倪曉琛 李佳楠 戢小軍 羅意 陳偉 楊仕明

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部(北京 100853)

國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心(北京 100853)

聾病教育部重點實驗室(北京 100853)

聾病防治北京市重點實驗室(北京 100853)

Waardenburg綜合征（Waardenburg syndrome，WS）是一種以聽覺-色素異常為特征的遺傳性綜合征性疾病，由丹麥醫(yī)生于1951年首次報道，其遺傳方式呈不完全顯性遺傳。WS在人群中的發(fā)病率為1/42000，約占遺傳性耳聾患者的2-5%[1,2]。由于WS致病基因的多樣性，其臨床表現(xiàn)也具有明顯異質(zhì)性，在同一家系的不同個體之間可能呈現(xiàn)出不同的臨床表型。其中，以虹膜色素異常，感音神經(jīng)性聾，內(nèi)眥異位以及前額白發(fā)為四大典型臨床特征[3]。其中感音神經(jīng)性聾是WS的常見臨床特征，約9-62.5%的WS患者表現(xiàn)為感音神經(jīng)性聾。同時感音神經(jīng)性聾也是患者就醫(yī)的主要原因，也是影響患者生活質(zhì)量的主要癥狀。除此之外還包括面部雀斑，全身不同部位皮膚出現(xiàn)脫色素白斑等色素異常的相關臨床表現(xiàn)。依據(jù)患者不同的臨床表現(xiàn)，可以將WS分為 4型[4]。WS1（OMIM 193500）以及 WS3（OMIM 148820）均以PAX3突變?yōu)橹?，并以?nèi)眥異位為典型臨床特征。同時非對稱性聽力損失，皮膚脫色素白斑，前額白發(fā)均多見于PAX3為致病基因的患者中[5]。WS1患者中，約47-53%的患者表現(xiàn)出感音神經(jīng)性聾，約15-30%具有虹膜異色，約52-100%出現(xiàn)鼻根增寬，63-73%的患者表現(xiàn)出連眉[6]。3型的臨床表現(xiàn)與1型相似，在1型的臨床表現(xiàn)基礎上還伴有四肢異常，如關節(jié)攣縮、上肢骨骼發(fā)育不全、并指、短指和手指攣縮。2型患者的致病基因復雜，目前仍有超50%的患者無法明確致病基因。依據(jù)不同的致病基因，進一步分為2A（OMIM 193510）、2B（OMIM 600193）、2C（OMIM 606662）、2D（OMIM 608890）、2E（OMIM 611584）五型。在明確致病基因的患者中，以MITF以及SOX10突變較為常見。二者之間的臨床特征存在差異。在WS2中，新發(fā)突變、先天性內(nèi)耳畸形多見于SOX10突變的患者，面部雀斑則為MITF突變患者的主要特征[5,7]。同時約87%的2型患者出現(xiàn)感音神經(jīng)性聾[8]。WS4（OMIM 277580）以EDNRB、EDN3、SOX10突變?yōu)橹饕虏』?。其臨床表現(xiàn)與2型相似，并伴有巨結(jié)腸[9,10]，較為罕見。目前關于WS發(fā)病機制的研究多認為與胚胎時期神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育不良有關。盡管不同基因之間致病機制相似，但是對神經(jīng)嵴細胞遷移、分化的作用機制有所差異。本文擬對致病基因的分子機制進行綜述，探討相關臨床表型差異的原因，并將深入討論WS治療以及預后。

1 WS致病機制

神經(jīng)嵴細胞是在發(fā)育過程中短暫出現(xiàn)的胚胎細胞群，在原腸胚以及神經(jīng)形成期間出現(xiàn)，隨胚胎發(fā)育，可分化為顱面骨骼、交感神經(jīng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、腎上腺嗜鉻細胞以及黑色素細胞。其分化遷移過程錯綜復雜，包括多種信號通路，如WNT,BMP,FGF,Notch；也涉及Zic1,PAX3/7,Gbx2等多種轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子表達于神經(jīng)板邊緣，啟動、維持相關分化基因的表達，包括SOX8,SOX9,SOX10,FOXD3,SNAI1/2,cMyc[11]。WS則與黑色素細胞的遷移、分化異常密切相關。在哺乳動物中，黑色素細胞可以進一步分為兩類，一類為KIT敏感的皮膚黑色素細胞，位于皮膚，參與表皮以及毛囊的色素形成過程；另外一類為KIT欠敏感的黑色素細胞，分布于全身各處，包括周圍神經(jīng)系統(tǒng)，心臟，眼以及內(nèi)耳等[12]。在內(nèi)耳中，黑色素細胞分化為耳蝸血管紋中的中間細胞，并通過表達鉀通道蛋白KCNJ10分泌K+參與耳蝸內(nèi)淋巴液電位的維持[13]。當基因突變影響黑色素細胞分化、遷移時，則可能對耳蝸內(nèi)電位產(chǎn)生影響，導致感音神經(jīng)性聾的出現(xiàn)。

2 常見致病基因分子機制

2.1 PAX3

PAX3（paired box gene 3）屬于轉(zhuǎn)錄因子PAX家族中的一個亞型，具有高度保守的DNA配對區(qū)，由PAX3基因編碼并具有特征性的N末端DNA結(jié)合區(qū)以及C末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。PAX3基因中包含10個外顯子，編碼蛋白具有4個結(jié)構(gòu)閾，包括保守的配對結(jié)合區(qū)、八肽、同源結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸的羧基末端。PAX3通過與下游基因結(jié)合，調(diào)控下游基因表達水平，如SOX10；也可以通過其他信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)自身基因表達水平。PAX3基因表達在神經(jīng)嵴的發(fā)育以及分化過程中有著重要的作用。神經(jīng)誘導過程中，隨著神經(jīng)嵴細胞的出現(xiàn)、遷移、分化，PAX3在其分化而來的一系列細胞系中均有表達，包括黑色素細胞以及神經(jīng)根細胞，施萬細胞的祖細胞。并且PAX3的表達對黑色素細胞在內(nèi)耳中的分化有著重要作用[14]，使其進一步分化為耳蝸血管紋中的成熟的中間細胞，參與內(nèi)耳的動作電位的形成。WS1型的患者中約90%為PAX3基因雜合突變。目前已有報道超過100種PAX3的基因突變位點，并且少有重復。這些突變位點多位于PAX3基因的2至6號外顯子，其中以2號外顯子居多，并以錯義突變較為多見[15]，導致PAX3的DNA配對結(jié)合區(qū)產(chǎn)生功能改變，影響與其他基因的配對結(jié)合，如SOX10，MITF。而在臨床表現(xiàn)更為嚴重的WS3型的患者中多為PAX3基因或臨近基因的部分缺失或全部缺失。在PAX3突變的患者中發(fā)現(xiàn)，當位于同源結(jié)構(gòu)閾以及富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸的羧基末端的氨基酸缺失，更易出現(xiàn)皮膚色素的異常改變。而聽力下降的發(fā)生概率未見明顯差別[16]。

2.2 MITF

黑色素細胞誘導相關轉(zhuǎn)錄因子（Melanocyteinducing transcription factor，MITF）是一種轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，編碼MITF蛋白。MITF是堿基-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（basic-helix-loop-helix-leucine zipper，bHLH-ZIP）家族中的一種轉(zhuǎn)錄因子，具有三個特征性的結(jié)構(gòu)域，包括參與蛋白質(zhì)二聚化的螺旋-環(huán)-螺旋、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，以及DNA結(jié)合域。在轉(zhuǎn)錄過程中，不同的轉(zhuǎn)錄起始位點以及RNA的選擇性剪切可以產(chǎn)生不同的MITF亞型。其中包括黑色素細胞特異性的MITF（MITF-M），心臟特異性的MITF（MITF-H）。不同的亞型存在于不同的組織以及器官中[17]。亞型之間組織表達特異性以及蛋白質(zhì)二聚化異質(zhì)性使MITF具有復雜的生物特性。MITF在體內(nèi)具有極其復雜的生物活性，可以參與多種生物途徑[18]。包括黑色素細胞的存活、增殖、分化、代謝以及黑色素的形成。MITF通過調(diào)節(jié)黑色素生成的相關基因酪氨酸酶（tyrosinase，TYR),酪氨酸酶相關蛋白1（tyrosinase-related protein-1，TYRP1)，酪氨酸酶相關蛋白2（tyrosinase-related protein-2，TYRP2)對黑色素的生成進行調(diào)節(jié)[19]。鑒于MITF在黑色素細胞的生物過程中的重要作用，其過表達以及低表達均可導致不同的疾病出現(xiàn)。在30%的黑色素瘤組織中存在MITF的過表達，可能與磷酸化導致的活性增強相關。當MITF功能不足時，則會導致一系列相關疾病，包 括 WS2，Tietz albinism-deafness syndrome(TADS 103500)。MITF突變占WS2患者中的20%，并以雜合突變?yōu)橹?，突變位點多位于編碼bHLHZIP的7、8號外顯子?？赡軐е铝薓ITF蛋白質(zhì)二聚化受阻，出現(xiàn)了單倍體劑量不足[17]。最終導致無法激活下游目標基因TYP，TYRP1以及DCT轉(zhuǎn)錄。在人類胎兒的耳蝸中，MITF僅在黑色素細胞上表達，因MITF突變導致的WS綜合征可能與耳蝸內(nèi)的黑色素細胞密切相關[20]。MITF的表達受到多種途徑的調(diào)節(jié)。在MITF表達以及活化的過程中，主要的正向表達調(diào)節(jié)包括WNT/β-catenin、SOX10，并且MITF還可以通過LEF-1/β-catenin通路促進自身基因的表達[21]。在WS2型患者中，MITF的單倍體劑量不足可能通過WNT/β-catenin途徑進行調(diào)節(jié)，一定程度上彌補劑量不足帶來的臨床表型[22]。MITF突變的患者中，聽力下降的發(fā)生率約為89.6%[23]。并且患者中常表現(xiàn)出面部雀斑，在亞洲人群中，尤其顯著[5,7]。

2.3 SOX10

SOX10屬于SOX轉(zhuǎn)錄因子家族，包括SOX8、SOX9，以HMG(high mobility group)DNA結(jié)合域為特征，在決定細胞分化方向以及細胞分化過程中有重要調(diào)控作用[24]。在神經(jīng)嵴細胞后期的發(fā)育分化過程中有著重要的調(diào)控作用，尤其黑色素細胞以及外周神經(jīng)膠質(zhì)細胞[24]。同時SOX10可以激活MITF表達以及調(diào)節(jié)酪氨酸酶相關蛋白2（TYP2/Dct）基因的表達進而對黑色素細胞分化進行調(diào)節(jié)。在早期耳蝸的發(fā)育過程中，SOX10不僅表達于耳蝸內(nèi)黑色素細胞，同時也表達于耳蝸導管上皮以及外周膠質(zhì)細胞，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞。因而SOX10突變導致WS出現(xiàn)的相關聽力損失可能與多種細胞相關[20,25]。鑒于與人類耳蝸結(jié)構(gòu)、發(fā)育過程的相似性小型豬模型可以對疾病的研究提供良好的模型[26]。在SOX10錯義突變的小型豬模型中進一步發(fā)現(xiàn)，SOX10突變與耳蝸分隔不全相關[27]。而在SOX10基因突變的WS患者中，同樣發(fā)現(xiàn)多合并不同程度的內(nèi)耳畸形，包括前庭擴大以及內(nèi)耳分隔不全[28]。在人類疾病中，SOX10突變與多種疾病相關，WS2型、WS4型、外周神經(jīng)脫髓鞘病變，先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung’s disease OMIM 142623）以及卡爾德曼綜合征（Kallmann syndrome，KS）。同時已有報道，由SOX10突變導致的2型WS合并KS[29]。在多數(shù)可以導致疾病出現(xiàn)的SOX10突變中，均可導致提前終止密碼子的出現(xiàn)，產(chǎn)生截短蛋白，經(jīng)無義介導的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）或者截短蛋白的負性效應進而影響SOX10的相關功能[30]。當截短蛋白逃逸NMD途徑，以突變蛋白的負性效應為致病機制時，則導致最為嚴重的疾病表型，PCWH綜合癥（OMIM 609136），表現(xiàn)為復雜的神經(jīng)嵴病變，包括外周脫髓鞘病變，中樞性髓鞘形成，WS，先天性巨結(jié)腸[31]。

2.4 EDNRB/EDN3

內(nèi)皮素信號系統(tǒng)是由兩種G蛋白偶聯(lián)跨膜受體以及3種配體組成，其中EDNRB和EDN3在黑色素細胞以及腸神經(jīng)元發(fā)育中有著重要作用，尤其在黑色素細胞進一步定向分化為中間細胞的過程中，如細胞遷移，增殖，血管生成以及細胞骨架重組[32]。同時EDNRB在螺旋神經(jīng)節(jié)上的表達，對于出生后聽力的形成有著重要作用。在出生后19天Ednrb純合突變的大鼠中，觀察到耳蝸底轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)的密度較野生型的大鼠的密度低20%-30%。并且出現(xiàn)螺旋神經(jīng)節(jié)的衰退[33]。EDNRB/EDN3突變產(chǎn)生的相關效應與蛋白質(zhì)劑量相關。EDNRB/EDN3純合以及雜合突變均可導致4型Waardenburg綜合征以及部分2型的出現(xiàn)[34]。EDNRB純合突變（或可疑、證實的復合雜合突變）中，70%呈現(xiàn)為完全隱性遺傳[1]。對于EDNRB/EDN3突變的患者而言，沒有明顯的基因與表型的關聯(lián)。在純合突變的患者中，攜帶突變基因的雜合個體可以呈現(xiàn)為無癥狀，或者疾病的部分表型。在WS中，EDNRB/EDN3突變致病的患者中，表現(xiàn)出聽力損失的比例為53.3%、75%[23]。

3 治療以及預后

目前針對聽力損失的治療方法主要為佩戴助聽器以及人工耳蝸植入（Cochlear implantation,CI）。對于WS患者而言，目前的主要治療方法同樣為以上兩種。助聽器的佩戴需要滿足一定聽力條件；對于重度以及極重度聽力損失患者而言，人工耳蝸植入是主要的治療方法。CI通過直接刺激聽神經(jīng)，將聽覺信號傳導至大腦皮層，是目前治療聽力損失最佳的治療方式。但是人工耳蝸術后康復效果卻有很大差異，目前關于WS患者CI術后康復效果，尤其言語識別方面的效果結(jié)論不一，Amirsaiari S等[34]認為WS患者在行人工耳蝸植入后的1年，在聽力學結(jié)果中與非綜合征性聾的患者相比無顯著差異，但是在言語識別中具有顯著差異。而在Ba Kkourl[35]以及Cullen R[36]等的研究中，WS患者以及GJB2突變的患者均可獲得較好的言語以及認知效果。

人工耳蝸術后康復效果受到多種因素的影響，耳蝸的植入時間、植入時患者的殘余聽力、患者有無合并內(nèi)耳畸形、是否存在聽神經(jīng)病變、家庭訓練、家庭經(jīng)濟情況等。其中螺旋神經(jīng)節(jié)（spiral ganglion neuron,SGNs）的功能、數(shù)量[37]，致病基因也是重要影響因素[38,39]。

在先天性感音神經(jīng)性聾的兒童中，有50%的患兒可以明確致病基因。不同的致病基因?qū)е虏煌牟∽兂霈F(xiàn)，因而可能與耳蝸術后效果相關[40]。對于表達局限于內(nèi)耳中的基因，常見的致病基因有：GJB2、SLC26A4、OTOF以及線粒體基因，均可獲得較好的術后康復效果。而對于表達在SGNs、腦干聽覺核團，如DFBNB59基因，PCDH15基因，則人工耳蝸植入術后效果不佳[38]。而對于綜合征性聾的患者而言，術后康復效果較差[40]。

McClellan[41]等人通過術中耳蝸電圖預測術后言語康復效果，進一步證實SGNs的功能與術后言語識別之間的重要聯(lián)系。目前越來越多的研究證實在人工耳蝸植入中，SGNs發(fā)揮著重要作用。對于突變基因高表達于SGNs的感音神經(jīng)性聾患者而言，術后康復效果不佳[42,43]。當突變基因傾向于表達在SGNs，可能與SGNs的衰退相關，并可能導致術后效果不佳[43]。Nishio等[44]比較了在大鼠耳蝸中不同細胞的特異性耳聾基因的表達水平，并發(fā)現(xiàn)Snai2基因主要表達于SGNs，Edn3，Pax3在SGNs中的表達水平高于耳蝸中的其他細胞，Mitf在SGNs中也有較高的表達。因而可以推測這些WS相關的致病基因在SGNs中的高表達可能會影響SGNs的相關功能。同時Ido-Eto等[33]已證實在Ednrb/Edn3突變的大鼠耳蝸中出現(xiàn)SGNs的衰退。Chen W等[45]在Mitf-M突變的榮昌豬中發(fā)現(xiàn)，在出生后30天SGNs開始出現(xiàn)衰退?？紤]到動物模型中WS相關致病基因?qū)GNs的影響，我們可以由此推測在WS患者的言語康復效果不佳，可能與SGN功能以及數(shù)量相關。但是由于WS致病基因的不同，對SGNs的影響不一，故出現(xiàn)評價不一，可能是研究中未考慮致病基因。日后對于WS人工耳蝸術后的效果評價仍需進一步研究，尤其在評價其SGNs的數(shù)量以及功能狀態(tài)方面需要進一步結(jié)合基因進行研究。

4 展望

盡管目前WS患者行人工耳蝸植入后可以實現(xiàn)重獲聽力，但是有部分患者由于螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量以及功能狀態(tài)的限制，未能獲得較好的術后康復效果。目前基因療法以及干細胞療法已經(jīng)成為關于先天性感音神經(jīng)性聾患者治療研究的熱點。對于明確致病基因的患者，基因療法可以從根本解決患者聽力損失的原因。基因編輯技術CRISPER/Cas9成功應用于轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性的患者，1期臨床試驗取得突破性進展，為基因編輯技術逐步應用于遺傳性疾病開拓了道路[45]。與此同時，CRISPER/Cas9已經(jīng)成功應用于Mitf突變的小型豬模型中，可以有效改善突變型動物的聽力[46]。盡管目前尚未進行進一步的臨床研究，但是基因療法終將進入臨床，有望改變遺傳性疾病進程，尤其遺傳性聾患者。干細胞療法通過誘導干細胞定向分化SGNs，可以彌補SGNs數(shù)量以及功能不足，結(jié)合人工耳蝸植入極大程度改善遺傳性聾患者聽力預后[47]。這兩種療法有望從根本解決遺傳性聾的治療難題，為聽力損失患者帶來希望。