鐘俊杰，李曉鏡，尹澤潤，盛浩，聶三安

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128）

稻田生態(tài)系統(tǒng)與人類關(guān)系密切。水稻是全球最大的糧食作物，養(yǎng)活了超過50%的人口。我國水稻種植面積占全國耕地總面積約25%，其產(chǎn)量約占全國糧食產(chǎn)量的1/2，水稻土是具有重大經(jīng)濟(jì)意義的土壤資源，其生產(chǎn)力的穩(wěn)定輸出對我國糧食生產(chǎn)和安全至關(guān)重要。湖南省是我國水稻的重要產(chǎn)區(qū)，其中紫泥田水稻土是湖南省的稻田土壤類型之一，其土壤黏粒含量較高、鹽基飽和度高、保水保肥能力較好、pH較低，某些地區(qū)重金屬鎘背景值較高。

土壤微生物是反映土壤質(zhì)量的敏感性指標(biāo)。土壤細(xì)菌是土壤微生物中占比最高的類群，具有繁殖周期短、數(shù)量多等特點，在土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。袁紅朝等發(fā)現(xiàn)紅壤性水稻土細(xì)菌優(yōu)勢種群為變形菌門和放線菌門，施肥和秸稈還田提高了變形菌種群豐度，土壤pH 和有機(jī)碳是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。黃泥田水稻土單施氮磷鉀降低了土壤細(xì)菌數(shù)目，影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子為鹽度、孔隙度和總氮，而土壤pH影響較小。黃棕壤性水稻土細(xì)菌優(yōu)勢種群為綠彎菌門、變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，有機(jī)肥對細(xì)菌群落α多樣性影響較小，但單施化肥能提高土壤細(xì)菌群落豐富度。可見，水稻土細(xì)菌群落受施肥和有機(jī)物料的影響，但其對農(nóng)藝措施改良鎘污染稻田時的響應(yīng)鮮有報道。

已有研究表明，鎘對土壤微生物組成與多樣性具有一定影響。隨著土壤鎘含量的增加及污染時間的延長，土壤微生物群落數(shù)量呈明顯減少趨勢，且高濃度鎘污染顯著抑制土壤微生物的生長；鎘含量和活性組分對物種群落具有較大影響，土壤細(xì)菌豐度和多樣性與鎘污染程度呈負(fù)相關(guān)。常用調(diào)控土壤鎘的農(nóng)藝措施有施石灰、施肥和土壤改良技術(shù)等。石灰可提高土壤pH，增加陽離子交換能力，降低土壤中交換態(tài)鎘含量；有機(jī)肥能夠提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，促進(jìn)土壤中的鎘由交換態(tài)向其他形態(tài)（如有機(jī)態(tài)）轉(zhuǎn)化；土壤調(diào)理劑能夠調(diào)節(jié)土壤的物理、化學(xué)和生物學(xué)性狀，活化礦質(zhì)養(yǎng)分，進(jìn)而降低鎘的有效性。然而，這些農(nóng)藝調(diào)控措施對紫泥田稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生何種影響及不同處理之間的差異情況還有待探索。

因此，本研究擬選擇位于湖南省的紫泥田水稻土，設(shè)置石灰、有機(jī)肥和土壤調(diào)理劑3 種處理方式，研究不同農(nóng)藝調(diào)控措施對紫泥田水稻土微生物群落組成、多樣性及群落物種差異，并分析菌群和環(huán)境因子之間的關(guān)系，研究結(jié)果可為紫泥田水稻土肥力保育與質(zhì)量演變提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地位于湖南省株洲市株洲縣紫泥田典型區(qū)域，該地區(qū)地貌為湘江中游典型低丘崗地，是典型的中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫17.5 ℃，年平均降雨量1 389 mm。試驗地土壤由紫色板、頁巖風(fēng)化物發(fā)育而來，屬于紫泥田土種，該土種占湖南省土壤面積的7.86%。該地區(qū)水稻種植超過50 a，長期精耕細(xì)作，種植制度為雙季稻?冬閑。農(nóng)田水利基礎(chǔ)設(shè)施良好，排灌方便。試驗區(qū)水稻土亞類為發(fā)育良好的潴育性水稻土，土壤剖面氧化還原交替作用強(qiáng)烈，土體構(gòu)型為典型A?P?W1?W2型，水耕熟化度高。供試土壤試驗前表層土（0~20 cm）的基本理化性質(zhì)見表1。

表1 試驗地0~20 cm表土的初始理化性質(zhì)Table 1 Initial physiochemical properties in the studied paddy field sites（0~20 cm）

1.2 試驗設(shè)計

試驗始于2015年3月，在所選種植樣區(qū)內(nèi)選擇形狀較為規(guī)整的9 塊稻田作為試驗田，每個試驗田面積0.1~0.3 hm，從中間隔開，分別設(shè)置對照組和處理組。共3 個處理，分別為商品有機(jī)肥、石灰和土壤調(diào)理劑，各處理3 次重復(fù)。有機(jī)肥采自長沙綠豐源生物有機(jī)肥料有限公司，主要原料為雞糞（有機(jī)質(zhì)含量≥45%、N+PO+KO≥5%），總鎘含量0.28 mg·kg；石灰CaO含量約為76%，總鎘含量0.26 mg·kg；土壤調(diào)理劑為無機(jī)型產(chǎn)品（N+PO+KO=8%、有效鈣≥20%、有效鎂≥12%），pH10~12，呈堿性，總鎘含量0.25 mg·kg。在早、晚稻翻耕時，人工施撒石灰、商品有機(jī)肥和土壤調(diào)理劑，其中商品有機(jī)肥和石灰用量為2.25 t·hm，土壤調(diào)理劑用量為3 t·hm。為防止串灌，各處理修筑獨立的排、灌水溝，耕作、水肥和病蟲害處理方式同大田生產(chǎn)。早稻品種為湘早秈17 號，種植密度為35×10株·hm；晚稻品種為天優(yōu)華占，種植密度為28×10株·hm。養(yǎng)分總投入量折算成純N、PO和KO后分別為142.5、30.0 kg·hm和87.0 kg·hm，其中基肥施用復(fù)合肥（N∶P∶K=18∶5∶7），用量為600 kg·hm，追肥為尿素和氯化鉀，均在分蘗期施用75 kg·hm。

1.3 樣品采集與分析

樣品采集于2020年10月，采用自制非金屬土鉆，采用“S”取樣法，在18 個小區(qū)內(nèi)采集耕層（0~20 cm）混合土壤樣品，每個小區(qū)5 個采樣點。土壤樣品帶回室內(nèi)，除去土壤異物，風(fēng)干后研磨，分別過10、60 目和100 目尼龍篩用于理化性質(zhì)指標(biāo)的測定。成熟期在各處理小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取5 個樣點采集耕層（0~20 cm）的新鮮土壤帶回室內(nèi)，迅速剔除礫石、動植物殘體等土壤異物，混勻后于冰箱（?20 ℃）中避光保存，用于土壤微生物指標(biāo)的測定。

土壤相關(guān)理化性質(zhì)分析參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》。其中，土壤pH 采用電位法（水土比=2.5∶1）測定；陽離子交換量（CEC）采用1 mol·L乙酸銨交換法測定；有效態(tài)鎘采用DTPA 浸提，火焰原子吸收分光光度計法測定；總鎘采用硝酸?鹽酸?高氯酸?氫氟酸消解，石墨爐原子吸收分光光度法測定；有機(jī)碳（SOC）采用高溫外加熱重鉻酸鉀氧化?容量法測定；全氮（TN）采用凱氏定氮法測定；全磷（TP）采用酸溶?鉬銻鈧比色法測定；土壤全鉀（TK）采用氫氧化鈉熔融法測定；土壤微生物量碳（MBC）采用氯仿薰蒸?KSO（0.5 mol·L）浸提法測定。

微生物組成、多樣性等指標(biāo)送至北京百邁客生物科技有限公司測定。首先用PowerSoil DNA 試劑盒（MoBio Laboratories，美國）提取土壤總DNA，用80 μL DES 溶解后，通過Agarose Gel DNA 試劑盒（Takara Bio Inc，日本）進(jìn)行純化，超微量紫外分光光度計Nanodrop ND?2000 進(jìn)行濃度檢測。采用16S V4 區(qū)515F和806R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并經(jīng)GeneJETGel Extraction 試劑盒（Thermo Scientific，美國）純化后進(jìn)行文庫構(gòu)建，質(zhì)檢合格的文庫用PacBio Sequel測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013 處理數(shù)據(jù)，用SPSS 23.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗（Duncan法）。細(xì)菌16S rRNA指標(biāo)從原始數(shù)據(jù)中導(dǎo)出CCS 序列進(jìn)行Barcode 識別，得到有效序列；質(zhì)控后的序列進(jìn)行OTU 劃分，對樣品在各個分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得各樣品在門分類學(xué)水平上的群落豐度圖；通過α多樣性分析研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，在97%相似度水平下進(jìn)行多樣性指數(shù)（Ace、Chao1、Shannon 及Simpson 指數(shù)）分析；通過β 多樣性分析比較不同樣品在物種多樣性方面（群落組成及結(jié)構(gòu)）存在的差異大小。主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）通過CANOCO 5.0（Microcomputer Power，Ithaca，美 國）進(jìn) 行 限 制 性 排序。高通量測序多樣性指數(shù)等在百邁客生物云平臺運(yùn)行（www.biomarker.com.cn）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同農(nóng)藝措施對土壤理化性質(zhì)的影響

由表2 可知，不同處理與相應(yīng)對照相比，僅石灰處理顯著提高了土壤pH（P＜0.05）。石灰、有機(jī)肥和調(diào)理劑處理CEC、有效態(tài)鎘、總鎘、SOC、TN、TP、MBC無顯著性差異，但石灰和調(diào)理劑處理pH 顯著高于有機(jī)肥處理；調(diào)理劑處理TK 含量顯著高于石灰和有機(jī)肥處理。以上結(jié)果表明，5 a 的農(nóng)藝調(diào)控措施在一定程度上改變了土壤主要理化性質(zhì)。

表2 不同處理土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physical and chemical properties of soil under different treatments

2.2 不同農(nóng)藝措施對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 細(xì)菌OTU豐度及多樣性

由表3可知，在相同的田間管理下，各對照細(xì)菌α多樣性指數(shù)具有一定的差異，說明紫泥田水稻土田塊的異質(zhì)性對細(xì)菌α 多樣性的影響較大。各處理和相應(yīng)對照之間細(xì)菌α 多樣性指數(shù)均無顯著差異。ACE和Chao1指數(shù)表現(xiàn)為有機(jī)肥＞石灰＞調(diào)理劑，且有機(jī)肥與調(diào)理劑處理之間的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；有機(jī)肥和石灰處理的土壤細(xì)菌Shannon 和Simpson 指數(shù)差異不顯著，但顯著高于調(diào)理劑處理。以上結(jié)果表明，與對照相比，不同處理并未顯著改變紫泥田水稻土細(xì)菌α 多樣性，但各處理之間影響不同，田塊本身的異質(zhì)性是造成細(xì)菌群落α多樣性差異的重要原因。

表3 不同處理土壤α多樣性指數(shù)（n=3）Table 3 Soil α diversity index of different treatments（n=3）

2.2.2 土壤細(xì)菌群落組成

根據(jù)土壤樣品OTU 中代表序列的物種注釋結(jié)果，選取相對豐度前10 的物種（門水平）生成柱狀圖（圖1）。石灰、有機(jī)肥和調(diào)理劑處理土壤細(xì)菌的主要菌群均為變形菌門（28.92%~43.15%）、酸桿菌門（6.40%~21.00%）、硝化螺旋菌門（5.18%~16.30%）、綠彎菌門（5.43%~16.48%）、擬桿菌門（4.03%~14.35%）和疣微菌門（4.45%~9.59%），累計相對豐度超過80%；另外還有相對豐度較低的浮霉菌門（1.61%~5.58%）、髕骨菌門（0.77%~6.28%）、芽單胞菌門（0.37%~3.48%）和己科河菌門（0.66%~2.50%）?？梢园l(fā)現(xiàn)，盡管各對照田間管理相對一致，但其土壤細(xì)菌的群落分布仍具有一定差異，說明田塊本身的異質(zhì)性對紫泥田水稻土細(xì)菌群落物種相對豐度的影響較大。與對照相比，有機(jī)肥和調(diào)理劑處理提高了酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度，但降低了變形菌門、硝化螺旋菌門及擬桿菌門的相對豐度；石灰處理提高了變形菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門相對豐度，但降低了綠彎菌門和擬桿菌門的相對豐度。從不同處理方式上看，變形菌門的相對豐度排序為石灰＞有機(jī)肥＞調(diào)理劑；酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度排序為有機(jī)肥＞調(diào)理劑＞石灰；硝化螺旋菌門和擬桿菌門的相對豐度排序為石灰＞調(diào)理劑＞有機(jī)肥。可見，施用石灰、商品有機(jī)肥和土壤調(diào)理劑對紫泥田水稻土的細(xì)菌群落組成產(chǎn)生了不同影響。

圖1 不同處理土壤微生物群落組成（門水平，n=3）Figure 1 Soil microbial community composition under different treatments（Phylum，n=3）

2.2.3 各處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的PCA聚類分析

基于OTU 分類水平，采用PCA 聚類分析研究不同處理對紫泥田水稻土細(xì)菌β 多樣性的影響。根據(jù)各組對照和處理的結(jié)果（圖2a），主成分1（PC1）與主成分2（PC2）對各處理土壤細(xì)菌群落差異的解釋程度分別為44.27%和15.07%，合計59.34%?？梢钥闯?，盡管各對照田間管理相對一致，但其土壤細(xì)菌的群落分布仍具有一定差異，說明紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受田塊本身異質(zhì)性的影響。從不同處理方式上看，調(diào)理劑處理與石灰和有機(jī)肥處理差異較大，且與對照相比具有一定差異；石灰和有機(jī)肥處理較為相近，說明石灰和有機(jī)肥處理后，紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。從對照組和處理組看（圖2b），對照組和處理組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相差較大，說明經(jīng)石灰、有機(jī)肥和土壤調(diào)理劑處理后，紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化。

圖2 不同處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)β多樣性分析結(jié)果Figure 2 β diversity analysis results of soil microbial community composition in different treatments

2.2.4 土壤細(xì)菌群落的RDA分析

由圖3可知，RDA 分析中，第一排序軸（RDA1）和第二排序軸（RDA2）分別解釋25.16%和6.69%的變異。蒙特卡羅檢驗顯示，pH（=0.012）與TK（=0.028）對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變效應(yīng)顯著（＜0.05），CEC、TP、有效態(tài)鎘、TN、MBC 和SOC 對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變效應(yīng)不顯著（＞0.05）。在第一軸上，調(diào)理劑和調(diào)理劑對照細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與pH、TK、CEC 和TP 呈正相關(guān)關(guān)系。有機(jī)肥處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)土壤理化因子集中分布在第一排序軸負(fù)半軸，它們的相關(guān)性依次為有效態(tài)鎘、TN、MBC 和SOC。石灰、石灰對照和有機(jī)肥對照細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與已選取的理化因子相關(guān)性較小。由以上可知，pH 和TK 為紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子。

圖3 不同處理土壤微生物群落特征與環(huán)境因子的RDA排序圖（屬水平，n=3）Figure 3 RDA ranking diagrams of soil microbial community characteristics and environmental factors under different treatments（Genus level，n=3）

3 討論

3.1 不同農(nóng)藝措施對土壤菌群組成、結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

細(xì)菌多樣性受土壤多種因素的影響。由于稻田生態(tài)系統(tǒng)受人為因素影響較大，田間土壤異質(zhì)性在很大程度上影響了細(xì)菌α多樣性。本研究中，細(xì)菌多樣性分析結(jié)果表明，不同對照、對照與處理之間細(xì)菌α 多樣性發(fā)生了不同程度的變化，但總體上有機(jī)肥和調(diào)理劑處理提高了細(xì)菌α 多樣性。施用有機(jī)肥調(diào)控土壤pH 和可利用碳/氮源，在一定程度上能夠提高土壤微生物對碳源的利用能力，提高其代謝多樣性，進(jìn)而提高細(xì)菌α 多樣性。土壤調(diào)理劑中的有機(jī)質(zhì)可為微生物生命活動提供能源物質(zhì)，也會影響微生物的代謝活動。本研究發(fā)現(xiàn)施用石灰降低了細(xì)菌α 多樣性。石灰本身對土壤具有一定的滅菌作用，且提高土壤pH 也可能會對原有微生物的生長造成影響；同時，長期施入石灰加速土壤有機(jī)質(zhì)分解，腐殖質(zhì)不易積累，致使土壤結(jié)構(gòu)變壞，造成土壤板結(jié)，從而對微生物的生長不利。因此，不同農(nóng)藝調(diào)控措施對紫泥田水稻土細(xì)菌群落多樣性的影響不同，且受田塊異質(zhì)性影響較大。

高通量測序表明，3 種處理紫泥田水稻土細(xì)菌主要為變形菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和疣微菌門，這些是供試紫泥田水稻土的優(yōu)勢菌群，這與劉昌等對黃泥土的研究結(jié)果相似，說明這些細(xì)菌在土壤養(yǎng)分循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用。有機(jī)肥和調(diào)理劑處理中綠彎菌門的相對豐度高于對照，原因可能是有機(jī)肥和調(diào)理劑的輸入增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量，有利于綠彎菌門的繁殖。王立夫等研究表明變形菌門豐度與pH 呈正相關(guān)，綠彎菌門豐度與pH 呈負(fù)相關(guān)。蘭玉書等發(fā)現(xiàn)施用石灰降低了綠彎菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度。本研究發(fā)現(xiàn)，石灰處理變形菌門相對豐度有所提高，而有機(jī)肥和調(diào)理劑處理變形菌門相對豐度低于對照，可能原因是有機(jī)肥和調(diào)理劑處理提高了SOC 含量，而較高SOC 含量提高了某些微生物與變形菌門的競爭，從而不利于變形菌門的生長和繁殖。然而，石灰處理SOC 增加較少，且土壤pH 顯著增加，較高的pH 可能有利于變形菌門的生長。酸桿菌門在pH 較高的環(huán)境中生存困難，但本研究中3 種農(nóng)藝措施處理后土壤酸桿菌門相對豐度較對照均有所提高，這很可能是因為pH 不是影響其生長的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門的豐度與土壤理化性質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，本研究3 種處理均一定程度上提高了土壤理化性質(zhì)，擬桿菌門的相對豐度均低于對照，說明石灰、有機(jī)肥和調(diào)理劑的施入不利于擬桿菌門的生長和繁殖。主成分分析發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藝調(diào)控措施能夠改變紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。添加石灰、有機(jī)肥和復(fù)合調(diào)理劑可提高土壤肥力水平，增加有機(jī)質(zhì)含量，改變土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)。綜上，農(nóng)藝調(diào)控措施可以改變紫泥田水稻土細(xì)菌群落組成。

3.2 土壤理化性狀與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

土壤理化性質(zhì)和重金屬等環(huán)境因素會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)土壤pH 和TK 與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。相關(guān)研究也表明pH是影響土壤細(xì)菌群落的重要環(huán)境因子，土壤pH 的變化會影響某些微生物（如酸桿菌門）的生長和代謝活動。本研究中，不同處理改變了酸桿菌門的相對豐度，且有機(jī)肥處理高于石灰和調(diào)理劑處理，可能原因是酸桿菌為嗜酸菌，本研究中石灰處理和調(diào)理劑處理的pH顯著高于有機(jī)肥處理，較高的pH可能在一定程度上抑制了酸桿菌門的生長。土壤TK也是影響紫泥田微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素。有研究表明，鉀含量與植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，鉀能夠提高赤紅壤微生物活性，進(jìn)而改變微生物群落結(jié)構(gòu)，由于不同處理鉀含量差別較大（表2），進(jìn)而可能對土壤微生物群落產(chǎn)生不同影響。

本研究著重研究石灰、商品有機(jī)肥和土壤調(diào)理劑對鎘污染紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，在一定范圍內(nèi)揭示了紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對不同處理的響應(yīng)機(jī)制?；诂F(xiàn)代的微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，如宏基因組文庫技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)及Biolog?ECO 微平板法等將有助于深入闡明稻田微生物對農(nóng)藝調(diào)控措施的響應(yīng)。由于土壤系統(tǒng)的復(fù)雜性和異質(zhì)性，對細(xì)菌與土壤關(guān)鍵因子的響應(yīng)機(jī)制有待深入研究。

4 結(jié)論

（1）紫泥田水稻土壤細(xì)菌優(yōu)勢種群為變形菌門和酸桿菌門；石灰、商品有機(jī)肥和土壤調(diào)理劑處理均能提高酸桿菌門的相對豐度；石灰處理增加了變形菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度，但降低了綠彎菌門的相對豐度。

（2）3 種農(nóng)藝調(diào)控措施對土壤細(xì)菌α 多樣性無顯著影響，但改變了細(xì)菌β多樣性。施用石灰和有機(jī)肥處理的土壤細(xì)菌OTU 數(shù)目和α 多樣性顯著高于土壤調(diào)理劑處理。

（3）土壤pH 和全鉀是影響紫泥田水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因子。