王 晶， 譚 斌， 趙志杰， 仲灝辰， 曲林林

青島大學附屬醫(yī)院 肝膽胰外科， 山東 青島 266003

胰腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，且預后差，由于其隱匿性，許多中晚期患者失去了手術(shù)機會。近年來，靶向藥物和免疫檢查點抑制劑在多種實體腫瘤中得到了有效應用，但在胰腺癌的治療中卻難以取得突破性進展，5年生存率不足9%[1]。隨著基因檢測技術(shù)和下一代測序技術(shù)在臨床上的廣泛應用，越來越多的腫瘤針對特定的驅(qū)動基因進行靶向治療，一些罕見的基因突變可用于指導臨床作出個體化治療決策。為了解我國沿海地區(qū)胰腺癌基因突變圖譜，本研究對胰腺癌患者進行了腫瘤相關(guān)基因全序列、突變基因序列和潛在藥物靶點序列的比對。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2019年6月青島大學附屬醫(yī)院、青島市立醫(yī)院、煙臺山醫(yī)院、煙臺中法友好醫(yī)院收治的胰腺惡性腫瘤患者，并進行隨訪。納入標準：經(jīng)病理診斷為胰腺惡性腫瘤。排除標準：(1)未行手術(shù)治療的患者；(2)臨床資料缺失。

1.2 研究方法 采集腫瘤樣本和血液對照樣本，進行下一代測序。對納入患者的腫瘤組織樣本和血液樣本進行基因組檢測。從所有固定石蠟包埋樣本中提取至少50 ng DNA。從全血分離的血細胞中提取DNA作為對照，用于鑒定胚系突變。應用Illumina測序儀檢測腫瘤相關(guān)基因的全部編碼外顯子和在實體瘤中頻繁重排的內(nèi)含子，測序結(jié)果平均覆蓋1000倍，基因組改變的評估包括單堿基替換、短插入/缺失和長插入/缺失、拷貝數(shù)變異和基因重排。

1.3 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：QYFYWZLL26520，所納入患者均簽署知情同意書。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入40例胰腺腫瘤患者，其中男26例，女14例，中位年齡59歲(31～77歲)。40例患者中轉(zhuǎn)移組織病理標本7例，原發(fā)腫瘤病理標本33例，其中胰腺導管腺癌(PDAC)34例(85.0%)，胰腺實性假乳頭狀腫瘤(SPN)3例(7.5%)，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNET)1例(2.5%)，分型不清2例(5.0%)。Illumina測序儀共檢測出450個腫瘤相關(guān)基因的全部編碼外顯子和64個在實體瘤中頻繁重排的內(nèi)含子。

2.2 全突變分析 采用下一代測序技術(shù)對40例胰腺癌患者的450個基因進行測序，并對其病理結(jié)果進行分析。隨訪40例患者的生存時間，比較不同基因突變生存時間的差異。前5位突變基因分別是KRAS(80.0%，32/40)、TP53(70.0%，28/40)、CDKN2A(32.5%，13/40)、SMAD4(17.5%，7/40)和AKT2(17.5%，7/40)；在32例胰腺癌標本中檢測到KRAS，其中單核苷酸變異30例，復制數(shù)量變異2例(附錄1)。65%(26/40)的患者至少有1個潛在的藥物靶點，包括ATM、BRCA1、BRCA2、BRAF、CDKN2A、CDK6、CTNNB1、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR3、FGFR4、NTRK3、PTEN、PIK3CA、VEGFA、YES1和PD-L1。

2.3 基于性別的突變分析 男性胰腺癌患者突變最高的基因為KRAS(76.92%，20/26)和TP53(69.23%，18/26)，女性胰腺癌患者突變最高的基因亦為KRAS(78.57%，11/14)和TP53(71.43%，10/14)；在靶向藥物的突變基因中，ACVR2A、AMER1、ATM、GATA3、GLI1、KMT2C、RB1、TET3、TGFBR2突變僅見于男性患者，LRP2、ROCK1、VEGFA突變僅見于女性患者(圖1)。

圖1 男女胰腺癌患者最常見的突變基因

2.4 基于年齡的突變分析 將納入患者分為5個年齡組：Ⅰ組31～40歲(10.0%，4/40)，Ⅱ組41～50歲(12.5%，5/40)，Ⅲ組51～60歲(30.0%，12/40)，Ⅳ組61～70歲(30.0%，12/40)，Ⅴ組71～80歲(17.5%，7/40)。結(jié)果顯示，第Ⅰ組中突變頻率最高的基因為TP53和KRAS，第Ⅱ組中突變頻率最高的基因為KRAS和CDKN2A，第Ⅲ組中突變頻率最高的基因為TP53和KRAS，第Ⅳ組中突變頻率最高的基因為KRAS，第Ⅴ組中突變頻率最高的基因為KRAS、TP53和FGFR1；對于TP53突變頻率，Ⅱ組與Ⅲ組(P=0.02)比較、Ⅲ組與Ⅳ組(P=0.02)比較，差異均有統(tǒng)計學意義；對于FGFR1突變頻率，Ⅲ組與Ⅴ組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)(圖2)。

圖2 不同年齡組中最常見的突變基因

2.5 基于侵犯類型的突變分析 胰腺癌伴神經(jīng)侵犯20例患者中，前5位突變基因分別為KRAS(95%，19/20)、TP53(75%，15/20)、AKT2(30%，6/20)、CDKN2A(30%，6/20)和SMAD4(20%，4/20)。胰腺癌伴血管侵犯3例患者中，前2位突變基因分別為KRAS(100%，3/3)和TP53(66.67%，2/3)(圖3)。

圖3 神經(jīng)和血管侵犯中最常見的突變基因

2.6 突變基因的生存曲線分析 在34例PDAC中，KRAS的突變率最高(100%)。在本研究中，SPN和PNET不存在TP53和KRAS突變；CTNNB1是SPN和PNET所特有的，PNET可與PDAC相鑒別(附錄1)。腫瘤突變負荷(TMB)和細胞程序性死亡-配體1(PD-L1)是新興的基因組生物標志物，可用于檢測腫瘤基因組中基因突變的數(shù)量[2]，故分析了與免疫治療相關(guān)的預測指標TMB和PD-L1，結(jié)果顯示，40例患者無TMB-H表達，僅有1例PD-L1表達呈40%。40例患者的中位總生存期為14.1個月(1.57～40.63個月)，生存分析結(jié)果顯示，有無KRAS、TP53、AKT2、CDKN2A、SMAD4和CTNNB1突變的患者生存時間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(圖4)。

注：a，KRAS基因突變生存分析；b，TP53基因突變生存分析；c，CDKN2A基因突變生存分析；d，AKT2基因突變生存分析；e，SMAD4基因突變生存分析；f，CTNNB1基因突變生存分析。圖4 胰腺癌突變基因生存分析

3 討論

目前，手術(shù)切除已成為胰腺癌潛在的治療方法，部分患者可接受根治性切除，但由于胰腺癌通常發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，因此許多患者在經(jīng)歷了根治性手術(shù)后仍有腫瘤復發(fā)。故尋找胰腺癌早期診斷的新指標，為胰腺癌的防治探索可能的治療靶點顯得尤為重要。在我國，晚期胰腺癌患者的化療很常見。在過去30年里，吉西他濱是胰腺癌治療的黃金標準，總體生存率實現(xiàn)了適度的改善。以吉西他濱為主的聯(lián)合化療已成為晚期胰腺癌的一線治療方案，并顯示出較好的臨床療效和生存率。吉西他濱聯(lián)合NAB-紫杉醇的中位生存期為8.5個月[3]。另外，三藥聯(lián)合化療FOLFIRINOX方案僅10.2個月[4]，中位生存期不足1年。先進的基因檢測技術(shù)、分子靶向藥物和免疫治療為胰腺癌的精準治療帶來了一線曙光。本研究應用下一代測序技術(shù)對40例胰腺癌患者的基因突變圖譜進行分析，探索胰腺癌可能的藥物靶點，以及我國沿海地區(qū)胰腺癌基因突變的規(guī)律；分析和比較了不同胰腺癌(PDAC、SPN和PNET)的基因突變類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDAC患者中KRAS突變率最高，SPN和PNET患者均未發(fā)現(xiàn)TP53和KRAS基因突變；在前5位突變基因中，可能的藥物靶點是CDKN2A，其突變率為32.5%。CDKN2A功能的喪失可能導致周期蛋白依賴性激酶(CDK)2/4/6的激活。因此，CDK抑制劑可以作為CDKN2A基因突變腫瘤的治療選擇。研究[5]顯示，胰腺癌細胞株在體外實驗中對CDK抑制劑具有不同的反應；此外，該研究還對胰腺癌細胞耐藥機制和CDK4/6抑制劑與選擇性治療劑聯(lián)合使用的可能性進行了討論。胰腺癌中CDKN2A基因突變的預測和預后尚不清楚。然而，有研究[6]表明，P16伴隨著TP53和CDKN2A的丟失與淋巴浸潤和術(shù)后廣泛的轉(zhuǎn)移有關(guān)。到目前為止，尚無CDKN2A和CDK4/6突變在胰腺癌中的臨床試驗。KRAS基因位于人類12號染色體的短臂上，全長約50 kb。KRAS通常被描述為“分子開關(guān)”，其編碼蛋白通過構(gòu)象變化等途徑發(fā)揮不同的功能。當功能正常時，KRAS可以正常地調(diào)節(jié)細胞的生長過程；在功能異常時，可引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程的紊亂，細胞過度增殖，最終導致腫瘤的發(fā)生。KRAS基因突變在膽管癌、結(jié)腸癌、直腸癌、膽囊癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中均有發(fā)現(xiàn)。已知KRAS突變存在于大多數(shù)胰腺癌中，突變率為90%～95%[7]，而本研究中KRAS基因突變率為80%，低于其他研究結(jié)果。動物實驗[8]發(fā)現(xiàn)，通過阻斷KRAS下游信號通路的MEK抑制劑，聯(lián)合吉西他濱可以抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生長。大多數(shù)胰腺癌KRAS突變可通過吉西他濱聯(lián)合NAB-紫杉醇化療方案、基因檢測技術(shù)、分子靶向藥物和免疫治療等相關(guān)治療方法來解決，但這些治療方法均未能證明對總體存活率有顯著的臨床益處[9]。

TP53基因位于人類17號染色體的短臂上，全長約15 kb，是一種典型的抑癌基因，其p53蛋白可以維持基因穩(wěn)定，防止基因突變，被稱為“基因守護者”。TP53基因可以通過參與多種生物學過程來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括激活DNA修復過程，調(diào)節(jié)細胞周期以抑制細胞增殖，以及在DNA不可逆損傷后激活細胞凋亡。在結(jié)腸癌、肝癌、膽管癌、膽囊癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均檢測到TP53基因突變，提示TP53基因突變與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究[10]顯示，胰腺癌中TP53基因突變已達到50%～75%，突變概率約為73%[11]。本研究中TP53基因突變率為70%。在KRAS基因啟動激活突變后，TP53基因突變促使KRAS誘導的癌前病變迅速發(fā)展為胰腺癌[10]。目前尚無針對胰腺癌TP53基因突變的藥物臨床試驗。本研究結(jié)果進一步證實了KRAS和TP53在胰腺癌中具有較高突變率，它們可能成為治療胰腺腫瘤的潛在靶點。研究[12-13]顯示，胰腺癌中SMAD4基因突變的概率為30%～64%，而本研究SMAD4基因突變率為17.5%，低于其他研究。SMAD4在胰腺癌中很常見，但其作用仍需研究。大量研究[14-17]表明，SMAD4基因突變與預后不良和復發(fā)有關(guān)。AKT2基因負責調(diào)控代謝、細胞增殖、存活、生長和血管生成等多種生物學過程，其作為細胞內(nèi)PI3K/Akt通路的重要組成部分，通過一系列下游底物的絲氨酸和/或蘇氨酸磷酸化來介導信號級聯(lián)反應。AKT2可被血小板衍生生長因子激活，并調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。AKT2基因拷貝數(shù)增加可能導致蛋白過表達，抑制AKT2表達可降低胰腺癌細胞系的致瘤性[18-19]。研究[20-21]證明，AKT2與胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌等多種腫瘤的惡性特征及化療耐藥性有關(guān)。也有報道[22-23]稱，包括吉西他濱在內(nèi)的基因毒性化療藥物可誘導AKT2基因的高表達，而AKT2基因的高表達可導致腫瘤細胞對放化療不敏感。在本研究中，AKT2突變患者的生存時間和根治性切除及術(shù)后化療效果并未令人滿意。CTNNB1基因編碼多功能蛋白β-catenin，構(gòu)成細胞間的黏附連接(Ahers連接)。β-catenin在上皮細胞之間產(chǎn)生并相互連接，可以與APC蛋白結(jié)合，參與Wnt信號通路的調(diào)節(jié)。Wnt通路的激活在多種腫瘤中具有重要意義。腫瘤抑制基因的APC突變或β-catenin的β磷酸化位點突變可導致β-catenin在細胞內(nèi)積聚并持續(xù)激活Tcf/Lef靶基因，導致Wnt信號通路的異常激活，從而導致細胞生長失控和惡性轉(zhuǎn)化[24-26]。CTNNB1突變只出現(xiàn)在SPN和PNET中，PDAC中未發(fā)現(xiàn)CTNNB1突變。本研究數(shù)據(jù)也證實了這一點，但目前尚無針對CTNNB1突變的靶向藥物。

本研究共40例胰腺腫瘤患者，其中20例伴有神經(jīng)侵犯，突變基因前5位分別為KRAS、TP53、AKT2、CDKN2A和SMAD4；3例伴有血管侵犯，前2位突變基因為KRAS和TP53。KRAS和TP53的突變可能導致腫瘤神經(jīng)侵犯和血管侵犯，但由于樣本量較少，數(shù)據(jù)還需要進一步補充。本研究結(jié)果顯示，65%的患者至少有1個潛在的藥物靶點，包括ATM、BRCA1、BRCA2、BRAF、CDNK2A、CDK6、CTNNB1、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR3、FGFR4、NTRK3、PTEN、PIK3CA、VEGFA、YES1和PD-L1的表達。在靶向藥物的突變基因中，BRAF、BRCA1、CDK6、EGFR、ERBB3、ERBB4和FGFR3突變僅在男性患者中發(fā)現(xiàn)，而VEGFA突變僅在女性患者中發(fā)現(xiàn)。因此，可以推測VEGFA可能是女性胰腺癌患者的一個潛在的生物標志物。在現(xiàn)有的靶點中，僅CDKN2A的突變率>30%，大多數(shù)胰腺惡性腫瘤靶點的突變率都不高。由于突變率較低，一些胰腺惡性腫瘤靶向藥物難以獲得有效驗證，這也是胰腺惡性腫瘤突破性治療困難的原因之一。免疫療法已成為抗腫瘤治療的新熱點，尤其是PD-1和PD-L1抑制劑的問世，不僅在各種實體瘤治療中取得了豐碩的成果，在胰腺癌的治療方面也取得了一定的進展。本研究中40例患者均無TMB-H表達，僅1例PD-L1表達40%。據(jù)報道[27]，胰腺癌中TMB-H(TMB≥20muts/Mb)約為0.5%，提示目前與PD-1和PD-L1抑制劑療效相關(guān)的預測指標表達并不高。有研究[28]顯示，單藥PD-1和PD-L1抑制劑對胰腺癌的治療效果較差，培溴利珠單抗聯(lián)合NAB-紫杉醇和吉西他濱治療胰腺癌的療效高于單純化療。本研究對40例患者的生存時間進行了隨訪，并對不同突變基因進行了比較，但差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，可能需要積累更多的病例以進一步分析。

綜上，本研究通過對我國華東沿海地區(qū)40例胰腺癌患者的全基因序列分析，發(fā)現(xiàn)所有胰腺惡性腫瘤樣本均存在基因突變，且多為多點突變和多種類型突變。同時，所有患者都有不同的突變基因和突變位點。總體而言，本研究數(shù)據(jù)可能有助于為我國沿海地區(qū)胰腺癌的診斷、預后和治療策略，包括靶向及免疫治療提供一定的幫助，期待未來有更多的相關(guān)研究使其在胰腺癌的診治中發(fā)揮更大的作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：王晶、譚斌負責課題設計，資料分析，撰寫論文；趙志杰、仲灝辰參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；曲林林負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

附錄1見二維碼