記為9，將Excel轉(zhuǎn)換為Structure支持的格式。②確定最佳群體組群K值。軟件K值范圍設(shè)置在2～7，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為2，每個(gè)參數(shù)運(yùn)行10次，每次運(yùn)行的Burnin time和重復(fù)次數(shù)都設(shè)置為80 000。依據(jù)后驗(yàn)概率值LnP(D)確定分組K值，當(dāng)LnP(D)值最小時(shí)的K值即確定為最佳K值。

1.3.4 指紋圖譜構(gòu)建 根據(jù)每個(gè)InDel標(biāo)記對(duì)試驗(yàn)材料檢測(cè)出等位變異的類型及有無(wú)構(gòu)建指紋圖譜，變異類型為插入的位點(diǎn)記為1，變異類型為缺失的位點(diǎn)記為0，未檢測(cè)到變異類型的位點(diǎn)記為9，品種(系)純度計(jì)算公式：P=(S1-S2)/S1×100%，其中，S1為檢測(cè)InDel位點(diǎn)數(shù)，S2為雜合位點(diǎn)數(shù)[2，21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 插入/缺失片段分布特征

參試材料全基因組重測(cè)序結(jié)果顯示，正確識(shí)別率大于Q20(99.9%)的堿基占比平均值為97.50%，正確識(shí)別率大于Q30(99.9%)的堿基占比平均值為93.48%，基因組GC含量平均值為36.23%，樣品平均重測(cè)序覆蓋率為98.70%，平均測(cè)序深度18.73X。

檢測(cè)到SNP、InDel共2種主要變異類型。其中，檢測(cè)到插入/缺失片段長(zhǎng)度大于20 bp(包括20 bp)的InDel標(biāo)記的數(shù)量為66 561，平均每條染色體的InDel標(biāo)記的數(shù)量為3 262，其中第18號(hào)染色體分布的InDel標(biāo)記最多，數(shù)量為4 521，第12號(hào)染色體分布的InDel最少，數(shù)量為2 019。各品種InDell數(shù)量不同(圖1)，野生大豆基因組內(nèi)分布的InDel多，大豆品種Hobbit染色體內(nèi)分布的InDel較少。

A—L.冀豆17、冀豆12、綏農(nóng)14、中黃13、冀HJ117、Hobbit、吉育101、齊黃34、徐豆16、ZYD2738、鄭196、中黃42。A—L.Jidou 17，Jidou 12，Suinong 14，Zhonghuang 13，JiHJ117，Hobbit，Jiyu 101，Qihuang 34，Xudou 16，ZYD2738，Zheng 196，Zhonghuang 42.

如表1所示，檢測(cè)到的66 561個(gè)InDel標(biāo)記主要位于基因間隔區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、外顯子區(qū)、5′-UTR、3′-UTR、基因上游序列和下游序列。位于基因上游序列和下游序列的InDel數(shù)量分別為17 190個(gè)(25.83%)和13 602個(gè)(20.44%)，位于基因間隔區(qū)的InDel數(shù)量為22 893個(gè)(34.39%)，位于外顯子的InDel數(shù)量為125個(gè)(0.19%)，位于內(nèi)含子的InDel數(shù)量為8 222個(gè)(12.35%),位于3′-UTR和5′-UTR的InDel數(shù)量分別為1 004(1.51%)，617個(gè)(0.93%)。

表1 插入/缺失在基因組的分布Tab.1 Distribution of InDel in the genome

檢測(cè)到的66 561個(gè)InDel標(biāo)記中，可鑒定長(zhǎng)度的InDel有65 229個(gè)。片段長(zhǎng)度大小介于20～40 bp的InDel數(shù)量為42 453個(gè)，介于41～60 bp的InDel數(shù)量為13 044個(gè)，介于61～80 bp的InDel數(shù)量為5 034個(gè)，介于81～100 bp的InDel數(shù)量為2 285個(gè)，大于100 bp的InDel數(shù)量為2 413個(gè)(圖2)。

圖2 插入/缺失片段的長(zhǎng)度分布特征Fig.2 Length distribution characteristics ofinsertion/deletion fragments

分析66 561個(gè)InDel標(biāo)記在12份重測(cè)序材料中的PIC指數(shù)、Nei多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)可得，PIC指數(shù)為0.067～0.375，Nei多樣性指數(shù)標(biāo)記數(shù)量為0.710～0.667，香農(nóng)指數(shù)在0.154～0.693(圖3)。其中，PIC指數(shù)集中分布在0.100～0.200，0.300～0.400，所占比例分別為35.58%，33.01%；Nei多樣性指數(shù)集中分布在0.100～0.200，所占比例為33.56%；香農(nóng)指數(shù)集中分布在0.200～0.300，0.600～0.700，所占比例分別為29.30%，24.09%。

圖3 InDel標(biāo)記的PIC指數(shù)、Nei多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)分布特征Fig.3 PIC，Nei diversity index，Shannon Wiener index′s distribution characteristics of InDel marker

2.2 長(zhǎng)片段InDel標(biāo)記開發(fā)

共設(shè)計(jì)160對(duì)InDel標(biāo)記引物，在55 ℃的退火溫度下，109對(duì)引物擴(kuò)增效果穩(wěn)定、條帶清晰。其中，32對(duì)引物的擴(kuò)增條帶經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，肉眼可分辨片段插入/缺失類型(表2、圖4)。

表2 32對(duì)插入/缺失標(biāo)記引物信息Tab.2 Primer information of 32 insertion/deletion markers

2.3 InDel標(biāo)記應(yīng)用

利用 Popgene 32 軟件對(duì)32對(duì)引物在96份大豆材料中的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，每對(duì)引物的Nei指數(shù)分布在0.148 6～0.499 9，均值為0.393 5；香農(nóng)指數(shù)分布在0.280 7～0.693 1，均值為0.577 9；PIC指數(shù)分布在0.152 8～0.595 3，均值為0.396 3，表明InDel標(biāo)記在96份大豆材料中能較好地反映出其豐富的遺傳多樣性信息。

用InDel標(biāo)記對(duì)參試材料構(gòu)建指紋圖譜時(shí)，將檢測(cè)出變異類型為插入的位點(diǎn)記為1，變異類型為缺失的記為0，未檢測(cè)到變異類型的位點(diǎn)記為9(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用32對(duì)引物可將96份材料區(qū)分開，參試的大豆材料純度為96.84%，每份材料有唯一的指紋代碼，且沒(méi)有同物異名現(xiàn)象發(fā)生，因此，證明基于InDel標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜可以用于品種的鑒定。

表3 96份黃淮海多點(diǎn)鑒定試驗(yàn)材料指紋圖譜Tab.3 Fingerprint of 96 Huanghuaihai test materials

表3(續(xù))

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，當(dāng)K=5時(shí)，ΔK達(dá)到最大值。當(dāng)K=5時(shí)擬合結(jié)果中的bar plot繪制大豆各品種所占比例。從圖5可以看出，Structure軟件將96份大豆材料分成了五大類群，分別用5種顏色表示，柱狀圖的高度描述的是不同品種被分到五類群所占比例。

圖5 96份大豆種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.5 The genetic structure of 96 soybean germplasms

3 結(jié)論與討論

本研究中，InDel標(biāo)記在基因組中的分布，呈現(xiàn)出兩端分布密度高，靠近著絲粒區(qū)域分布密度低的趨勢(shì)。并且，基因內(nèi)無(wú)轉(zhuǎn)錄信息區(qū)域分布的InDel標(biāo)記最多(34.39%)，基因上、下游序列分布的InDel次之(分別為25.83%，20.44%)，基因片段內(nèi)分布的InDel最少(0.19%)。究其原因，如果InDel分布在基因CDS區(qū)內(nèi)，核苷酸片段的插入/缺失可能會(huì)導(dǎo)致基因功能的喪失，進(jìn)而影響生物體正常生命活動(dòng)，導(dǎo)致該InDel標(biāo)記不能在物種內(nèi)穩(wěn)定存在；反之，如果InDel發(fā)生在無(wú)轉(zhuǎn)錄信息的區(qū)域，則該InDel標(biāo)記在物種中保留下來(lái)的機(jī)會(huì)將大大提高。

InDel標(biāo)記具有特異性高、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)，因此，InDel標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源的遺傳多樣性及種質(zhì)資源鑒定具有廣闊的研究前景[22]，在大豆[23]、水稻[24]、玉米[25]等作物中應(yīng)用較多。本研究所開發(fā)的長(zhǎng)片段插入/缺失標(biāo)記具有2個(gè)突出特點(diǎn)：一是在種質(zhì)資源里，每個(gè)位點(diǎn)有且僅有2個(gè)等位變異，因此，檢測(cè)結(jié)果易于讀取，不同批次試驗(yàn)結(jié)果也易于比較。而目前國(guó)家區(qū)域試驗(yàn)品種純度分析采用30對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)[2]，大豆中平均每個(gè)SSR位點(diǎn)等位變異在6個(gè)左右，增加了數(shù)據(jù)讀取的難度。二是插入/缺失片段長(zhǎng)(大于40 bp)，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。前人[26]開發(fā)的插入/缺失標(biāo)記，沒(méi)有專門關(guān)注片段長(zhǎng)度問(wèn)題，大多數(shù)是介于1～5 bp，需要通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，操作繁瑣、不便于檢測(cè)。本研究開發(fā)的標(biāo)記，可用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)標(biāo)記的有效性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)手段方便快捷，結(jié)果便于觀察分析，可靠性高。利用本研究開發(fā)的InDel標(biāo)記，構(gòu)建了2018年黃淮海大豆多點(diǎn)鑒定參試品系DNA指紋圖譜，參試的大豆材料純度為96.84%，沒(méi)有同物異名現(xiàn)象發(fā)生，進(jìn)一步證實(shí)了所開發(fā)標(biāo)記的可靠性和簡(jiǎn)便性。

本研究以全基因組重測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)12份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行重測(cè)序，建立了數(shù)據(jù)豐富、準(zhǔn)確性高的測(cè)序文庫(kù)。比對(duì)大豆參考基因組序列，設(shè)計(jì)開發(fā)基于電泳檢測(cè)技術(shù)可清晰分辨的長(zhǎng)片段插入/缺失InDel標(biāo)記，可以對(duì)大豆種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，具有良好的應(yīng)用前景。