蘇瑀晗，曹紅亭，孫祖越，周 莉，周 健，汪 嶺，李曉玉，宋琦如

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室，上海 200032）

林丹（又稱γ-六六六）是有機(jī)氯農(nóng)藥六六六的γ異構(gòu)體，也是國(guó)際上公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1]，曾被廣泛用于除草劑和殺蟲劑。目前，林丹雖禁止用于農(nóng)業(yè)用途，但仍被用作疥瘡和虱子的藥物治療，且由于其高脂溶性、難降解、易殘留等特點(diǎn)，至今仍能在土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)中檢測(cè)到林丹殘留[2-3]，林丹的特性也導(dǎo)致它們?cè)诃h(huán)境中持久存在，并通過食物鏈的生物放大作用在人體內(nèi)蓄積[4-5]。因此，環(huán)境中殘留的低水平林丹仍有可能對(duì)人體和環(huán)境產(chǎn)生不良影響。研究[6-7]表明，林丹等有機(jī)氯農(nóng)藥會(huì)對(duì)生殖激素的分泌及代謝產(chǎn)生影響，導(dǎo)致生殖功能紊亂。林丹還具有內(nèi)分泌干擾作用，可能與女性子宮內(nèi)膜異位癥、子宮癌、卵巢癌發(fā)生的增加有關(guān)。林丹殘留具有潛在危害，因此研究環(huán)境中殘留的低水平林丹對(duì)生殖毒性的作用具有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)旨在研究低水平林丹暴露對(duì)于雌性成年大鼠體質(zhì)量、器官系數(shù)、雌性激素分泌水平以及卵巢及子宮形態(tài)的影響，探討林丹對(duì)雌性生殖器官形態(tài)及功能的綜合影響，為評(píng)價(jià)林丹的毒理學(xué)作用及環(huán)境中林丹殘留對(duì)人類生殖系統(tǒng)潛在危害提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑與儀器 林丹（批號(hào)：C14073000，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、雌二醇（貨號(hào)：mx1704091，北京biotopped公司）、玉米油（市售）、10%水合氯醛（貨號(hào)：mx150204，北京索萊寶公司）、多聚甲醛固定液（上海尚寶生物科技有限公司）、孕酮（P）試劑盒（貨號(hào)：XYR9700821，上海大實(shí)驗(yàn)室）、促性腺激素釋放激素（GnRH）試劑盒（貨號(hào)：mx175223，上海大實(shí)驗(yàn)室）、卵泡刺激素（FSH）試劑盒（貨號(hào)：mx1653，上海大實(shí)驗(yàn)室）。離心機(jī)（上海Heal force公司）、圖像采集系統(tǒng)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、分析天平（瑞士Mettler Toedo公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康清潔級(jí)周齡雌性SD大鼠45只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（寧）2020-0001。各組大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～24℃，相對(duì)濕度為60%～80%，自由攝食進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及染毒 實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)化原則分為5組（n=9）。依據(jù)陳心悅等[8]的研究（我國(guó)七大水系沉積物中林丹殘留濃度約為2μg·g-1）將實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)為林丹低劑量組（3 mg·kg-1，1/40LD50）、中劑量組（6 mg·kg-1，1/20LD50）、高劑量組（13 mg·kg-1，1/10LD50）。參考曹紅亭等[7]、宋琦如等[9]文獻(xiàn)，將雌二醇設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組（100μg·kg-1）、玉米油設(shè)為溶劑對(duì)照組（10 mg·kg-1），將林丹及雌二醇溶于玉米油配制成相應(yīng)溶劑，每天經(jīng)口灌胃染毒1次，連續(xù)染毒8周。

1.2.2 體質(zhì)量及器官系數(shù)測(cè)定 大鼠處死前稱重，10%水合氯醛麻醉后處死。無菌條件下，剖腹取子宮和卵巢，剔除脂肪組織，將分離的組織于生理鹽水中洗凈、濾紙吸干，記錄器官濕重，計(jì)算器官系數(shù)。器官系數(shù)的計(jì)算公式：器官系數(shù)（%）=器官濕重（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.3 血清性激素水平的測(cè)定 染毒末，稱量體質(zhì)量，依據(jù)體質(zhì)量計(jì)算10%水合氯醛麻醉劑量。麻醉后開胸腔取心尖血，經(jīng)3 500 r·min-1離心10 min后，取上清液置于－80℃保存。使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)血清中GnRH、FSH、P水平，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 子宮和卵巢組織病理學(xué)觀察 將離體的大鼠子宮及兩側(cè)卵巢于4%多聚甲醛固定液中放置24 h后，經(jīng)脫水、包埋，行5μm切片，HE染色后置于光鏡下觀察其組織形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)大鼠死亡現(xiàn)象。溶劑對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好、被毛光滑、食欲較好、無異?，F(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)組大鼠隨染毒時(shí)間增加出現(xiàn)煩躁、被毛凌亂失去光澤等現(xiàn)象，高劑量組表現(xiàn)尤為明顯；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠也出現(xiàn)煩躁不安、被毛凌亂等現(xiàn)象，程度與林丹高劑量組相似。

2.2 體質(zhì)量

林丹各劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；林丹低劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量與溶劑對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但林丹中、高劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量均低于溶劑對(duì)照組（P均＜0.05），見表1。

表1 林丹暴露對(duì)雌性大鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）

表1 林丹暴露對(duì)雌性大鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）

與溶劑對(duì)照組比較△P＜0.05。

組別 n 初體質(zhì)量 終體質(zhì)量 體質(zhì)量增長(zhǎng)量低劑量組 9 216.29±11.08 254.51±15.74 38.22±13.90中劑量組 9 214.41±10.38 248.14±15.00 33.67±7.55△高劑量組 9 212.44±12.89 250.30±25.95 37.30±16.79△陽(yáng)性對(duì)照組 9 214.83±11.90 250.90±19.05 36.07±13.77△溶劑對(duì)照組 9 217.40±10.47 266.87±22.13 49.47±14.91

2.3 卵巢及子宮器官系數(shù)

林丹各劑量組大鼠子宮、卵巢質(zhì)量及子宮、卵巢系數(shù)與溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表2。

表2 林丹暴露對(duì)雌性大鼠子宮及卵巢系數(shù)的影響（±s）

表2 林丹暴露對(duì)雌性大鼠子宮及卵巢系數(shù)的影響（±s）

組別 n 子宮質(zhì)量/g 子宮系數(shù)/% 卵巢質(zhì)量/g 卵巢系數(shù)/%低劑量組 9 0.7 186±0.161 0.2 863±0.075 0.1 900±0.036 0.0 755±0.013中劑量組 9 0.7 675±0.161 0.3 075±0.071 0.1 938±0.067 0.0 769±0.025高劑量組 9 0.7 678±0.337 0.2 922±0.087 0.1 844±0.034 0.0 750±0.020陽(yáng)性對(duì)照組 9 0.8 056±0.173 0.3 233±0.065 0.1 900±0.029 0.0 750±0.009溶劑對(duì)照組 9 0.7 571±0.126 0.2 871±0.042 0.1 700±0.037 0.0 640±0.010

2.4 各組大鼠血清性激素水平的變化

林丹各劑量組血清GnRH、FSH、P激素分泌水平均低于溶劑對(duì)照組（P均＜0.05）；林丹各劑量組血清GnRH、FSH、P激素分泌水平與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表3。

表3 林丹暴露對(duì)大鼠血清GnRH、FSH、P濃度的影響（±s）

表3 林丹暴露對(duì)大鼠血清GnRH、FSH、P濃度的影響（±s）

與溶劑對(duì)照組比較△P＜0.05。

組別 n GnRH/（ng·L-1） FSH/（IU·L-1） P/（ρmol·L-1）低劑量組 9 29.109±7.330△ 11.124±7.254△ 95.181±39.402△中劑量組 9 24.007±1.991△ 14.481±6.876△ 76.395±6.708△高劑量組 9 37.356±2.412△ 8.908±5.378△ 73.071±16.102△陽(yáng)性對(duì)照組 9 30.190±1.991△ 9.108±4.111△ 84.946±0.692△溶劑對(duì)照組 9 79.374±10.382 27.069±13.516 146.658±33.226

2.5 卵巢及子宮組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色鏡下觀察，溶劑對(duì)照組卵巢組織發(fā)育完整，可見各級(jí)卵泡。溶劑對(duì)照組可見卵泡顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，胞核大小均一。林丹染毒組可見卵泡結(jié)構(gòu)受損、閉鎖卵泡明顯增多、顆粒細(xì)胞數(shù)量減少、排列稀疏、胞核大小不一且伴有不同程度損傷，隨著染毒劑量升高，各級(jí)卵泡損傷越發(fā)明顯。陽(yáng)性對(duì)照組卵泡損傷程度與林丹高劑量組相似，見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢中卵泡及顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（HE×200）

HE染色鏡下觀察，溶劑對(duì)照組子宮組織形態(tài)正常，子宮內(nèi)膜、肌層及外膜組織結(jié)構(gòu)清楚，上皮細(xì)胞排列緊密，胞核大小均一?？梢娏值と径窘M中除低劑量組均有明顯程度的損傷。子宮內(nèi)膜出現(xiàn)不同程度的胞核假?gòu)?fù)層現(xiàn)象，上皮組織增生，上皮細(xì)胞排列不均，胞核大小不一，并且隨染毒劑量升高，子宮上皮出現(xiàn)腺體數(shù)量減少，見圖2。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（HE×200）

3 討論

體質(zhì)量是反映處理因素對(duì)動(dòng)物影響的綜合指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，林丹作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可影響動(dòng)物食欲，使體質(zhì)量降低，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，尤其對(duì)動(dòng)物早期的生長(zhǎng)發(fā)育影響較大[9]。器官系數(shù)是一個(gè)較為靈敏的客觀指標(biāo)，能夠反映毒物對(duì)動(dòng)物靶器官的綜合毒性[10]。通過計(jì)算子宮及卵巢的器官系數(shù)可以體現(xiàn)林丹對(duì)生殖器官的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，林丹中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠體質(zhì)量與溶劑對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)林丹通過干擾動(dòng)物食欲，從而使動(dòng)物體質(zhì)量下降。

卵巢的主要功能是通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)，合成并分泌性激素。其中下丘腦分泌GnRH調(diào)控垂體的分泌功能，F(xiàn)SH及P對(duì)排卵及卵泡生長(zhǎng)發(fā)育等內(nèi)分泌活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，林丹暴露可使血液中GnRH、FSH、P激素分泌水平發(fā)生變化，且FSH、P激素分泌水平隨著染毒劑量增加而下降。有文獻(xiàn)[11]報(bào)道，林丹可使血清中促黃體生成素（LH）濃度升高，提示其具有干擾性激素作用，為本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提供一定支持。在本實(shí)驗(yàn)中，林丹與雌二醇的激素分泌干擾作用水平相當(dāng)。

卵巢作為林丹的靶器官之一，林丹的外源性暴露會(huì)導(dǎo)致各級(jí)卵泡發(fā)育不良，對(duì)卵泡發(fā)育、排卵以及激素分泌等多種內(nèi)分泌過程產(chǎn)生不良影響[12]，促進(jìn)閉鎖卵泡的形成，使卵泡細(xì)胞失去再生能力，進(jìn)而消耗卵泡儲(chǔ)備，導(dǎo)致原發(fā)性卵巢功能不全[13-15]。子宮作為繁育子代和產(chǎn)生月經(jīng)的場(chǎng)所，正常狀態(tài)下，其內(nèi)膜呈周期性變化。林丹外源性暴露會(huì)造成子宮內(nèi)膜形態(tài)及功能的異常變化，進(jìn)而誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，低水平林丹暴露會(huì)導(dǎo)致大鼠各級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)受損、閉鎖卵泡增加、子宮內(nèi)膜增厚、腺體萎縮減少，造成子宮及卵巢的組織形態(tài)損傷，進(jìn)而干擾其內(nèi)分泌功能。

顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能單位，對(duì)卵泡的發(fā)育有重要影響，且其功能狀態(tài)直接影響卵泡的生長(zhǎng)啟動(dòng)、發(fā)育、黃體形成等卵巢活動(dòng)[10]。研究[16]表明，正常狀態(tài)下卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡與再生處于平衡狀態(tài)，共同維持卵巢內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)受到林丹外源性暴露時(shí)，卵巢內(nèi)環(huán)境平衡被打破，可能造成機(jī)體損害或疾病發(fā)生。通過觀察閉鎖卵泡的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征結(jié)構(gòu)為卵泡細(xì)胞中存在卵泡空泡、染色質(zhì)濃集、凋亡小體等形態(tài)改變[17]。因此，將卵泡閉鎖視為卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的結(jié)果[18-20]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)比觀察各組間卵巢組織HE染色切片中閉鎖卵泡的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)隨著暴露劑量增加，林丹低、中、高劑量組中閉鎖卵泡數(shù)量也逐漸增加，因而推測(cè)低水平林丹暴露會(huì)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞走向凋亡。

本實(shí)驗(yàn)中，低水平林丹暴露引起血清性激素GnRH、FSH、P分泌水平下降，使子宮、卵巢等生殖器官發(fā)生組織形態(tài)及功能改變。表明低水平林丹暴露可對(duì)雌性大鼠生殖系統(tǒng)造成一定損害，林丹可能通過誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起生殖系統(tǒng)損傷，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。