尹迎秋，韋 杰，鄭惠英

(粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 韶關(guān) 512026)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性氣道炎性反應(yīng)性疾病，其特點(diǎn)是氣流受限不完全可逆，年齡越大，COPD的患病率越高[1]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國每年因COPD死亡的人數(shù)約100萬，殘疾人數(shù)超過500萬[2]。COPD無法完全治愈，治療只能緩解癥狀，因而探索COPD的發(fā)病因素和易感性特點(diǎn)對(duì)防治COPD具有重要意義。文獻(xiàn)提示COPD的發(fā)病情況具有顯著的家族聚集傾向，因而多推測COPD發(fā)病是環(huán)境因素和基因多態(tài)性共同誘發(fā)的[3]。針對(duì)現(xiàn)階段COPD相關(guān)基因篩查發(fā)現(xiàn)肺氣腫的出現(xiàn)與α1-抗胰凝乳蛋白酶(α1-AT)的缺乏具有顯著相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)帶有純合子的 Z 突變的個(gè)體循環(huán)血α1 -AT 水平極低，Z變異型缺乏抗蛋白水解酶的功能，進(jìn)而加快肺功能下降的速度，增加了COPD產(chǎn)生的易感性[4]，α1-AT基因rs1243166序列基因多態(tài)性與COPD的發(fā)病關(guān)系密切，但該位點(diǎn)的突變影響基因型的表達(dá)和具體的活性機(jī)制在COPD發(fā)病過程中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。本研究探討α1-AT多態(tài)性與COPD易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2017年9月～2019年3月在本院治療的COPD患者110例(COPD組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合2013年GOLD指南制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②戶籍及居住地在本地，且時(shí)間超過1年；③漢族；④患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有惡性腫瘤、肝腎功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病等；②有支氣管哮喘、肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張癥等其他肺部疾病。同時(shí)選取健康志愿者110例作為對(duì)照組，COPD組和對(duì)照組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2方法：取所有研究對(duì)象靜脈血2 ml，使用美國BD公司MassARRAY Assay Design和Genotyping Tools軟件設(shè)計(jì)待測單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn) rs1243166的單堿基延伸引物和PCR擴(kuò)增引物，交由山東中杉生物有限公司合成：上游引物：5′-ACGTTGGATGAAGCACATCACCCATTGACC-3′；下游引物：5′-ACGTTGGATGAAGAAGTCAGGCTGCATGTG-3′；延伸引物：5′-CCCTCCCTTTCCTCC-3′；多重PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：4 min 94 ℃；20 s 94 ℃，30 s 56 ℃，1 min 72 ℃，循環(huán)45次；3 min 72 ℃；保持4 ℃。ddNTP 加入后特異性擴(kuò)增長度多態(tài)性(SAP)酶純化擴(kuò)增產(chǎn)物，單堿基延伸引物擴(kuò)增 SNP 位點(diǎn)并進(jìn)行 SNP 分型[5-6]。

表1 COPD組和對(duì)照組一般資料比較

2 結(jié)果

2.1α1-AT基因型：經(jīng)酶切電泳圖顯示：α1-AT基因rs1243166序列基因型分別有AA、GG、GA三種基因型，觀察組和對(duì)照組α1-AT基因rs1243166序列基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。見圖1。

注：M：Marker；1：AA型；2和5：GG型；3和4：GA型圖1 酶切電泳圖

2.2COPD組和對(duì)照組α1-AT基因rs1243166序列基因型分布：COPD組和對(duì)照組α1-AT基因rs1243166序列基因型分布差異比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中COPD組基因型GG和等位基因G比例均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3COPD組不同基因型患者FEV1/FVC比較：GG型患者FEV1/FVC明顯低于AA型和GA型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AA型和GA型患者FEV1/FVC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 COPD組和對(duì)照組α1-AT基因rs1243166序列基因型分布[n(%)，n=110]

表3 COPD組不同基因型患者FEV1/FVC比較

3 討論

COPD是一種危害極為嚴(yán)重的慢性呼吸道疾病，我國COPD患者人數(shù)已逾1億人，近年發(fā)病率和死亡率均逐年增高[7]。以COPD為首的慢性呼吸疾病，已經(jīng)與心腦血管病、惡性腫瘤、糖尿病與代謝性疾病等一起被世界衛(wèi)生組織共同列為全球“四大慢病”之一，給社會(huì)和家庭造成沉重的疾病負(fù)擔(dān)[8]。

COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要將參與氧化和抗氧化、有毒物質(zhì)代謝、炎性反應(yīng)主動(dòng)防御機(jī)制、氣道高反應(yīng)等過程的基因作為候選基因，其中α1-AT基因是現(xiàn)階段確定的COPD最主要的易感基因之一[9-10]。α1-AT基因可抑制多種蛋白酶，屬于血漿含量最多的蛋白酶抑制子，進(jìn)而有效抑制組織降解，調(diào)節(jié)組織的局部損傷[11]。相關(guān)文獻(xiàn)提示α1-AT基因的Pisz基因型患者患COPD 風(fēng)險(xiǎn)較高，而Piss基因型患者患COPD 風(fēng)險(xiǎn)并不會(huì)升高，而α1-AT基因的Pis和Piz兩位點(diǎn)的SNP無特異變化[12]。此外，由于種族和地區(qū)的差異，因人群和種族不同SNP 基因型的實(shí)際發(fā)生頻率也存在較大差異，COPD的易感性與α1-AT基因關(guān)聯(lián)性不僅相同，這也是本研究和探索的重要方向。

本研究顯示：α1-AT基因rs1243166序列基因型分別有AA、GG、GA三種基因型，觀察組和對(duì)照組α1-AT基因rs1243166序列基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。上述結(jié)果說明α1-AT基因rs1243166序列基因型研究人群具有群體遺傳代表性，α1-AT基因rs1243166序列基因型人群分布可反映整體人群基因的分布情況。

SNP特指對(duì)于某一基因中人群單個(gè)堿基的替換或顛換現(xiàn)象且發(fā)生率超過 1%；基因編碼區(qū)的 SNP會(huì)替換表達(dá)產(chǎn)物中氨基酸，并對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)和活性發(fā)生重要影響[13-14]。COPD組和對(duì)照組α1-AT基因rs1243166序列基因型分布結(jié)果顯示COPD組和對(duì)照組α1-AT基因rs1243166序列基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中COPD組基因型GG和等位基因G比例分別為38.18%和60.00%，高于對(duì)照組。上述結(jié)果提示，α1-AT基因rs1243166序列基因多態(tài)性患者與COPD具有密切相關(guān)性，其中基因型GG和等位基因G比例是主要致病基因型，對(duì)于該基因型的人群需要重要預(yù)防并注意身體變化，做到COPD的早預(yù)防和及時(shí)治療。相關(guān)文獻(xiàn)曾經(jīng)報(bào)道，α1-AT基因rs1243166序列基因多態(tài)性的G等位基因可能是COPD的危險(xiǎn)因素之一，并在中國漢族人群中的COPD患者具有致病的主導(dǎo)作用[15-16]。

COPD組不同基因型患者FEV1/FVC比較發(fā)現(xiàn)GG型患者FEV1/FVC明顯低于AA型和GA型患者；AA型和GA型患者FEV1/FVC比較無差異。上述結(jié)果說明α1-AT基因rs1243166序列基因的基因型GG患者肺功能有關(guān)，表達(dá)越多，肺功能越差。α1-AT基因rs1243166序列基因3'端突變體是發(fā)生基因 3'端增強(qiáng)子序列堿基處的 G→A 轉(zhuǎn)換的具體位置，盡管上述轉(zhuǎn)換并不造成α1-AT基因的功能和結(jié)構(gòu)變化，但可在一定程度上導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合α1-AT基因在應(yīng)激反應(yīng)時(shí)上調(diào)和α1-AT蛋白表達(dá)能力的下降[17-19]。由于手術(shù)、損傷、炎性反應(yīng)及腫瘤等均需要大量急性相蛋白， 而α1-AT作為急性相蛋白的主要成分，3'端突變體致使α1-AT的分泌和合成無法相應(yīng)增加，機(jī)體蛋白酶的酶解能力無法得到有效中和，因而誘發(fā)肺組織水解和損傷，患者肺功能相對(duì)較差[20-21]。

綜上所述，α1-AT基因rs1243166序列基因多態(tài)性與COPD易感性有關(guān)，基因型GG患者肺功能較差。