程婷婷，呂楠，陸超，萬凱，沈玥，董紀(jì)強(qiáng)，朱敏杰，羅敏娜，尚清*，高華方*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3. 鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院，鄭州 450000)

Joubert綜合征(Joubert syndrome，JBTS，OMIM#213300)是一種罕見的先天性小腦發(fā)育畸形疾病，于1969年由Joubert等[1]學(xué)者首次報(bào)道。患者的主要臨床表現(xiàn)有小腦蚓部發(fā)育不全或缺如、腦部磁共振影像(MRI)結(jié)果顯示“磨牙征”(molar tooth sign，MTS)、肌張力減低、發(fā)育遲緩/智力障礙、動眼神經(jīng)失用、呼吸節(jié)律異常等，并可累及腎臟、肝臟、視網(wǎng)膜等器官[2-5]。

JBTS是一種典型的單基因遺傳病，主要表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳模式[2，6]。目前，OMIM(online mendelian inheritance in man，https：//www. omim.org)數(shù)據(jù)庫收錄與JBTS表型關(guān)聯(lián)的致病基因共39個(gè)，這些已知基因的變異能解釋約94%患者的患病原因，其中CPLANE1(C5orf42)、CC2D2A、CEP290、AHI1、TMEM67等是突變頻率最高的JBTS致病基因[2，7-11]。ARMC9是JBTS的致病基因之一，其變異導(dǎo)致的病例大約占所有JBTS患者的1%[12-13]。

本研究采用全外顯子組測序技術(shù)對一個(gè)JBTS家系的患兒基因組DNA進(jìn)行檢測，篩選出ARMC9基因(NM_025139.4)上的c.485C>G，p. Ser162*和c.1 878+1G>A變異位點(diǎn)，并對患兒及家系成員進(jìn)行RT-PCR和Sanger測序驗(yàn)證，證實(shí)ARMC9的復(fù)合雜合變異是該家系的致病原因。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.家系來源：該JBTS家系由鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(河南省兒童醫(yī)院)康復(fù)科采集，包括患兒、同胞姐姐、父親和母親。血樣以及臨床資料的收集均符合知情同意原則。本項(xiàng)研究已通過國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所倫理審查委員會的審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號為201806)。

2.主要試劑：全血基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)來自QIAGEN公司(德國)，RNA采血管(TempusTMBlood RNA Tube)、RNA提取試劑盒(TempusTMSpin RNA Isolation Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScript IV First-Strand Synthesis System Kit)均來自Thermo Fisher Scientific公司(美國)，Easy Taq DNA酶、Fast Pfu DNA酶以及DNA Marker(DL2000)購自全式金生物技術(shù)有限公司，PCR擴(kuò)增測序引物由北京六合華大科技有限公司合成。

二、DNA提取和全外顯子組測序

按照QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒的操作說明從200 μl全血中提取基因組DNA。用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific，美國)檢測DNA濃度。取1 μg DNA用超聲儀(Covaris，美國)隨機(jī)打斷成100 bp～200 bp的小片段，使用SureSelect Human All Exon 60M Kit 試劑盒(Agilent，美國)進(jìn)行建庫，利用NovaSeq6000高通量測序儀(Illumina，美國)進(jìn)行2×150雙端測序。

三、測序數(shù)據(jù)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制后，使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)軟件將數(shù)據(jù)與GRCh37/hg19基因組進(jìn)行比對，使用GATK(Genome Analysis Toolkit)和VEP(Ensembl Variant Effect Predictor)[14]進(jìn)行注釋，并參考dbSNP151(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、1000 Genomes Project(http：//browser.1000genomes.org)、Genome Aggregation Database(http：//gnomad.broadinstitute.org/)及The Human Gene Mutation Database(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php/)等數(shù)據(jù)庫。變異位點(diǎn)通過下列步驟進(jìn)行過濾篩選：(1)優(yōu)先考慮目前已知的JBTS致病基因；(2)保留最小等位基因頻率(MAF)<0.01的變異位點(diǎn)；(3)著重關(guān)注無義突變、移碼突變、經(jīng)典剪切位點(diǎn)突變等致病性強(qiáng)的變異；(4)按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(The American Collage of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南[15]，對篩選后的變異位點(diǎn)進(jìn)行分級，從而確定候選的致病基因及變異位點(diǎn)。

四、Sanger測序驗(yàn)證

針對ARMC9基因變異位點(diǎn)所在的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)上下游引物(引物序列見表1)，以患兒及其父母、姐姐的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在ABI 3730xl(Thermo Fisher Scientific，美國)上完成Sanger測序。使用Chromas軟件查看Sanger測序峰圖，SeqMan軟件比對Sanger測序結(jié)果。

采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法驗(yàn)證c.1 878+1G>A位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生的變化。從全血中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異性引物(ARMC9in20F、ARMC9in20R)(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行Sanger測序。

表1 ARMC9基因變異位點(diǎn)擴(kuò)增引物序列

結(jié) 果

一、臨床資料

患兒，男，2月10天，以“不會追視、追聽”為代主訴至鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院康復(fù)科門診就診，現(xiàn)病史：不會抬頭，對視差，不會追視、追聽，易嗆奶，睡眠多。出生史：患兒系第3胎第2產(chǎn)，足月順產(chǎn)，出生體重3.5 kg，出生身長50 cm，出生時(shí)有羊水渾濁，無缺氧窒息史，阿氏評分不詳。無特殊家族史。查體：頭圍41.5 cm，右足有六趾畸形，左手小手指根部外側(cè)有肉贅(圖1A、B為患兒2歲隨訪時(shí)所拍攝)；雙眼瞼下垂，眼球水平震顫；頸軟，心肺腹未見明顯異常，膝腱反射可引出，雙下肢內(nèi)收肌肌張力略低，雙側(cè)巴氏征陽性，雙側(cè)踝陣攣陰性。輔助檢查：腦電圖未見異常；肝、腎及泌尿系統(tǒng)B超未見異常。血氨基酸及肉堿檢測未見異常；視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential，F(xiàn)VEP)異常：雙眼P100波潛伏期輕度延長；顱腦MRI異常：雙側(cè)額顳部蛛網(wǎng)膜下腔略寬，左側(cè)額部少量硬膜下積液，枕部蛛網(wǎng)膜下腔增寬，小腦蚓部發(fā)育欠佳，雙側(cè)小腦上腳長、粗(圖1C)，第四腦室略呈蝙蝠形，腦橋及中腦下部形態(tài)欠規(guī)則，可見“磨牙征”(圖1D)，胼胝體部略薄短。臨床懷疑Joubert綜合征。

A：右足六趾畸形；B：左手小手指根部有肉贅；C：磁共振T1WI矢位示小腦上腳增粗延長；D：磁共振T1WI軸位示“磨牙征”。(箭頭所示為病變位置)。

二、基因變異分析

經(jīng)全外顯子組測序，分析發(fā)現(xiàn)患兒2號染色體ARMC9基因(NM_025139.4)存在c.485C>G和c.1 878+1G>A復(fù)合雜合變異。其中c.485C>G為無義突變，位于第5號外顯子，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止，產(chǎn)生截短蛋白(p.Ser162*)；c.1 878+1位于20號外顯子的3’端，屬于經(jīng)典剪切位點(diǎn)，c.1 878+1G>A變異為經(jīng)典剪切位點(diǎn)變異。這兩個(gè)位點(diǎn)在dbSNP151、1 000 g、gnomAD等公共數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道，HGMD數(shù)據(jù)庫未收錄，是新的變異位點(diǎn)。根據(jù)ACMG指南，均屬于致病性變異。ARMC9結(jié)構(gòu)及變異示意圖見圖2。

A：ARMC9蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測簡圖，CC：coiled coil結(jié)構(gòu)域；lc：low complexity；B：ARMC9基因變異，黑色字母表示已報(bào)道的變異位點(diǎn)，紅色字母表示本研究發(fā)現(xiàn)的新位點(diǎn)。

三、Sanger測序結(jié)果分析

患兒的c.485C>G，p.Ser162*位點(diǎn)來自母親，c.1 878+1G>A位點(diǎn)來自父親，其姐攜帶c.485C>G變異，不攜帶c.1 878+1G>A變異，符合常染色體隱性遺傳的特征(圖3)。

A：家系圖；B：ARMC9變異位點(diǎn)的Sanger測序峰圖(紅色箭頭示變異所在位置)。

為檢測c.1 878+1G>A位點(diǎn)對RNA剪切的影響，分別提取各家系成員的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，利用ARMC9in20F、ARMC9in20R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)。電泳結(jié)果顯示父親(Ⅰ：1)與患兒(Ⅱ：3)存在兩個(gè)不同長度的擴(kuò)增條帶，母親(Ⅰ：2)、姐姐(Ⅱ：1)及正常對照(Con)只有單一的擴(kuò)增條帶。Sanger測序結(jié)果證實(shí)母親和姐姐只有392 bp的轉(zhuǎn)錄本，且序列與正常對照一致，而父親與患兒除了392 bp的野生型轉(zhuǎn)錄本以外，還存在一個(gè)287 bp的轉(zhuǎn)錄本。經(jīng)比對分析可知該段序列中缺失了20號外顯子的序列。這些結(jié)果表明c.1 878+1G>A變異在轉(zhuǎn)錄水平可造成外顯子跳躍，導(dǎo)致第20號外顯子完全缺失(全長105 bp)(圖4)。

A：cDNA擴(kuò)增電泳圖；B：正常對照(Con)與患兒(Ⅱ：3)擴(kuò)增產(chǎn)物的Sanger測序峰圖(紅色箭頭所示為變異起始位置)；C：野生型(WT)和c.1 878+1G>A變異(Mut)所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄差異示意圖。

討 論

Joubert綜合征是一種罕見的先天性小腦發(fā)育畸形疾病，有3個(gè)關(guān)鍵診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)顱腦MRI中顯示“磨牙征”；(2)嬰兒期肌張力減退；(3)發(fā)育遲緩/智力障礙，此外還包括異常眼動、呼吸節(jié)律異常等癥狀[2，5-6，16]。該病例MRI顯示磨牙征、小腦上腳增粗延長、小腦蚓部發(fā)育不良，患兒有肌張力低、發(fā)育落后等癥狀，符合Joubert綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，該患兒還有多趾、雙眼瞼下垂、視覺誘發(fā)電位異常等表現(xiàn)。全外顯子組測序及分析結(jié)果表明該患兒為1例ARMC9基因變異所導(dǎo)致的Joubert綜合征，其中c.1 878+1G>A變異可導(dǎo)致異常剪切，造成第20號外顯子跳躍。

目前對JBTS的臨床遺傳學(xué)研究以國外報(bào)道居多，已有至少39個(gè)致病基因被發(fā)現(xiàn)[11，17-18]。國內(nèi)的相關(guān)研究較少，在已報(bào)道的100余例JBTS中僅少數(shù)病例具有明確的致病基因和變異位點(diǎn)，這些突變分別位于CPLANE1(C5orf42)、CC2D2A、AHI1、MKS1、NPHP1等14個(gè)基因上[19-23]。2021年，Luo等[24]在3個(gè)中國人群的JBTS家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的Joubert綜合征致病基因-IFT74(intraflagellartransportprotein74)，該基因突變的JBTS患者均表現(xiàn)出“磨牙征”、發(fā)育遲緩、多指和輕度唇裂的表型，且所有的4名患者共享c.535C>G變異位點(diǎn)。

本研究中的ARMC9(armadillo repeat containing 9，OMIM#617612)基因，也稱KIAA1868，定位于2q37.1，其編碼的蛋白質(zhì)存在兩個(gè)異構(gòu)體，長度分別為818個(gè)氨基酸和665個(gè)氨基酸[12，25]。ARMC9蛋白定位于纖毛的基體，其N端的LisH結(jié)構(gòu)域與微管相連接，在纖毛形成過程中表達(dá)上調(diào)。ARMC9可以與JBTS相關(guān)蛋白CEP104、CSPP1、CEP290、RPGRIP1L、TOGARAM1、CCDC66等發(fā)生相互作用。同時(shí)，ARMC9/TOGARAM1復(fù)合體可調(diào)節(jié)纖毛微管蛋白的翻譯后修飾過程(包括乙?；投嗵腔?、調(diào)控纖毛的長度及維持纖毛的穩(wěn)定性[12，18]。

2017年，ARMC9基因變異首次證實(shí)與JBTS相關(guān)[12]。Van De Weghe等[12]在11名JBTS患者(其中包括6名男性和5名女性，分別來自8個(gè)家庭)中發(fā)現(xiàn)了ARMC9基因變異，這些患者具有上瞼下垂(7例)、多趾(2例)、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(2例)等伴發(fā)癥狀。隨后，Kar等[13]報(bào)道了另一個(gè)JBTS家系，此家系中的3名患兒均具有“磨牙征”，同時(shí)表現(xiàn)出多指(趾)畸形、智力障礙、上瞼下垂的癥狀。全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)了ARMC9基因的同義突變c.879G>A，p.Thr293Thr。Minigene實(shí)驗(yàn)證實(shí)該變異在轉(zhuǎn)錄水平導(dǎo)致了第9號外顯子的跳躍，是該家系的致病原因。2021年初，鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院回顧性分析了11例經(jīng)產(chǎn)前超聲及MRI診斷為JBTS胎兒的影像學(xué)及遺傳學(xué)檢測結(jié)果。其中，有一例具有“磨牙征”、小腦蚓部完全缺失并伴有右足多趾和單臍動脈的胎兒經(jīng)遺傳學(xué)檢查檢出ARMC9基因的3個(gè)雜合變異位點(diǎn)，其中c.879+1G>A遺傳自母親，c.1 369C>T和c.348G>A位點(diǎn)遺傳自父親，但此文未對三個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)的解讀和致病性分級[26]。

目前HGMD數(shù)據(jù)庫中收錄的ARMC9基因變異共13個(gè)，包括7個(gè)錯(cuò)義突變、2個(gè)無義突變、3個(gè)剪切位點(diǎn)變異和1個(gè)大片段缺失(圖2)。這些變異引起的表型多數(shù)與JBTS相關(guān)，僅有兩個(gè)位點(diǎn)例外，即c.601G>T(p.Glu201*)和c.443T>C(p.Phe148Ser)，它們是在對畸形胎兒的基因篩查中發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)[12-13，27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)的ARMC9基因c.485C>G和c.1 878+1G>A復(fù)合雜合變異均未見報(bào)道或收錄，是新的變異位點(diǎn)。

目前，Joubert綜合征的致病機(jī)理尚不明確，亦無有效的治療措施，對高風(fēng)險(xiǎn)家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷是預(yù)防Joubert綜合征患兒出生的最有效方法。本項(xiàng)研究所發(fā)現(xiàn)的ARMC9基因c.485C>G，p.Ser162*和c.1 878+1G>A變異，明確了該Joubert綜合征家系的致病原因，拓寬了ARMC9基因的變異譜，為該家庭的遺傳咨詢和再生育提供了分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。