賈斌，庾旸，馬海川，陳以芹*，李娟英

（1.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；2.上海中學(xué)東校，上海 201306）

近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們?cè)絹碓街匾暯】悼茖W(xué)的飲食結(jié)構(gòu)。水產(chǎn)品中含有豐富的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是人類主要的高蛋白食物之一。隨著水產(chǎn)品產(chǎn)量的穩(wěn)定增長(zhǎng)，我國(guó)已成為世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)。雖然我國(guó)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用進(jìn)行管控，但實(shí)際密集養(yǎng)殖中，抗生素顯著的抗菌能力和低副作用使其成為水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治的常用藥物。然而研究發(fā)現(xiàn)只有20%~30%的抗生素能被水產(chǎn)品吸收和利用，剩余的殘留在養(yǎng)殖水體或蓄積到底泥中的抗生素，不僅會(huì)改變環(huán)境中的微生物區(qū)系，對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力誘導(dǎo)抗生素抗性基因的產(chǎn)生，還會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖產(chǎn)品中殘留藥物通過食物鏈傳播，從而對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在的威脅。

同期研究發(fā)現(xiàn)，人體尿液中抗生素的檢測(cè)頻率較高，人群已經(jīng)暴露于多種人用或獸用抗生素。尿液抗生素是潛在的人體暴露的生物標(biāo)志物，基于尿液中抗生素的代謝物濃度可估算每日暴露總量。將水產(chǎn)養(yǎng)殖食品中抗生素的每日攝入量與估算的每日總暴露量進(jìn)行比較，即可量化通過食用水產(chǎn)品暴露途徑的相對(duì)貢獻(xiàn)，從而評(píng)估食用水產(chǎn)品是否為人體抗生素主要途徑。因此，本研究的具體研究目標(biāo)包括：（1）評(píng)估我國(guó)長(zhǎng)三角地區(qū)淡水水產(chǎn)品肌肉中抗生素的殘留量；（2）估算通過水產(chǎn)品攝入抗生素的每日暴露量，并根據(jù)尿液中的抗生素殘留估算抗生素的每日總攝入量；（3）確定食用水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品對(duì)不同人群（兒童、成人、孕婦）的抗生素每日總暴露量的貢獻(xiàn)范圍，為人們的合理膳食提供科學(xué)數(shù)據(jù)，同時(shí)為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展提供管理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)藥劑

基于所研究的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域中抗生素的檢測(cè)頻率，選擇了9 種目標(biāo)抗生素，其中磺胺甲嘧啶（SMZ）、磺胺甲惡唑（SMX）、磺胺嘧啶（SDZ）、恩諾沙星（EFX）、諾氟沙星（NFX）、氧氟沙星（OFX）、環(huán)丙沙星（CFX）和甲氧芐啶（TMP）購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH（德國(guó)），羅紅霉素（RTM）購(gòu)自Sigma?Aldrich（美國(guó)）。內(nèi)標(biāo)磺胺嘧啶（SMR）購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH（德國(guó)），環(huán)丙沙星?D（CFX?D）和紅霉素?C ?D（ETM?C?D）購(gòu)自多倫多研究化學(xué)公司（加拿大）。SMR 作為SDZ、SMZ、SMX 和TMP 的內(nèi)標(biāo)，CFX?D作為NFX、CFX、OFX 和EFX 的內(nèi)標(biāo)，ETM?C?D作為RTM 的內(nèi)標(biāo)。HPLC 級(jí)的甲醇、乙腈、甲酸和乙酸銨購(gòu)自Sigma?Aldrich（美國(guó)）。乙二胺四乙酸為分析純，購(gòu)自耀華化學(xué)試劑廠（中國(guó)）。檸檬酸和檸檬酸鈉為分析純，購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，Oasis HLB SPE 萃取柱（6 mL，200 mg）和SMX 柱（6 mL，500 mg）購(gòu)自Varian（美國(guó)）。

1.2 樣品采集

本研究采集了我國(guó)上海、浙江、江蘇、安徽、福建5 個(gè)地區(qū)（圖1）淡水養(yǎng)殖池塘中常見的3 大類共21 份水產(chǎn)品，其中魚類包括草魚（）、鰱魚（）、武昌魚（）、鱸魚（）、鳙魚（）、黑魚（）、鯉魚（）；蟹類包括中華絨螯蟹（）；蝦類包括羅氏沼蝦（）。生物樣品基本信息見表1。采集的樣品均為即將上市的水產(chǎn)品。樣品用鋁箔袋密封包裝后低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，冷凍干燥并置于?20 ℃冰箱保存。

表1 生物樣品基本信息Table 1 Basic information of marine organisms

圖1 采樣點(diǎn)分布圖Figure 1 The sampling sites of this study

1.3 樣品預(yù)處理及檢測(cè)

取2 g預(yù)先冷凍干燥并研磨過篩的生物肌肉樣品于30 mL的玻璃離心管中，向離心管中依次加入10 mL檸檬酸鈉緩沖溶液、10 mL 乙腈和10 μL 的3 種內(nèi)標(biāo)品。依次振蕩10 min、超聲15 min、離心15 min（3 000 r·min）。重復(fù)3次并收集上清液至200 mL的圓底燒瓶中。將圓底燒瓶在50 ℃的恒溫加熱板上進(jìn)行蒸發(fā)，并用超純水稀釋至200 mL 使得溶液中的有機(jī)溶劑含量低于5%。將溶液通過SAX 柱和SPE 柱串聯(lián)萃取，洗脫并氮吹，最后用乙酸銨溶液定容至200 μL，經(jīng)0.22 μm 針頭式濾膜過濾樣品至2 mL 棕色進(jìn)樣瓶中。

采用LC?MS/MS（Agilent 液相色譜1200 系列LC系統(tǒng)和Agilent 6460 TSQ Quantum LC?MS，美國(guó)）進(jìn)行分析。色譜條件：Agilent Plus?C18 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃；流動(dòng)相A 為0.2%甲酸和2 mmol·L乙酸銨水溶液，B為乙腈溶液；流速為0.3 mL·min。質(zhì) 譜 條 件：離 子 源 為 電 噴 霧 電 離（ESI+）；毛細(xì)管電壓3.5 kV；離子源溫度120 ℃；氣體溫度325 ℃，流速6 L·min；霧化器壓力310 kPa；錐孔氣流速11 L·min；檢測(cè)模式為MRM。

1.4 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

通過食用魚、蝦和蟹類3 種常見的水產(chǎn)品，人體每日抗生素?cái)z入量（Estimated daily intake，）的計(jì)算公式如下：

式中：為人體抗生素日攝入量，μg·kg·d；為水產(chǎn)品中的抗生素含量，g·g（魚類的含水量為70%、蝦類為80%、螃蟹類為75%）；為水產(chǎn)品的每日攝入率，g·kg·d。水產(chǎn)品的每日消費(fèi)量數(shù)據(jù)基于文獻(xiàn)[14]。具體而言，兒童魚、蝦、蟹水產(chǎn)品攝入量分別為0.71、0.13、0.59 g·kg·d；成人魚、蝦、蟹水產(chǎn)品攝入量分別為1.20、0.22、1.00 g·kg·d，孕婦魚、蝦、蟹水產(chǎn)品攝入量分別為1.07、0.20、0.89 g·kg·d。

根據(jù)尿液中相應(yīng)的抗生素的濃度，用公式（2）計(jì)算通過所有可能的暴露途徑估計(jì)的抗生素的每日攝入量（Daily exposure dose，）：

式中：為抗生素日暴露量，μg·kg·d；為尿液中抗生素的濃度，μg·mL，數(shù)據(jù)來源為涉及上海435名3~18歲健康兒童、我國(guó)東部地區(qū)854名16~42歲的健康孕婦、上海822 名20~75 歲的健康成年人尿液抗生素?cái)?shù)據(jù)的3 份已有研究；為平均每日尿量，24 mL·kg·d，孕 婦 平 均 每 日 尿 量 為21 mL·kg·d；為抗生素的排泄比例（未改變和呈葡萄糖醛酸結(jié)合形式，表2）。尿液抗生素低于檢出限時(shí)，按照檢出限（LOD）的1/2值計(jì)算。

表2 未改變和呈葡萄糖醛酸結(jié)合形式的尿液中9種抗生素的排泄率[18]（%）Table 2 Excretion proportions of 9 antibiotics in urine as unchanged and glucuronide?conjugated species（%）

人體總抗生素暴露的貢獻(xiàn)率（）計(jì)算如公式（3）所示：

1.5 質(zhì)量控制與保證

生物樣品的回收率為68%~105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，檢出限為0.015~0.016 ng·g（干質(zhì)量），同時(shí)設(shè)定2個(gè)空白樣和2個(gè)平行樣。

2 結(jié)果和討論

2.1 水產(chǎn)品中抗生素殘留特征

本研究中9 種目標(biāo)抗生素均有檢出（表3），檢出頻率在38.1%（磺胺嘧啶）~90.5%（恩諾沙星）之間?？股卦谒a(chǎn)品中的平均濃度順序?yàn)榛前芳讗哼颍径髦Z沙星＞磺胺嘧啶＞諾氟沙星＞氧氟沙星＞甲氧芐啶＞羅紅霉素＞磺胺甲嘧啶＞環(huán)丙沙星。其中磺胺甲惡唑的檢出濃度最高，為25.25 ng·g（以干質(zhì)量計(jì)），其次是恩諾沙星，為17.65 ng·g（以干質(zhì)量計(jì)），比其他檢測(cè)到的抗生素濃度高2~4個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能與不同養(yǎng)殖品種使用的抗生素種類和劑量不同有關(guān)。除羅紅霉素沒有最大殘留限量值外，其余8 種抗生素的檢出值均低于《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》（NY 5070—2002）和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中的最大殘留限量（MRL）。

表3 淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)品中抗生素的濃度和檢出率（n=21）Table 3 Concentration and detection rate of antibiotics in freshwater aquaculture products（n=21）

魚、蝦和蟹3 種水產(chǎn)品抗生素的平均濃度分別為4.27、4.56 ng·g和0.56 ng·g（圖2），魚類和蝦類體內(nèi)抗生素殘留濃度較高，可能是由于蟹類的生長(zhǎng)和攝食條件優(yōu)于魚類和蝦類，不易感染疾病，養(yǎng)殖過程中抗生素使用量較少。此外抗生素的濃度還受到許多其他因素的影響，例如性別、生長(zhǎng)階段以及飼料抗生素添加劑的停藥期等，這還有待進(jìn)一步研究。恩諾沙星和磺胺甲惡唑是魚類檢出的主要抗生素，對(duì)總抗生素濃度的貢獻(xiàn)分別為63.6%和20.7%；磺胺甲惡唑是蝦類檢出的主要抗生素，對(duì)總抗生素濃度的貢獻(xiàn)為79.7%；恩諾沙星是蟹類檢出的主要抗生素，對(duì)總抗生素濃度的貢獻(xiàn)為32.6%。綜上所述，恩諾沙星和磺胺甲惡唑是本研究水產(chǎn)品檢出的主要抗生素，這可能是因?yàn)槎哂袕V泛的抗菌譜，一般用于防治因弧菌和嗜水氣單胞菌引起的魚、蝦和蟹的細(xì)菌性疾病，并且具有良好的環(huán)境遷移能力及化學(xué)穩(wěn)定性，不易發(fā)生降解和吸附。進(jìn)一步分析不同品種魚類之間的抗生素平均濃度的差異（圖3），發(fā)現(xiàn)本研究濾食性魚類所有抗生素的濃度均低于飼料投喂魚類。但由于本研究樣本數(shù)量較少，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)一步研究分析二者的差異。為了研究生物因素對(duì)水產(chǎn)品抗生素分布的影響，將魚、蝦和蟹類的體長(zhǎng)和體質(zhì)量與抗生素濃度進(jìn)行相關(guān)性分析（表4），結(jié)果表明水產(chǎn)品的體長(zhǎng)和體質(zhì)量與抗生素的分布沒有顯著相關(guān)性（＞0.05）。受限于該研究的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，所得結(jié)果受多種因素的影響，例如飼料、魚齡、水產(chǎn)品雌雄等，這些有待后續(xù)進(jìn)一步研究分析。

表4 水產(chǎn)品抗生素殘留與其體長(zhǎng)和體質(zhì)量的相關(guān)性Table 4 Correlation between antibiotic residues in aquatic products and body length and weight

圖2 水產(chǎn)品（魚、蝦、蟹）中抗生素的殘留濃度Figure 2 Concentration of antibiotics in three aquatic products of fish，shrimp and crab

圖3 不同魚類中抗生素的濃度Figure 3 Concentration of antibiotics in different fishes

2.2 水產(chǎn)品抗生素殘留濃度的比較分析

為全面了解淡水養(yǎng)殖產(chǎn)品中抗生素殘留情況，將本研究的數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)中我國(guó)淡水養(yǎng)殖、海水養(yǎng)殖與市場(chǎng)購(gòu)入水產(chǎn)品抗生素濃度進(jìn)行了比較分析（圖4）。CHEN 等在對(duì)廣州淡水養(yǎng)殖區(qū)的研究中發(fā)現(xiàn)，磺胺甲惡唑和環(huán)丙沙星的檢出頻率最高，達(dá)到48%，恩諾沙星殘留量最高，高出其他抗生素2 個(gè)數(shù)量級(jí)，約為2 200 ng ·g。YU 等對(duì)長(zhǎng)江下游魚類抗生素殘留的研究發(fā)現(xiàn)，磺胺甲惡唑是最常見的抗生素，檢出頻率為23.7%；檢出濃度最高的磺胺嘧啶濃度為1 261.01 ng·g。ZHOU 等在對(duì)太湖地區(qū)水產(chǎn)品的研究中發(fā)現(xiàn)，殘留水平最高的環(huán)丙沙星濃度為32.8 ng·g；CHEN 等對(duì)南方海陵島周圍海水養(yǎng)殖場(chǎng)水產(chǎn)品的研究發(fā)現(xiàn)，磺胺嘧啶的檢出濃度最高為2.3 ng·g?？傮w而言，本研究的抗生素濃度偏低或與其他研究水平相當(dāng)。

圖4 本研究水產(chǎn)品抗生素濃度（中位數(shù)和范圍）與其他研究比較Figure 4 Comparisons between the concentration of antibiotics in aquatic products（median and range）in this study and other studies

2.3 水產(chǎn)品中殘留抗生素的人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

2.3.1 水產(chǎn)品的食用安全性

假定烹飪過程不會(huì)顯著影響水產(chǎn)品中抗生素的含量，根據(jù)最大風(fēng)險(xiǎn)控制原則，分別使用魚、蝦、蟹3 類水產(chǎn)品中每種抗生素的最大檢測(cè)濃度計(jì)算水產(chǎn)品的，以評(píng)估“最壞的情況”，9 種抗生素的范圍為7.7×10~6.5×10μg·kg·d（表5）。將與人體可接受的每日攝入量（）進(jìn)行比較，判斷水產(chǎn)品的攝入風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明水產(chǎn)品抗生素的值遠(yuǎn)小于值，均低2~5 個(gè)數(shù)量級(jí)，說明食用長(zhǎng)三角地區(qū)水產(chǎn)品不存在健康風(fēng)險(xiǎn)。

表5 食用水產(chǎn)品估計(jì)的抗生素的每日攝入量（EDI）及相關(guān)的每日可接受攝入量（ADI）（μg·kg?1·d?1）Table 5 Estimated daily intake（EDI）of antibiotics from aquatic products and related acceptable daily intake（ADI）（μg·kg?1·d?1）

2.3.2 水產(chǎn)品消費(fèi)對(duì)人體抗生素暴露的貢獻(xiàn)分析

根據(jù)尿液抗生素濃度的最低和最高值估算，并通過公式（3）估算了水產(chǎn)品消費(fèi)對(duì)我國(guó)長(zhǎng)三角地區(qū)3 類人群（兒童、成人和孕婦）人體總暴露的最低和最高貢獻(xiàn)率（），結(jié)果見表6。結(jié)果表明，Σ 抗生素的貢獻(xiàn)率范圍為＜0.01%~29.77%。其中Σ 磺胺類貢獻(xiàn)率為＜0.01%~7.56%，Σ 喹諾酮類貢獻(xiàn)率為＜0.01%~20.93%，Σ 大環(huán)內(nèi)酯類貢獻(xiàn)率為＜0.01%~29.77%，后兩者有較高的貢獻(xiàn)率?；前奉惪股貙?duì)人體抗生素暴露貢獻(xiàn)率最低，盡管其在水產(chǎn)品中的檢出濃度較高（表3）。這可能是因?yàn)楸狙芯克x擇的磺胺類抗生素為優(yōu)先獸用抗生素，其作為飼料添加劑用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和預(yù)防疾病，或作為獸藥用于感染治療，人群接觸此類抗生素的來源更有可能為其他肉類食品而非水產(chǎn)品，例如，2015 年對(duì)寧波豬肉抗生素殘留的研究發(fā)現(xiàn)，最大磺胺類殘留為194.8 ng·g，高出本研究最大殘留濃度2 個(gè)數(shù)量級(jí)。喹諾酮類抗生素為本研究水產(chǎn)品主要抗生素殘留之一，對(duì)人體暴露貢獻(xiàn)率較高。這可能是因?yàn)猷Z酮類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、安全性高、價(jià)格低廉、毒副作用低等特性，因此被用于魚類細(xì)菌性疾病的防治，但隨著對(duì)其在環(huán)境中的殘留和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究的不斷深入，很多喹諾酮抗生素已逐漸被我國(guó)歸為食品動(dòng)物生產(chǎn)過程中的禁用藥物。本研究所選擇的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素羅紅霉素不作為獸用抗生素，人群主要暴露來源可能為臨床用藥，且濃度低于其他抗生素1~7個(gè)數(shù)量級(jí)，因此水平較低，但即使水產(chǎn)品檢出濃度范圍較低，也可能導(dǎo)致對(duì)人體較高的貢獻(xiàn)率。此外，對(duì)于不同人群，3 類抗生素對(duì)孕婦的暴露貢獻(xiàn)最高。這可能是因?yàn)樵袐D對(duì)水產(chǎn)品攝入有更高的營(yíng)養(yǎng)需求，導(dǎo)致其具有最高的，同時(shí)，孕婦比其他人群更關(guān)注藥物安全，從而更謹(jǐn)慎地選擇藥物，導(dǎo)致其水平較低。

表6 淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)品消費(fèi)對(duì)3組人群抗生素暴露的貢獻(xiàn)率（CR，%）Table 6 Contribution rate of freshwater aquaculture product consumption to antibiotic exposure in three groups（CR，%）

本研究在得出結(jié)論的同時(shí)也存在以下局限性：首先，本研究假設(shè)烹飪水產(chǎn)品不會(huì)顯著影響其抗生素含量，未考慮烹飪過程對(duì)抗生素降解的影響，這很可能會(huì)高估水產(chǎn)品中抗生素的每日攝入量。其次，一次的尿液收集不能捕獲所有的抗生素暴露，特別是半衰期短的抗生素，這可能低估了抗生素的總暴露。為了解決這些問題，在未來的研究中應(yīng)該加強(qiáng)烹飪過程對(duì)水產(chǎn)品抗生素殘留影響的研究，并增加更多時(shí)間點(diǎn)的尿液抗生素樣品采集，以了解人體對(duì)抗生素的長(zhǎng)期接觸情況?？傮w而言，食用水產(chǎn)品不會(huì)造成顯著的健康風(fēng)險(xiǎn)，但可能會(huì)導(dǎo)致低劑量多種抗生素的混合暴露，而現(xiàn)有一些研究表明低劑量抗生素對(duì)人體健康也會(huì)產(chǎn)生不良影響，例如尿液中的一些低水平抗生素可能與兒童肥胖有關(guān)。因此今后仍需加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品中抗生素殘留的研究。

3 結(jié)論

（1）9 種目標(biāo)抗生素在我國(guó)長(zhǎng)三角主要省區(qū)淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)品中均被檢出，但其濃度水平顯著低于最大殘留限量值，其中恩諾沙星和磺胺甲惡唑是濃度較高的抗生素。

（2）水產(chǎn)品中殘留抗生素估算的每日攝入量遠(yuǎn)小于可接受的每日攝入量，在正常情況下食用本研究地區(qū)養(yǎng)殖的水產(chǎn)品不會(huì)對(duì)人體健康造成威脅。

（3）基于尿液中抗生素代謝濃度回推人體抗生素總暴露量，評(píng)估水產(chǎn)品消費(fèi)帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)率的結(jié)果表明，喹諾酮類抗生素可能具有較高的人體健康風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)，但后續(xù)應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)降低結(jié)果變異性的相關(guān)研究，進(jìn)而更準(zhǔn)確地評(píng)估抗生素暴露的風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)。