趙瓊珍，楊宣，鐘鎮(zhèn)濤，陸寶燕，趙杰，黃衛(wèi)東，*

(1.新疆碳智干細胞庫有限公司，圖木舒克 844000；2.新疆佳音醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

不孕不育嚴重危害人類生殖健康，發(fā)生率約占全世界育齡夫婦的1/6，其中接近50%是由男性因素所導致，男性不育常見病因主要有嚴重少精子癥、弱精子癥、畸形精子癥或無精子癥。無精子癥約占男性不育群體的20% 以上[1]，遺傳因素是其主要原因之一。染色體結構和功能異常同無精子癥的發(fā)生密切相關，單基因的點突變也會導致精子的發(fā)生失敗，此外，表觀遺傳修飾異?？赡苡绊懻２G丸生精過程中諸多基因有序表達及調控，最終導致精子的發(fā)生失敗。

隨著二代測序技術的發(fā)展和臨床應用，越來越多與男性生精障礙相關基因被揭示，如TEX15[2]、USP26[3-4]、WT1[5-6]、RNF212[7]、STAG3[7]、ESX1[8]、Fbxo47[9]等，這些功能基因的發(fā)現(xiàn)為無精子癥的遺傳學變異研究提供了大量數(shù)據(jù)支持，為單核苷酸變異(SNVs) 的篩查奠定了堅實的理論基礎。高通量測序技術結合全外顯子測序分析能更有效地針對男性不育相關基因進行檢測分析，能夠極大地降低診療成本和提高診斷效率，從而進一步加速個體化精準醫(yī)療的發(fā)展。了解無精子癥發(fā)生的遺傳學機制是臨床上解決生育問題的一個重要的基礎性問題，對于病因發(fā)現(xiàn)、臨床治療均具有重大意義。目前，新疆地區(qū)無精子癥的遺傳學研究報道很少，對新疆地區(qū)不同民族背景下的無精子癥遺傳學研究更是空白，本文利用新疆地區(qū)特有的人口資源優(yōu)勢，以無精子癥患者和健康男性人群為研究對象，通過對外顯子測序結果的觀察和分析，篩查無精子癥的候選基因，以期為新疆人群無精子癥的診斷及預防提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

選取2019年11月至2021年5月就診于新疆佳音醫(yī)院的男性為研究對象。

納入標準：(1)有2次及以上的常規(guī)精液檢測；(2)無既往相關病史(包括隱睪史、既往化療或放療史、炎癥等)；(3)進行染色體核型及染色體拷貝數(shù)檢測正常，且染色體AZF區(qū)無異常。無精子癥診斷標準：2次以上精液檢測均未發(fā)現(xiàn)精子。

根據(jù)納入標準共有1 006例男性患者。根據(jù)常規(guī)精液檢測結果，208例研究對象為篩選人群，將97例無精子癥患者作為篩選實驗的實驗組，隨機選取常規(guī)精液正常的111名患者為篩選對照組。

本研究已通過倫理審查會批準(JYLL-KY20190705-09)，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.信息采集：用調查問卷形式，收集研究對象的民族及年齡等基本信息。

2.精液檢測：采用手淫取精的方式收集精液樣本，參照WHO第5版人類精液檢查與處理實驗手冊，進行精液常規(guī)分析。

3.染色體分析：抽取外周血5 ml，通過G顯帶法檢測染色體核型，通過高通量測序檢測染色體拷貝數(shù)變異和Y染色體微缺失。

4.生殖激素檢測：分離外周血血清，通過化學發(fā)光免疫分析法檢測血清生殖激素水平。包括促卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、睪酮(T)、泌乳素(PRL)、雌二醇(E2)等5項激素指標，臨床上的激素正常評判標準如下：FSH 1.27～19.26 U/L、LH 1.24～8.62 U/L、T 6.07～27.10 nmol/L、PRL 114.78～570.74 pmol/L、E255.05～142.95 pmol/L。

5.驗證人群分組：將符合納入標準且有完整生殖激素檢測結果的患者作為驗證人群，共881例，根據(jù)常規(guī)精液檢查結果，分為無精子癥組(n=68例)、少精子癥組(n=57例)和正常組(n=756例)。

6.全外顯子基因測序：采集研究對象 5 ml血液，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取DNA。使用Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺進行全外顯子組基因測序檢測[10]。

7.基因數(shù)據(jù)分析及位點篩選、驗證：為了保障下游數(shù)據(jù)分析的真實性我們使用FastQC軟件對數(shù)據(jù)進行質控；為了提高比對質量我們使用AdapterRemoval去除接頭序列；使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)將原始數(shù)據(jù)比對到人類標準參考序列hg19上；通過samtools軟件中view -b參數(shù)，將文件格式轉換為壓縮比例高、占用容量小的二進制bam文件；使用samtools index命令為bam建立與染色體位置相關的索引，便于后續(xù)其他軟件讀取其位置信息[11]；使用DeDup刪除PCR重復項[12]；使用HaplotypeCaller對上述的bam文件尋找變異的SNP位點，生成VCF文件用于后續(xù)位點的質控和注釋。

利用OMIM、Ref Seq、The Human Protein Atlas、Pubmed和GeneCards 等數(shù)據(jù)庫，對無精子癥的顯著性差異位點查詢分析并進行功能驗證。把篩選出來的無精子癥相關致病基因位點放入到本院的男性外顯子基因驗證組中進行驗證，統(tǒng)計是否在正常組和無精子癥組中存在顯著差異，驗證候選基因位點在不同民族中是否有差異分布以及基因突變對激素的影響。

三、統(tǒng)計學分析

運用R語言對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。根據(jù)不同分組的SNP位點的突變頻率使用chisq.test(data)命令進行卡方檢驗(chi-square test)統(tǒng)計[13-14]。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、研究對象基本資料

共有208例進行了外顯子基因組測序的男性進行無精子癥相關致病基因位點的篩選，篩選人群年齡26～55歲，平均年齡35.7歲，包括漢族(110例)、維吾爾族(62例)、回族(15例)、哈薩克族(14例)及其他民族(7例)。

881例驗證人群年齡24～54歲，平均年齡34.6歲，包括漢族(572例)、維族(195例)、回族(41例)、哈薩克族(35例)及其他民族(38例)。

二、顯著性基因頻率統(tǒng)計

根據(jù)篩選人群實驗組和對照組的SNP位點的突變頻率的不同，共篩選到238個顯著性基因(P<0.05)，其中基因KNTC1(rs7968222)在兩組人群中差異極其顯著(P<0.001)，故將該基因位點的突變作為導致無精子癥的候選基因位點。

表1 顯著性基因頻率統(tǒng)計(部分)(%)

三、攜帶rs7968222突變位點KNTC1基因的驗證

在2019年11月至2021年5月就診于新疆佳音醫(yī)院進行全外顯子組測序(WES)的男性個體(1 488例)中，篩選具有激素信息且Y染色體AZF 區(qū)正常的個體(883例)，進一步選取核型正常的881例個體作為驗證樣本，統(tǒng)計rs7968222位點突變的KNTC1基因在不同精液質量分組、不同民族中的差異以及位點突變對激素分泌的影響。

1.攜帶rs7968222突變位點在不同精液質量分組中的差異：正常組中攜帶rs7968222位點的樣本占其總數(shù)的4.63%，無精子癥組中攜帶rs7968222位點的樣本占其總數(shù)的11.76%，統(tǒng)計結果顯示，無精子癥組中rs7968222突變位點攜帶率顯著高于正常組(P<0.05)(表2)。在無精子癥組中8例攜帶者分別為維吾爾族6例，哈薩克族2例。

表2 各組人群攜帶rs7968222突變位點KNTC1基因的比較(%)

2.攜帶rs7968222突變位點KNTC1基因在不同民族中的差異：比較基因KNTC1(rs7968222)在不同民族人群中的攜帶情況，統(tǒng)計結果顯示，維吾爾族中rs7968222突變位點攜帶率顯著高于漢族(P<0.01)，其他民族由于樣本量較少未做統(tǒng)計(表3)。

表3 不同民族人群攜帶rs7968222突變位點KNTCI基因的比較(%)

3.rs7968222位點突變與否對不同生殖激素水平的影響：為了分析攜帶突變位點對激素水平的影響，將人群分為突變組(含突變位點)和未突變組(不含突變位點)，統(tǒng)計兩組人群中激素水平異?；颊叩恼急?。結果顯示突變組的FSH水平異常率顯著高于未突變組(P<0.01)(表4)。

表4 突變組和未突變組不同激素水平異常率比較[n(%)]

四、KNTC1基因的功能及其驗證

我們通過文獻和數(shù)據(jù)庫查找候選基因的注釋信息，并確定本次分析的候選致病基因位點是否前人已在該疾病上報道或驗證。使用GeneCards(http：//www.genecards.org/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和String(https：//string-db.org/)等在線分析軟件對KNTC1基因的功能進行驗證，結果顯示KNTC1基因編碼RNA在組織中是睪丸和骨髓表達量最高[15](圖1)，細胞系中在精原細胞(NX 35.8)、精母細胞(NX 24.6)、早期精子細胞(NX23.5)、紅細胞(23.3)和中晚期精子細胞(NX13.7)表達量最高[15](圖2)，并且其互作蛋白與有絲分裂紡錘體組裝檢查點相關(表5)，但未報道與無精子癥之間的關系。

圖1 KNTC1基因編碼RNA的組織特異性

圖2 KNTC1基因編碼RNA的細胞特異性

表5 KNTC1的互作蛋白及其功能

討 論

男性不育癥的致病因素包括遺傳因素、環(huán)境因素、感染因素、免疫因素和疾病因素等，除遺傳因素以外的致病因素所導致的無精子癥大多可以通過藥物、手術、甚至改變生活習慣進行干預治療。但遺傳因素所致該病目前尚缺乏有效治療方法，而且當此類患者通過輔助生殖技術獲得后代，其遺傳變異傳遞給其男性后代致其不育的風險大大提高。因此，明確無精子癥患者的遺傳學病因有助于治療方式的選擇和對行輔助生殖助孕的此類患者進行遺傳咨詢。

全外顯子測序技術的進步，大大降低了測序周期和成本，使得在全外顯子范圍內探尋無精子癥新的致病基因位點，并對所有的變異體進行功能注釋，篩選出可能對基因功能有顯著影響的位點突變成為了可能。并初步探索致病機制，進一步揭示導致男性生精功能障礙的遺傳學因素，為臨床治療提供了寶貴資料，為下一階段擴大樣本量研究提供參考位點。

本研究通過97例無精子癥患者的全外顯子數(shù)據(jù)篩選出基因KNTC1(rs7968222)作為無精子癥的候選基因，在對攜帶rs7968222位點突變的KNTC1基因驗證的過程中，結果顯示：(1)該位點突變在無精子癥組中存在的頻率顯著高于正常組(P<0.05)，推測其與無精子癥相關；(2)在漢族和維吾爾族中攜帶rs7968222位點突變的比例存在顯著差異(P<0.01)，推測該基因位點具有民族異質性；(3)攜帶rs7968222位點突變人群的FSH水平異常率顯著高于未攜帶人群(P<0.01)。在男性中促卵泡刺激素的功能是促進睪丸曲細精管的成熟和精子的生成，由此我們推測基因KNTC1可能通過內分泌的調節(jié)進而影響精子的發(fā)生過程。

通過GeneCards的基因功能驗證，顯示基因KNTC1位于12號染色體長臂上，其編碼的動粒相關蛋白1是有絲分裂紡錘體組裝檢查點的基本組成部分，確保細胞分裂過程中染色體正確分離，并參與絲分裂前中期和GPCR信號轉導。根據(jù)蛋白互相作用網(wǎng)絡中介圖發(fā)現(xiàn)其互作蛋白與有絲分裂紡錘體組裝檢查點相關，推測KNTC1通過影響紡錘體的裝配，阻礙分裂的進行，從而影響精子的發(fā)生。

經過在數(shù)據(jù)庫中對KNTC1基因mRNA表達的搜索驗證，發(fā)現(xiàn)該基因在各個組織廣泛表達，骨髓和睪丸組織中表達量最高，說明其表達的組織學特異性；細胞實驗中，研究表明精原細胞、精母細胞、早期精子細胞中表達量最高，說明動粒相關蛋白1參與精子發(fā)生的不同階段?；騅NTC1的組織特異性和細胞特異性也進一步提示該基因可作為無精子癥的候選基因。

綜上，本研究通過對外顯子測序結果的篩查和分析，篩選出無精子癥患者的致病候選基因，并做了初步網(wǎng)絡驗證分析，提示KNTC1(rs7968222)基因突變具有民族異質性，可能是新疆地區(qū)部分無精子癥患者的遺傳易感因素之一。我們的研究為臨床的無精子癥遺傳診斷平臺提供理論和實驗基礎，為可能涉及到進行性加重的不育患者或通過輔助生殖技術生育的不育子代提供生育力保存或遺傳病因學診斷咨詢依據(jù)。