龍林競,劉麗玉,曲紅光,黃建偉

(廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院消化內科，廣東 廣州 510799)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種慢性自身免疫性膽汁淤積性肝病,以肝內小膽管周圍單核細胞浸潤及肉芽腫形成的慢性非化膿性破壞性膽管炎為主要病理特征，并隨著疾病進展發(fā)展為肝硬化[1]。PBC的病因和發(fā)病機制是多因素且尚未完全闡明的，但在 90%～95% 的 PBC 患者中檢測到抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody，AMA)[2,3]。由于AMA對PBC的高度敏感性及特異性，使其作為PBC主要的診斷條件之一；肝活檢并非診斷時所必須的檢查，但對于非典型病例及預測患者長期預后有著重要作用[4]。目前，熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)仍是PBC的一線治療，其療效和安全性均較為良好[1]。臨床上，約 70% 低風險、非進展性的PBC患者對UDCA治療有反應，而其余 30% 患者則為高風險且對 UDCA 無反應，并最終發(fā)展為膽汁性肝硬化[5]。然而，對于此類高風險PBC患者的治療仍具有挑戰(zhàn)，并且其發(fā)生及發(fā)展的具體機制尚不清楚。

近年來，許多研究基于全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)深入探討PBC的發(fā)病機制，并發(fā)現(xiàn)一些PBC易感的相關位點，其中白細胞抗原(leucocyte antigen，HLA)-DRB1、HLA-dqa1和HLA-dqb1基因位點與PBC易感性關聯(lián)最強[6]。此外，免疫反應在PBC發(fā)病機制中起著核心作用。抗原呈遞和白介素(interleukin，IL)-12產生(IRF5、SOCS1、TNFAIP3、NF-B 和 IL-12A)、T 細胞活化和干擾素-γ途徑(TNFSF15、IL12R、TYK2、STAT4、SOCS1、NF-κB 和 TNFAIP3)以及 B 細胞活化和免疫球蛋白的產生(POU2AF1、SPIB、PRKCB、IKZF3 和 ARID3A)在PBC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[4]。因此，目前也有使用JAK1/2抑制劑、CD20單抗和CTLA-4融合蛋白等生物制劑治療高危PBC的臨床研究，但效果仍然不理想，表明現(xiàn)階段對PBC的免疫分子機制研究尚不明確[7-9]。因此，仍須積極探索高危PBC患者發(fā)病的分子機制及治療相關的分子靶點。

本研究使用生物信息學分析公共數(shù)據(jù)庫中高危PBC患者肝臟基因測序數(shù)據(jù)，以期尋找高危PBC潛在的生物治療靶點。

1 材料和方法

1.1 資料源、檢索策略和選擇標準

采用主題詞與自由詞相結合的方式進行檢索，以“primary biliary cholangitis”、“PBC”、“cholangitis”、“homo sapiens”為檢索關鍵詞，從Gene Expression Omnibus基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載基因表達文件。納入標準：①出版日期從建庫至2022年；②被診斷為PBC患者；③包含需要行肝移植患者；④包含健康對照組；⑤病例數(shù)>3例。排除標準：①數(shù)據(jù)不完全；②動物和細胞實驗。

1.2 數(shù)據(jù)下載及差異分析

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載基因表達矩陣文件(GSE79850[10])。該研究對PBC患者隨訪至少15年，并定義低風險患者標準為：①對UDCA治療完全應答并至少保持15年；②不需要肝移植；高危險患者標準為：①UDCA治療一年后(劑量為13～15 mg/kg)無反應；②在隨訪中，由于PBC的疾病進展需要肝移植。該數(shù)據(jù)集包含了8例健康人群肝臟樣本(control，CNTL)，7例低風險(low risk，LR)及9例高風險(high risk，HR)PBC患者肝臟樣本，并檢測了784個免疫相關基因。使用R包“l(fā)imma”進行差異分析，當差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C)>1.5且P<0.05時，定義為基因表達上調；當FC<0.67且P<0.05時，定義為基因表達下調[11]。利用R包“ggplot2“繪制火山圖，應用在線工具”jvenn“(http:∥jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)繪制韋恩圖以尋找二者交集差異基因。

1.3 富集分析

GO是基于已定義的特征提供基因功能的綜合信息，主要分為3個部分:分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞成分(cellular component，CC)[12]。為了分析差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)的功能，使用R包“Clusterprofiler”[13]和“org.HS.eg.db”對交集DEGs進行基因本體論(gene ontology，GO)分析。定義調整后P值<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 加權基因共表達網絡分析

加權基因共表達網絡分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)探討了轉錄組構成的概述以及外部生物性狀與基因組之間的關系[14]。使用R包“WGCNA”對所有基因進行WGCNA分析。根據(jù)無標度拓撲準則選擇β=6進行網絡構建，采用動態(tài)樹切割算法(dynamic tree cut algorithm)進行模塊識別，模塊基因數(shù)的最小值為50，并將相似模塊合并(截斷高度0.35)。在模塊-性狀分析中，以|基因-性狀顯著性(gene-trait significance，GS)值|> 0.5和|模塊隸屬度(module membership，MM)值|> 0.55為閾值。

1.5 蛋白質相互作用分析

為了研究高危PBC特有的DEGs的相互作用關系及探索其關鍵基因，利用String數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)對高危PBC特有的DEGs構建蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡。將所獲得的網絡導入Cytoscape軟件(v3.8.2)，刪除沒有形成閉環(huán)的通路，并使用CytoHubba插件中的復雜分子檢測法(molecular complex detection，MCC)尋找關鍵基因。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用R語言軟件(v4.1.3)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 高危PBC患者DEGs鑒定

對所下載的基因表達矩陣進行標準化后行差異分析。與CNTL組相比，LR組中鑒定出103個上調DEGs及110個下調DEGs(圖1A)，HR組中鑒定出168個上調DEGs及158個下調DEGs(圖1B)；與LR組相比，HR組則鑒定出99個上調DEGs及106個下調DEGs(圖1C)。進一步使用韋恩圖探索高危PBC患者特有DEGs(與CNTL和LR相比均顯著變化)，共鑒定出44個上調(圖1D)及54個下調DEGs為高危PBC患者所特有的DEGs(圖1E)。以上結果表明，高危PBC患者特有的DEGs可能是導致患者對UDCA治療無效或疾病進展的主要原因。

注：火山圖展示了LR vs CNTL(A)、HR vs CNTL(B)和HR vs LR(C)的差異分析結果；D.上調DEGs的交集情況；E.下調DEGs的交集情況

2.2 富集分析

為了探討上述高危PBC特有DEGs的免疫過程，我們主要對BP進行分析。結果顯示，上調特有DEGs的BP主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性調節(jié)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的調節(jié)、白細胞增殖、B細胞活化及T細胞活化(圖2A)；而下調DEGs的BP主要在補體激活、體液免疫調節(jié)、免疫球蛋白調節(jié)免疫反應、B細胞調節(jié)免疫及對IL-1反應中富集(圖2B)。以上結果表明，高危PBC中多種免疫途徑均存在異常應答。

注：A：高危PBC中上調特有DEGs的GO分析；B：高危PBC中下調特有DEGs的GO分析

2.3 WGCNA識別高危PBC性狀模塊

為了探索與高危PBC最為相關的基因模塊，我們對所有基因進行了WGCNA分析。我們選擇了β=6(scale-free R2=0.85)作為軟閾值構建無標度拓撲網絡(圖3A)，并且通過聚類及動態(tài)混合切割識別了5個模塊(圖3B)。其中，turquoise模塊與高風險PBC負相關程度最高(R=-0.76，P=2e-5)，表明該模塊中的基因可能在高危PBC患者中發(fā)揮重要作用(圖3C)。挑選該模塊中|GS|>0.5和|MM|>0.55的基因并與高危PBC特有DEGs取交集，分別鑒定出29個上調和50個下調特有DEGs(圖3D)。以上結果表明，上述基因與高危PBC的發(fā)生發(fā)展最為相關。

注：A：使用不同軟閾值冪次的無標度擬合指標，確定β=6(scale-free R2=0.85)即可建立滿意的無標度拓撲網絡；B：利用動態(tài)樹切割算法對樹形圖進行聚類，基因可被分為5類群；C：熱圖分析模塊特征基因與臨床特征之間的相關性，MEturquoise與HR患者最為負相關；D：turquoise模塊基因與高危PBC特有DEGs的交集情況

2.4 蛋白質相互作用網絡構建及鑒定關鍵基因

將WGCNA中分析得到的高危PBC特有DEGs構建PPI網絡及使用CytoHubba插件中的MCC算法探索其中的關鍵基因，上調DEGs構建的PPI網絡共有21個節(jié)點(node)，56條邊(edge)，平均每個節(jié)點的度(degree)為5.3(圖4A)；MCC結果顯示CD44、CD34、CTLA4、ITGA4、CD24、THY1、MAPK3、VEGFC、PDGFRB和ITGB4是上調DEGs中排名前10的關鍵基因(圖4B)，該網絡主要與T細胞活化及白細胞增殖相關。下調DEGs構建的PPI網絡共有31個節(jié)點，185條邊，平均每個節(jié)點的度為11.9(圖4C)；MCC結果顯示C3、C4B、CFP、MBL2、C1R、C1S、C5、C9、C8B和C6是下調DEGs中排名前10的關鍵基因(圖4D)，該網絡均與補體激活途徑相關。進一步對上述關鍵基因的表達、WGCNA及PPI中的表現(xiàn)加以總結(表1)，發(fā)現(xiàn)上述關鍵基因無論是在表達情況還是與高危PBC的相關性中均有十分顯著的差異及關聯(lián)。以上結果表明，T細胞活化、白細胞增殖及補體激活途徑可能是促進高危PBC患者對UDCA治療無效或疾病進展的關鍵所在，并且上述關鍵基因可能是潛在的治療靶點。

注：A：高危PBC中上調特有DEGs的PPI網絡；B：高危PBC上調特有DEGs中的關鍵基因,該網絡主要與T細胞活化及白細胞增殖相關。顏色由黃變紅表明蛋白質的MCC排名，紅色染色越深，蛋白質排名越靠前；C：高危PBC中下調特有DEGs的PPI網絡；D：高危PBC下調特有DEGs中的關鍵基因，該網絡均與補體激活途徑相關

表1 關鍵基因的表達情況、WGCNA和MCC中的表現(xiàn)

3 討 論

本研究通過分析高危PBC患者的免疫基因轉錄組，共鑒定出44個上調及54個下調DEGs為高危PBC患者所特有的DEGs(與CNTL和LR相比均顯著變化)。進一步通過GO分析發(fā)現(xiàn)高危PBC中多種免疫途徑存在異常應答，包括白細胞增殖、B細胞活化、T細胞活化和補體激活等途徑。隨后使用WGCNA及PPI網絡分別鑒定出上調和下調DEGs中排名前10的關鍵基因，這些關鍵基因與T細胞活化、白細胞增殖及補體激活途徑相關。

PBC是一種進行性的自身免疫性疾病，其發(fā)生發(fā)展過程涉及多種免疫途徑異常應答[15]。既往人和小鼠PBC模型研究均發(fā)現(xiàn)CD4+及CD8+T細胞在膽道損傷中具有關鍵作用[16-17]。因此，Bowlus等[8]開展了一項為期36周的CTLA-4融合蛋白(阿巴西普)治療UDCA不完全反應的PBC患者的開放標簽研究，盡管阿巴西普表現(xiàn)出良好的耐受性，但在改善臨床生化結果方面無效。本研究中，盡管高危PBC組DEGs提示T細胞活化，并且CTLA-4也被篩選為關鍵基因，但高危PBC患者上調基因中還存在MAPK通路和白細胞增殖通路的異常激活，表明單單針對T細胞活化是不夠的，這也解釋了單獨使用阿巴西普治療高危PBC可能效果不佳的可能原因。此外，PBC患者自身抗體可誘導膽管上皮表達CD44，并進一步募集記憶T細胞從而激活集體炎癥反應[18]。由于PBC患者中存在著自身抗體的異常表達，B 細胞可促進PBC的發(fā)展。研究報道稱，CD19+CD24hiCD38hiB細胞與PBC患者肝膽汁淤積正相關[19]。因此，有學者使用CD20單抗(利妥昔單抗)治療PBC患者，但CD20單抗對UDCA無效的PBC患者療效十分有限，其作用僅在對UDCA有效的PBC患者早期階段可改善堿性磷酸酶水平[20,21]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高危PBC患者其體液免疫及免疫球蛋白調節(jié)免疫途徑下調，表明高危PBC患者的肝臟免疫環(huán)境中B細胞可能并不是主要的效應細胞，但在疾病的早期階段充當著關鍵作用[22]。VEGFC和PDGFRB的表達均在PBC患者中顯著升高，并與PBC的發(fā)生和進展相關[23-24]。目前尚缺乏ITGB4、ITGA4、THY1和MAPK3在PBC中的研究，然而上述基因均與炎癥激活相關。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)高危PBC患者肝臟補體激活途徑未激活，多種補體mRNA水平顯著下調，然而對于補體在PBC中的作用研究十分缺乏。既往研究顯示，PBC患者血漿C3和C4水平升高，可能是由于肝臟炎癥的急性期反應[25]；而在肝硬化PBC患者中，血漿C3及C4水平下降可能反應了肝臟的蛋白質合成能力降低[26]；血清凝集素ficolin-1水平降低與PBC疾病進展相關[27]。以上結果表明，補體系統(tǒng)對于PBC的發(fā)生發(fā)展存在重要作用，但其具體機制尚未完全闡明。補體系統(tǒng)是先天免疫的一部分，過多或者缺乏補體成分均為導致自身免疫性疾病的發(fā)生，各種補體途徑均有助于凋亡碎片和免疫復合物清除以及調節(jié)T/B細胞的功能[28]。因此，靶向補體成分可能是PBC治療的選擇之一，但目前尚未有相關研究。

本研究通過更加細致地篩選高危PBC中的DEGs，發(fā)現(xiàn)了多個與高危PBC密切相關且尚未在PBC中報道的免疫相關基因，同時通過分子機制的角度解釋了當下生物制劑治療高危PBC療效不佳的潛在原因，并且提出靶向補體成分可能是PBC治療的選擇之一，這是本研究的優(yōu)勢所在。本研究主要缺陷為缺乏相關實驗的驗證，但通過本研究可為PBC未來的研究提供指引。

總而言之，通過生物信息學分析公共數(shù)據(jù)庫中高危PBC患者的肝臟免疫相關基因測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)高危PBC患者存在多種免疫途徑的異常應答，上述關鍵基因可能是潛在的治療靶點，靶向補體成分可能是PBC治療的選擇之一。