張 濤，于 翔，龔 元

(遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000)

目前，國內(nèi)外關(guān)于菲牛蛭素的報(bào)道較多。在抗凝血方面，黃愛民等[1]從廣西菲牛蛭消化液中分離、提取出兩種特異性凝血酶抑制劑——菲牛蛭素A和菲牛蛭素B，對(duì)凝血因子具有抑制作用。汪文茉等[2]在研究中也發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭干品(全體)、頭部(活體)及活體(全體)的抗凝血酶的比活均高于日本醫(yī)蛭，且其頭部抗凝血酶比活最高。抗血栓方面，吳軍志和于立華[3]采用大鼠靜脈血栓模型，研究菲牛蛭制品的抗血栓與溶栓作用，結(jié)果表明，寬體金線蛭凍干粉<歐洲醫(yī)蛭凍干粉<日本醫(yī)蛭凍干粉<菲牛蛭凍干粉，菲牛蛭頭部凍干粉的溶栓效果更好。黎淵弘等[4]用廣西菲牛蛭提取物對(duì)家兔動(dòng)脈血栓、大鼠靜脈及體外血栓進(jìn)行抗血栓研究，結(jié)果表明，家兔注射菲牛蛭提取物后抗血栓效果較好，與注射前相比有顯著差異。而關(guān)于菲牛蛭素結(jié)構(gòu)方面，Steiner[5]從菲牛蛭中提取、分離出具有抗凝活性的水蛭素，并闡述了其一級(jí)結(jié)構(gòu)，命名為Hm1和Hm2。Scacheri[6]從菲牛蛭中分離出水蛭素的變異體，與水蛭素HV-1的基本結(jié)構(gòu)有大約70%的系列同源性，并且具有較強(qiáng)的抗凝活性[7]。譚恩光和劉秀平[8]報(bào)道了廣東菲牛蛭素的基因序列特征，其多肽鏈上的半胱氨酸將形成3對(duì)二硫鍵對(duì)分子構(gòu)型起到穩(wěn)定作用，其多肽鏈上的酸性谷氨酸和天冬氨酸末端片段與凝血酶識(shí)別部位結(jié)合是發(fā)揮抗凝活性的關(guān)鍵，這與張彬[9]報(bào)道的水蛭素結(jié)構(gòu)相類似。上述報(bào)道表明，菲牛蛭素是一種多肽類蛋白物質(zhì)，具有較好的抗凝血、抗血栓等作用，而如何保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗凝活性是菲牛蛭素提取工藝的重要一環(huán)。筆者通過冷凍干燥方法，設(shè)計(jì)不同保護(hù)劑配方的正交試驗(yàn)，從而篩選出對(duì)菲牛蛭粗提物保存較好的試驗(yàn)配方，為后期菲牛蛭素的進(jìn)一步分離純化和制劑學(xué)研究提供了一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菲牛蛭健康無病，由湖北省荊州市民康生物技術(shù)公司提供。

海藻糖、PEG2000和甘露醇來源、性狀等見表1。

表1 試驗(yàn)藥物

1.2 方法

1.2.1 菲牛蛭粗提物的提取

通過鹽浸提法[10]提取菲牛蛭粗提物。將菲牛蛭活體分別稱重、剪碎、勻漿，獲得勻漿液；再分別用菲牛蛭體質(zhì)量4倍的生理鹽水稀釋勻漿液，室溫(23±2) ℃下不斷攪拌20 min，攪拌后用質(zhì)量濃度10%的三氯乙酸溶液調(diào)整pH值至2.5，65 ℃水浴15 min，其間適當(dāng)攪拌；水浴后4 ℃10000r/min離心10 min，收集上清液，上清液用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH值至7.0，而后4 ℃10000r/min離心10 min，收集上清液即為菲牛蛭粗提物。

1.2.2 菲牛蛭粗提物凍干試驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)置海藻糖、PEG2000和甘露醇3個(gè)變量因素，采用3因素3水平，即L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)選菲牛蛭粗提物凍干保護(hù)劑最佳配比濃度，每組試驗(yàn)設(shè)定3個(gè)平行組。

取菲牛蛭粗提物水溶液415 mL，分裝到50 mL燒杯中，每個(gè)燒杯分裝45 mL粗提物水溶液，共9個(gè)燒杯。9個(gè)燒杯標(biāo)記為1～9組，根據(jù)表2和表3加入不同質(zhì)量的海藻糖、PEG2000和甘露醇，玻璃棒攪拌均勻。然后將每組攪拌好的菲牛蛭粗提物水溶液分裝到對(duì)應(yīng)標(biāo)記的西林瓶中，每個(gè)西林瓶裝5 mL粗提物水溶液， 9組共計(jì)81個(gè)西林瓶。再將全部的西林瓶放到-20 ℃冰箱，24 h后移到-80 ℃冰箱，再過24 h后用FD5505冷凍干燥機(jī)凍干至水分基本消失。

表2 因素水平的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 單位：%

表3 正交試驗(yàn)表

1.2.3 不同條件下試驗(yàn)組菲牛蛭粗提物抗凝活性測定

菲牛蛭粗提物抗凝活性采用凝血酶直接滴定法測定[11-12]，分別測定粗提物凍干粉24 h內(nèi)抗凝活性，(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后抗凝活性和(27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后抗凝活性；西林瓶中凍干粉用5 mL蒸餾水復(fù)溶，每個(gè)條件下每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果記錄菲牛蛭粗提物凍干粉抗凝活性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并進(jìn)行單因素和多因素的方差分析，顯著水平為P<0.05；并采用層次分析法統(tǒng)計(jì)正交試驗(yàn)結(jié)果[13]。

2 結(jié)果和分析

菲牛蛭粗提物凍干粉各條件下的正交試驗(yàn)、方差分析及權(quán)重分析結(jié)果見表4～表8。從表4可知，粗提物凍干粉的保存活性總體趨勢：粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性>(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性>(27±3)℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性。其中，第1、4、7組粗提物凍干粉保存活性在不同條件下沒有顯著性差異(P>0.05)，其余各組保存活性在不同條件下都有顯著性差異(P<0.05)。

由正交試驗(yàn)結(jié)果(見表4)可知，以不同條件下粗提物凍干粉的保存活性為指標(biāo)，極差R值大小顯示各因素對(duì)粗提物凍干粉的保存活性作用均為B>C>A，A因素R值<空列組R值，由此可知A因素并不是影響凍干粉活性的主要因素；由權(quán)重分析結(jié)果(見表8)可知，各因素對(duì)粗提物凍干粉的保存活性作用為B>C>A；因此由正交試驗(yàn)和權(quán)重分析綜合結(jié)果分析，3種賦形劑對(duì)粗提物凍干粉活性影響大小依次為PEG2000>甘露醇>海藻糖。方差分析結(jié)果(見表5～表7)顯示各因素對(duì)粗提物凍干粉的保存活性無顯著差異(P>0.05)；由正交試驗(yàn)結(jié)果(見表4)和權(quán)重分析結(jié)果(見表8)可知，以粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性為考察指標(biāo)，3種賦形劑最佳配方為A3B3C1；以(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性和(27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性為考察指標(biāo)，3種賦形劑最佳配方為A2B3C1。

表4 菲牛蛭粗提物凍干粉保存試驗(yàn)測定結(jié)果

表5 粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性方差分析結(jié)果

表6 (-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性方差分析結(jié)果

表7 (27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性方差分析結(jié)果

3 討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于菲牛蛭素如何在提取純化后較好地保持其抗凝活性的報(bào)道很少，而本試驗(yàn)采用冷凍干燥的方法保存菲牛蛭素，主要有以下幾方面原因[14]。1)菲牛蛭素是一種多肽類蛋白物質(zhì)，對(duì)溫度比較敏感，一旦發(fā)生蛋白降解，則易失去抗凝活性；而在低溫干燥條件下，菲牛蛭素受熱易變性成分損失很少。2)菲牛蛭素多肽鏈上二硫鍵易被氧化而失去抗凝活性；但在真空干燥條件下，環(huán)境的氧氣極少，菲牛蛭素上易被氧化的物質(zhì)可以得到保護(hù)。3)冷凍干燥法可以除去菲牛蛭粗提物水溶液中95%～99%的水分，并保持菲牛蛭素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而便于其運(yùn)輸和長期保存。

同時(shí)，為防止凍干過程中菲牛蛭素的變性或結(jié)構(gòu)的破壞，本試驗(yàn)選取了海藻糖、PEG2000和甘露醇作為菲牛蛭素凍干賦形劑，其主要依據(jù)有以下幾點(diǎn)[13]。1)菲牛蛭素多肽鏈上二硫鍵易被還原而失去抗凝活性，而海藻糖屬于非還原二糖，不會(huì)與凍干品發(fā)生還原性Mailard反應(yīng)；同時(shí)，海藻糖作為二糖能在凍結(jié)過程中起到低溫保護(hù)劑的作用，又能在干燥脫水過程中起到脫水保護(hù)劑的作用。2)PEG2000是一種聚合物保護(hù)劑，在冷凍干燥過程中，其優(yōu)先析出，具有一定的表面活性，并在蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生“位阻”作用，防止菲牛蛭素蛋白降解變性；同時(shí)，PEG2000能提高菲牛蛭粗提物水溶液黏度，提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，抑制小分子賦形劑海藻糖的結(jié)晶和pH值的降低。在生物制品冷凍干燥過程中，PEG2000既起著低溫保護(hù)劑作用，又起著脫水保護(hù)劑作用。3)菲牛蛭素作為多肽類蛋白物質(zhì)，慢速凍結(jié)是有利的，而甘露醇作為填充劑，在慢速凍結(jié)過程中會(huì)結(jié)晶，從而為菲牛蛭素活性組分提供結(jié)構(gòu)支撐，并且不會(huì)與活性組分發(fā)生反應(yīng)。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果和幾方面因素分析可知，菲牛蛭粗提物凍干粉抗凝活性總體趨勢變化與時(shí)間和溫度有一定關(guān)系，時(shí)間越長，溫度越高，抗凝活性越低，這說明3種賦形劑對(duì)粗提物凍干粉活性影響隨著時(shí)間的增長和溫度的升高會(huì)逐漸降低，從而影響到菲牛蛭素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由表4～表8可知， 3種賦形劑對(duì)粗提物凍干粉活性影響大小依次為PEG2000>甘露醇>海藻糖，各賦形劑差異雖不顯著，但海藻糖并不是起主要作用的賦形劑，這說明聚合物類的賦形劑保護(hù)功能強(qiáng)于低聚糖及無醇類賦形劑。上述3種賦形劑的正交試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性為考察指標(biāo)時(shí)，3種賦形劑最佳配方為A3B3C1；以(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性和(27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性為考察指標(biāo)時(shí)，3種賦形劑最佳配方為A2B3C1。