徐秀珍，曾運航，田永強，周建飛，李霞，石碧,＊

（1. 四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程實驗室，四川 成都 610065；2. 四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065）

前言

由于受屠宰場與制革企業(yè)之間的距離限制，鮮皮在進(jìn)入制革工廠加工前，通常需要進(jìn)行防腐處理，以保證其在運輸及保存過程中不會腐爛[1]。原皮的保藏方法通常包括NaCl 腌制法[2]、KCl 腌制法[3]、季銨鹽腌制法[4]、真空保藏法[5]、低溫冷凍保存法[6]等。在這些方法中，NaCl 腌制法因具有操作簡便、成本低廉、抑菌效果優(yōu)異等特點，是目前應(yīng)用最廣泛的保藏方法。高濃度的NaCl 能使鮮皮脫水，使細(xì)菌在鮮皮中難以存活，同時抑制蛋白酶對皮的水解活性[7]。然而，某些耐鹽菌和嗜鹽菌可以在高鹽環(huán)境中生存[8-11]，并在NaCl 腌制過程中損傷原皮[12-14]。鹽腌皮表面上出現(xiàn)的紅色菌斑，即通常所說的“紅熱”，就是嗜鹽細(xì)菌造成的一種典型損傷[15]。

大量研究表明，鹽腌皮中存在具有水解蛋白質(zhì)和脂質(zhì)能力的耐鹽菌及嗜鹽菌[16-18]。Birbir 等[19]從用于腌制鮮皮的鹽礦中分離出了56 株極端嗜鹽菌。Caglayan 等[20]在鹽腌皮上也發(fā)現(xiàn)了大量嗜鹽細(xì)菌。研究鹽腌皮上細(xì)菌群落的生長、變化和演替等信息，對提高鹽腌皮的質(zhì)量、探索少鹽甚至無鹽原料皮保藏技術(shù)至關(guān)重要。但是有關(guān)鹽腌皮上細(xì)菌的大多數(shù)基本生物學(xué)信息，例如物種組成、豐度、種群結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測和系統(tǒng)進(jìn)化等尚不明確。

高通量測序已成為生物學(xué)研究中非常重要的工具[21]，因為它不需要分離純化微生物，可直接對混合微生物中提取的DNA 開展生物信息學(xué)分析，所以常用于篩選腫瘤的基因突變[22]，預(yù)測遺傳病風(fēng)險[23]，選育高產(chǎn)農(nóng)作物[24]，以及分析特定環(huán)境的微生物[25]。本文采用高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)工具，研究了鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌的種類、豐度和功能預(yù)測，以期為更好地設(shè)計NaCl 腌制方法提供生物學(xué)依據(jù)，也為有針對性地開發(fā)更環(huán)保的原皮保藏方法提供指導(dǎo)。

1 實驗部分

1.1 主要材料和試劑

鮮牛皮，成都市青羊區(qū)世紀(jì)皮草部；氯化鈉，工業(yè)級（≥99.1%），順城鹽品股份有限公司；DNA 提取試劑盒（型號D3142）及PCR 擴(kuò)增試劑盒，廣州美吉生物科技有限公司。

1.2 鮮皮的腌制

分別用0%，10.8%，21.6%和43.2% NaCl（以鮮皮的質(zhì)量計），在轉(zhuǎn)鼓中腌制四張去肉后的鮮牛皮，液比0.5，轉(zhuǎn)60 min，停30 min，重復(fù)3 次。取出牛皮置于陰涼通風(fēng)處。在保存0、1、3 和5 d 后，在牛皮上采樣分析皮中的NaCl 含量、皮的表面形態(tài)、組織學(xué)特征以及細(xì)菌信息學(xué)。由于本實驗的樣品量遠(yuǎn)少于工廠的實際生產(chǎn)量，皮在存放過程中受到環(huán)境的影響大，更易觀察到腐敗情況，因此在1、3、5 d 取樣分析。

1.3 皮中NaCl 含量的測定

用Volhard 法測定皮中的NaCl 含量[26-27]。將約1 g 絕干皮樣放入250 mL 的碘量瓶中，加入105 mL硝酸溶液（10%），密封，靜置24h。24h后，將未消解完全的樣品加熱煮沸，直至皮樣完全消解。將50 mL 消解液與50 mL 硝酸銀溶液（0.1 mol/L）混合，并煮沸至沉淀絮凝、上清液澄清。冷卻后，依次向上述混合物中加入10 mL 苯甲醇和1 mL 鐵銨明礬指示劑。用0.1 mol/L 硫氰酸銨溶液滴定混合物，至出現(xiàn)磚紅色沉淀。按照公式（1）計算鮮皮的NaCl 含量：

CNaCl——皮樣中NaCl 的含量，g/g；

V1——硝酸銀溶液的體積，L；

c1——硝酸銀的濃度，mol/L；

V2——硫氰酸銨的體積，L；

c2——硫氰酸銨的濃度，mol/L；

m——絕干皮樣的質(zhì)量，g。

1.4 組織學(xué)觀察

將1 cm ×1 cm 的皮樣置于10 中性甲醛溶液中固定48 h。自來水流水沖洗后，用冷凍切片機（CM1950，徠卡，德國）切取厚度為15 μm 的縱切面切片。在室溫下干燥24 h 后，將切片用蘇木素和伊紅染色（HE 染色）[29]。用生物顯微鏡（DMi8，徠卡，德國）觀察染色的切片，以鑒定牛皮上表皮、毛囊和膠原纖維的完整性。

1.5 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

首先用800 mL 無菌蒸餾水洗滌10 cm × 10 cm 的皮樣。用無菌紗布過濾洗滌后的水以除去牛毛等雜質(zhì)，之后將濾液靜置10 min。取40 mL 下層菌懸液以10 000 r/min 離心10 min 以得到菌體。用DNA 提取試劑盒提取菌體的DNA。采用PCR 法擴(kuò)增16S rDNA 的V3-V4 區(qū)段序列[29]。PCR 總體積50 μL，其中包含5 μL 的dNTP 溶液（2 mmol/L），3 μL的MgSO4溶液（25 mmol/L），5 μL 的10×KOD 緩沖液，1 μL 的KOD 聚合酶，1.5 μL 的341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'） 引物，1.5 μL 的806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTA-AT-3'）引物，以及100 ng 模板DNA[29]。PCR 擴(kuò)增及測序工作由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.6 測序數(shù)據(jù)分析

首先對擴(kuò)增得到的16S rDNA 序列進(jìn)行篩選，然后用FLASH 軟件對V3-V4 區(qū)段序列進(jìn)行拼接，去除引物后進(jìn)行低質(zhì)量過濾。接著用USEARCH 軟件進(jìn)行聚類并去除嵌合體以后獲得有效序列，再用UPARSE 算法將有效序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs）[29]。通過聚類操作，對相似度大于97%的所有序列進(jìn)行OTU 劃分。最后，用QIIME 軟件計算樣品的Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)[31]。

在核糖體數(shù)據(jù)庫項目（RDP）中，基于SILAB[32]、Greengene[33]、UNITE[34]和ITS2[35]等數(shù)據(jù)庫，采用樸素貝葉斯模型將代表性序列歸類到細(xì)菌菌屬[36]。置信度閾值范圍為0.81。接著進(jìn)行可視化豐度統(tǒng)計，細(xì)菌分類學(xué)鑒定，繪制物種豐富度熱圖。最后，用Tax4Fun 和PICRUSt 進(jìn)行KEGG 代謝功能預(yù)測[37]，用FAPROTAX 數(shù)據(jù)庫及相關(guān)軟件分析細(xì)菌的生態(tài)功能[38]。采用Welch’s t 檢驗、Wilcoxon 秩次檢驗、Kruskal-Wallis H 檢驗和Tukey’s HSD 法計算組間函數(shù)差異[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 皮中氯化鈉含量對防腐效果的影響

本研究的目的之一是分析鹽腌皮上細(xì)菌群落的變化。因此，我們首先用不同用量的NaCl 腌制鮮皮，得到NaCl 含量不同的皮樣。如圖1 所示，鹽腌皮中的NaCl 含量隨著腌制時NaCl 用量的增加而增加。未經(jīng)NaCl 腌制的皮中NaCl 含量約2.2%，這些NaCl 可能來自鮮皮中的含氯物質(zhì)。用10.8%、21.6%和43.2% NaCl 腌制的皮中分別含有7.5%、9.1%和17.8%的NaCl（此處NaCl 含量為保存1、3、5d 皮樣中NaCl 含量的平均值）。隨著保存時間的延長，用21.6%和43.2%NaCl 腌制的皮中NaCl 的含量略有下降，這應(yīng)該是因為隨著皮中水分的蒸發(fā)，部分NaCl 形成結(jié)晶并從皮上掉落。

圖1 不同用量NaCl 腌制皮中的NaCl 含量

鹽腌皮的表面形態(tài)和組織學(xué)特征可以反映其變質(zhì)情況。由圖2 和圖3 可知，在不用NaCl 腌制的情況下，鮮皮保存1 d 后，表皮和毛囊就開始脫落，3 d 內(nèi)就被蛆（圖中的白色斑點）和細(xì)菌嚴(yán)重破壞，5 d后被大量分解。當(dāng)用10.8%NaCl 腌制時，保存3 d后，在皮面也觀察到一些蛆，皮的表皮層出現(xiàn)較大程度的分離。當(dāng)NaCl 用量增至21.6%和43.2%時，皮的表皮、毛囊、膠原纖維等在保存五天后均完好無損。上述結(jié)果表明蛆和細(xì)菌的生長與皮中的NaCl含量密切相關(guān)，增加腌制時NaCl 的用量有助于鮮皮的防腐。

圖2 不同用量NaCl 腌制皮樣的表面形貌

圖3 不同用量NaCl 腌制皮樣的縱截面的HE 染色圖（標(biāo)尺500 μm）

2.2 16S rDNA 基因分析概述

對來自工業(yè)級NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌的16S rDNA 基因進(jìn)行分析，以更好地識別鹽腌皮上的細(xì)菌種類及來源。圖4a 和4b 分別給出來自NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌的Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)。每組的Shannon 指數(shù)稀釋曲線最終趨于水平，表明測序深度足夠（圖4a）。在所有樣品中，NaCl 中細(xì)菌的Chao1 指數(shù)最低，說明NaCl 中細(xì)菌的豐度明顯低于皮樣上的細(xì)菌豐度（圖4b）。鮮皮上細(xì)菌的Chao1 指數(shù)高達(dá)2300，這表明鮮皮上的細(xì)菌種類多，有效抑制細(xì)菌是鮮皮良好防腐所必需的。未經(jīng)NaCl 腌制的皮樣上細(xì)菌的Chao1 指數(shù)隨著時間的延長明顯下降，這主要是因為蛆和細(xì)菌迅速消耗了鮮皮中的營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)和脂質(zhì)），而且可能含有蛋白水解活性的細(xì)菌快速生長成為優(yōu)勢物種，抑制了其他細(xì)菌的生長，因此細(xì)菌多樣性下降，這說明NaCl 具有一定的抑菌作用。10.8%和21.6%NaCl 腌制的皮樣上細(xì)菌的Chao1 指數(shù)隨著保存時間的增加波動較小，說明細(xì)菌豐度較為穩(wěn)定。保存三天后，43.2% NaCl 腌制的皮樣上細(xì)菌的Chao1 指數(shù)增至2557，遠(yuǎn)高于保存一天的樣品。產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是，高鹽環(huán)境雖然不利于大部分細(xì)菌的生長，但是激活了少量嗜鹽菌的生長，總體上細(xì)菌的Chao1 指數(shù)增加。

圖4 Alpha 多樣性分析（a）NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌的Shannon 指數(shù)。Dx-y%表示通過y% NaCl 腌制并保存x 天的皮樣。（b）NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌的Chao1 指數(shù)。Day 1、Day 3、和Day 5 代表鹽腌皮分別保存了1、3 和5 天。（b-1）保存一天后，除毛發(fā)外，鮮皮中大部分的蛋白質(zhì)和脂類被蛆和細(xì)菌消耗。（b-2）保存三天后，用43.2% NaCl腌制的皮在肉面出現(xiàn)了一些細(xì)菌菌落

圖5中的維恩圖分析展示了NaCl、鮮皮以及鹽腌皮中細(xì)菌種類之間的關(guān)系。用0%、10.8%、21.6%和43.2%NaCl 腌制的皮在保存一天后，皮上細(xì)菌的OTUs 數(shù)量分別為1704、1592、1354 和1127。NaCl和鮮皮之間的共有OTUs 數(shù)量均小于100，而鹽腌皮和鮮皮之間的共有OTUs 數(shù)量大于600。這些結(jié)果表明，鹽腌皮上的細(xì)菌與鮮皮上的細(xì)菌更接近，由此可見鹽腌皮上的細(xì)菌主要來自于鮮皮。

圖5 NaCl、鮮皮和鹽腌皮（保存一天）上細(xì)菌OTUs 的維恩圖維恩圖的重疊部分是相應(yīng)樣本的共有OTUs，非重疊部分代表樣品的特有OTUs

2.3 細(xì)菌的相對豐度

將所有的有效OTUs 與微生物的參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以獲取NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌在屬水平上的相應(yīng)分類信息。所有樣品中豐度均值排名前10 的菌屬如下：Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus、 Corynebacterium、 Acinetobacter、Wohlfahrtiimonas、 Jeotgalicoccus、 Comamonas 和Tissierella（圖6）。在NaCl 中，大量細(xì)菌是未知的或尚未進(jìn)行分類的。Vibrio 在鮮皮以及保存一天的未腌制和21.6%NaCl 腌制的皮上最豐富。在未腌制、10.8%NaCl 腌制和21.6%NaCl 腌制的皮上，Vibrio的豐度隨著保存時間的增加顯著降低；而在43.2%NaCl 腌制的皮中，Vibrio 的豐度在保存三天后有所增加。出現(xiàn)此結(jié)果的原因，一方面可能是保存一天的皮中其他菌屬（Other）占比過大，導(dǎo)致Vibrio 的相對豐度更低；另一方面可能是Vibrio 的生長需要Na+刺激[39]，43.2%NaCl 更有利于其生長，所以Vibrio 的相對豐度在保存三天的皮中增大。Staphylococcus 在大多數(shù)皮樣中都有出現(xiàn)，在10.8%NaCl 腌制并保存一天的皮中Staphylococcus 的相對豐度很高，這正是10.8%NaCl 腌制皮中Vibrio 的相對豐度較 低 的 原 因 。 Psychrobacter、Halomonas 和Corynebacterium 主要存在于鹽腌皮上，據(jù)報道Psychrobacter 和Halomonas 是嗜鹽菌[40-41]。Acinetobacter僅存在于NaCl 和43.2% NaCl 腌制的皮上，可見Acinetobacter 是嗜鹽菌，需要高鹽環(huán)境才能生存。上述結(jié)果表明，NaCl 腌制法不能有效抑制所有細(xì)菌，尤 其 Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus 和Corynebacterium 均難以被抑制。總體而言，NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌的種類存在顯著差異。鮮皮中的一些耐鹽菌可以在低含量的NaCl 中生長并使原皮腐爛，并且某些耐鹽細(xì)菌或嗜鹽細(xì)菌鹽腌皮上可能生長成為優(yōu)勢物種。這些結(jié)果同時證明了，NaCl 極大地改變了鮮皮上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖6 NaCl、鮮皮和鹽腌皮上豐度均值排名前10 的細(xì)菌（屬水平）的相對豐度Dx-y%表示通過y%NaCl 腌制并保存x 天的皮樣

2.4 細(xì)菌群落的功能預(yù)測

圖7是基于16S rDNA 序列，以Silva 數(shù)據(jù)庫為參考數(shù)據(jù)庫，用Tax4Fun 預(yù)測的細(xì)菌群落的功能。與細(xì)菌的生長密切相關(guān)的碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運、核苷酸代謝、翻譯以及復(fù)制和修復(fù)等，隨著NaCl用量的增加而降低。這表明NaCl 腌制是一種有效的保藏方法。上述基礎(chǔ)代謝的速率在10.8%NaCl 腌制并保存一天的皮樣中最高，說明此時細(xì)菌生長得最快。細(xì)菌的脂質(zhì)代謝、外源性物質(zhì)的降解與代謝、萜類和聚酮類化合物的代謝、其他次生代謝物的合成等次級代謝的速率，隨著保存時間的增加而增大，這可能是因為耐鹽菌或嗜鹽菌的次級代謝活性增強。這些結(jié)果證明了，NaCl 是通過抑制細(xì)菌的基礎(chǔ)代謝，而不是次級代謝，來達(dá)到其抑菌效果的。

圖7 NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌群落的功能預(yù)測Dx-y%表示通過y% NaCl 腌制并保存x 天的皮

2.5 環(huán)境因素分析

冗余分析是一種可以用線性模型直接反映細(xì)菌、樣品和環(huán)境因素之間相互關(guān)系的梯度分析技術(shù)。如圖8 所示，保存時間和NaCl 用量都會影響鹽腌皮中細(xì)菌的相對豐度。此外，RDA 分析可知，保存時間和NaCl 用量分別占環(huán)境因素的22.4%和9.3%，這表明保存時間對細(xì)菌豐度的影響更大。保存三天以上的皮樣上細(xì)菌豐度與保存時間呈正相關(guān)，這說明隨著保存時間的延長，皮樣上的細(xì)菌豐度增加。因此，即使是經(jīng)過NaCl 腌制處理的原皮，仍然不能保證不受細(xì)菌的侵蝕。Vibrio、Staphylococcus 和Wohlfahrtiimonas 的豐度與NaCl 用量呈負(fù)相關(guān)，而Halomonas、Corynebacterium 和Acinetobacter 的豐度與NaCl 用量呈正相關(guān)，這表明NaCl 可以有 效 抑 制 Vibrio、Staphylococcus 和 Wohlfahrtiimonas，而對Halomonas、Corynebacterium 和Acinetobacter 的抑制效果不足。因此，對鹽腌皮應(yīng)重點關(guān)注Halomonas、Corynebacterium 和Acinetobacter 的生長情況，且用針對性強的抑菌劑或殺菌劑進(jìn)一步處理鹽腌皮，應(yīng)該有助于提升原皮保藏的品質(zhì)。

圖8 環(huán)境因素分析NaCl、鮮皮和鹽腌皮上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與保存時間和NaCl 用量的冗余分析Dx-y%表示通過y%NaCl 腌制并保存x 天的皮樣

3 結(jié)論

鹽腌皮的保藏效果隨著NaCl 用量的增加而提高，但細(xì)菌分布表明也并非NaCl 用量越高越好，而是適量的NaCl 對鮮皮的腌制效果更好。NaCl 極大地改變了鮮皮上的細(xì)菌群落。工業(yè)級NaCl、鮮皮和鹽腌皮上豐度均值排名前10 的菌屬為：Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus、Corynebacterium、Acinetobacter、Wohlfahrtiimonas、Jeotgalicoccus、Comamonas 和Tissierella。鹽腌皮上的細(xì)菌主要來自鮮皮，除Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus 和Corynebacterium 外，大多數(shù)的細(xì)菌都能被NaCl 抑制。NaCl 具有抑菌活性的原因是它可以抑制鮮皮上細(xì)菌的基礎(chǔ)代謝。但是，在鹽腌皮上存在一些很難被抑制的嗜鹽菌和耐鹽菌，如Psychrobacter 和Halomonas。與NaCl 的用量相比，保存時間對鮮皮上細(xì)菌豐度的影響更大。綜上所述，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ种汽}腌皮上的嗜鹽菌和耐鹽菌并縮短鹽腌皮的保存時間是提高鹽腌皮質(zhì)量的關(guān)鍵。