張婷 鄭見寶

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)最常見的類型，以其高轉(zhuǎn)移、高增殖能力而著稱[1]。盡管近年來在舌鱗狀細(xì)胞癌治療管理方面取得了進(jìn)展，舌鱗狀細(xì)胞癌的死亡率仍然很高[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一種長度>200 nt、無蛋白質(zhì)編碼能力的非編碼RNA。據(jù)報(bào)道，lncRNAs參與了腫瘤發(fā)生的一系列調(diào)控，包括癌變、細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等[3]。TTTY15作為一種致癌的lncRNA，在癌癥中有被報(bào)道。例如，TTTY15可通過海綿 microRNA let-7促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展[4]。然而，與舌鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)的TTTY15的生物學(xué)功能和機(jī)制還未闡明。研究表明miRNAs參與調(diào)節(jié)各種基本的生物學(xué)過程，并與腫瘤學(xué)的進(jìn)展有關(guān)[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-337-3p可通過下調(diào)Rap1A蛋白的表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]。然而，miR-337-3p在舌鱗狀細(xì)胞癌中的效應(yīng)尚未闡明。調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖的信號(hào)通路的分子往往對(duì)腫瘤進(jìn)展有重要影響。JAK2是一種非受體酪氨酸激酶，參與了許多調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖的信號(hào)通路，是腫瘤組織中表達(dá)最顯著的基因[7,8]。有研究顯示，miR-337-3p可通過靶向作用于JAK2抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[9]。然而，作用于JAK2的miR-337-3p在舌鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚未完全闡明。本研究中，我們探討TTTY 15在舌鱗狀細(xì)胞癌中的潛在作用，并在體外研究TTTY15對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 病理組織收集 選取我院收治的舌鱗狀細(xì)胞癌患者40例，通過手術(shù)獲得了40份舌鱗狀細(xì)胞癌樣本和相應(yīng)的癌旁正常組織，樣本經(jīng)病理檢測(cè)為舌鱗狀細(xì)胞癌。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未接受放療、化療；(2)手術(shù)切除腫瘤，術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為舌鱗狀細(xì)胞癌；(3)臨床病理資料完整；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并慢性疾病(如冠心病、高血壓、糖尿病等)者；(2)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；(3)合并感染性疾病者。切除的癌癥和相應(yīng)的癌旁正常組織被切割后立即儲(chǔ)存在液氮中直到RNA提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(SCC4, SCC1, UM1 和 Cal27)和口腔角質(zhì)形成細(xì)胞系(NHOK)購自中國上?？茖W(xué)院細(xì)胞銀行, 在RMPI-1640培養(yǎng)基(美國Gibca公司)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%牛胎血清(鼎國公司，批號(hào)：TH20190412)，條件為37℃，5%CO2。miR-337-3p mimics以及相應(yīng)的對(duì)照組mimic陰性對(duì)照購自廣州瑞博生物科技有限公司。使用上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成的sh-TTTY15敲低TTTY15的表達(dá)和相應(yīng)的對(duì)照sh-NC。pcDNA3.1-TTTY15購自Genepharma。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(批號(hào)：JT20190408)購自Invitrogen公司。CCK-8試劑盒(批號(hào)：20190320)購自日本TaKaRa公司。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reactio，PCR)試劑盒(批號(hào)：120114578ST)購自日本TaKaRa公司。

1.3 定量實(shí)時(shí)PCR分析 用Trizol試劑從組織或細(xì)胞中提取總RNA。用M-MLV RTase cDNA合成試劑盒(Takara)，根據(jù)制造商的指示，將RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。在ABI PRISM 7700儀器(Thermo Fisher Science)上，用SYBR greener qPCRSuperMix(Thermo Fisher Science)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。PCR擴(kuò)增首先在95℃起始變性15 min，然后95℃下進(jìn)行30 s, 58℃下進(jìn)行30s，72℃下進(jìn)行30 s, 以及最后一步在72℃下進(jìn)行10 min的35次循環(huán)。然后，用直接測(cè)序法對(duì)單個(gè)PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。以GAPDH為檢測(cè)TTTY15，miR-337-3p和JAK2表達(dá)水平的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)量3次。見表1。

1.4 CCK-8法 采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖。細(xì)胞接種于96孔板中，密度為5 000個(gè)/孔，培養(yǎng)1、2、3和4 d。在指定的時(shí)間點(diǎn)加入10 μl CCK-8試劑到每孔中。37℃孵育2 h后，在450 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次測(cè)量3次。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種在裝有小室的24孔板中，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞懸浮在無血清培養(yǎng)基的上室(約105個(gè)細(xì)胞/孔，8 μm孔徑；BD Biosciences)，下室內(nèi)加入500 μl含10%的胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液。24 h后，用棉簽輕輕地拭去上室表面的細(xì)胞(即未侵入下室的細(xì)胞)，侵入下室的細(xì)胞采用甲醇固定，然后用結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(包括膜的中央和周邊)，計(jì)數(shù)侵入下室的細(xì)胞數(shù)目。侵襲實(shí)驗(yàn)的Transwell小室底部覆有基質(zhì)膠，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 所有熒光素酶報(bào)告載體(TTTY15-WT、TTTY15-MUT)均由Ribo生物公司構(gòu)建。將細(xì)胞(4.5×104)接種于48孔板中，培養(yǎng)至70%匯合。然后用脂質(zhì)體2000將TTTY15-WT或TTTY15-MUT與miR-337-3p模擬物或陰性對(duì)照物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，按照制造商的說明測(cè)定熒光素酶活性。所有實(shí)驗(yàn)一式三份，重復(fù)3次。

1.7 Western blot 采用RIPA緩沖液(ThermoFisher Science)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，收集總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。分別采用5%的SDS-PAGE濃縮膠和10%的SDS-PAGE分離膠分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%的脫脂牛奶封閉后,首先用特異性抗體孵育膜：JAK2(稀釋1∶1 000，Cell Signaling Technology)和GAPDH(稀釋度1∶2 000，Santa Cruz)抗體檢測(cè)膜。然后與山羊抗兔(1∶5 000，ab6721；Abcam)進(jìn)行二次抗體孵育膜。使用ECL試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK)進(jìn)行顯影，采用ImageQuant LAS 4000微型生物分子成像儀(GE Healthcare)進(jìn)行拍照。GAPDH被用作內(nèi)部參考。用ImageJ軟件進(jìn)行western blot定量分析。

2 結(jié)果

2.1 TTTY 15在舌鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào) 通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組織相比，舌鱗狀細(xì)胞癌樣品中TTTY15表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與口腔角質(zhì)形成細(xì)胞系(NHOK)相比的所有四個(gè)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(SCC4、SCC1、UM1和Cal27)中，TTTY15表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見表2、3。

表2 舌鱗狀細(xì)胞癌組織和相應(yīng)的癌旁正常組織中TTTY15的表達(dá)情況比較

表3 SCC4、SCC1、UM1和Cal27細(xì)胞系中TTTY15的表達(dá)情況比較

2.2 敲低TTTY 15可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲 成功建立TTTY15低表達(dá)細(xì)胞模型，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TTTY15低表達(dá)組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況。與對(duì)照組相比，TTTY15低表達(dá)組可顯著抑制細(xì)胞的增殖。使用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估了TTTY15低表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響，與對(duì)照組相比，TTTY15低表達(dá)的遷移和侵襲能力較弱。見圖1，表4。

圖1 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sh-TTY15對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲影響

表4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sh-TTY15對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖影響

2.3 MiR-337-3p在舌鱗狀細(xì)胞癌中下調(diào)并可與TTTY15結(jié)合 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫來尋找TTTY15的潛在目標(biāo)基因。TTTY15包含miR-337-3p的保守目標(biāo)位點(diǎn)。為確認(rèn)TTTY15與miR-337-3p之間的直接相互作用，采用雙熒光素酶報(bào)告法。雙熒光素酶檢測(cè)顯示miR-337-3p對(duì)TTTY15-WT的報(bào)告活性有明顯的抑制作用，但對(duì)TTTY15-MUT沒有抑制作用。TTTY15與miR-337-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。見表5，圖2、3。

表5 熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-337-3p對(duì)TTTY15-WT和TTTY15-MUT的影響

圖2 TTTY15的野生型和突變型與miR-337-3p結(jié)合位點(diǎn)的示意圖

2.4 轉(zhuǎn)染miR-337-3p可促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲 將miR-337-3p mimics轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，成功構(gòu)建了miR-337-3p過表達(dá)模型。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR-337-3p可明顯抑制細(xì)胞的增殖。通過transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，我們觀察到miR-337-3p的過表達(dá)顯著地減少了細(xì)胞的遷移和侵襲。見表6，圖4。

圖3 TTTY15與miR-337-3p的皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析

表6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miR-337-3p對(duì) 細(xì)胞的增殖的影響

圖4 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-337-3p對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲影響

2.5 TTTY 15通過抑制miR-337-3p的功能，促進(jìn)JAK 2的表達(dá)和舌鱗狀細(xì)胞癌的生長 將miR-337-3p mimics和TTTY15 + miR-337-3p mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)TTTY15在轉(zhuǎn)染miR-337-3p mimics的細(xì)胞中下調(diào)，但這一現(xiàn)象在共轉(zhuǎn)染過表達(dá)TTTY15和miR-337-3p mimics的細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染miR-337-3p mimics的細(xì)胞中JAK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，而TTTY15 的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了該效應(yīng), 這表明TTTY15可以通過抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的miR-337-3p誘導(dǎo)JAK2的表達(dá)。接下來，我們研究TTTY15是否能恢復(fù)miR-337-3p mimics轉(zhuǎn)染對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的影響。我們發(fā)現(xiàn)miR-337-3p mimics抑制了舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，而TTTY15的轉(zhuǎn)染部分地消除了miR-337-3p mimics對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。見圖5、6，表7、8。

圖5 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TTTY15+miR-337-3p共轉(zhuǎn)染對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲影響

圖6 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

表7 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)TTTY15 + miR-337-3p對(duì)細(xì)胞增殖的影響

表8 Western blot 法檢測(cè)3組細(xì)胞的JAK2蛋白表達(dá)水平

3 討論

有證據(jù)表明，lncRNAs參與了許多重要的生物學(xué)過程，包括腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，從而為大多數(shù)腫瘤提供了潛在的治療靶點(diǎn)[10]。因此，研究舌鱗狀細(xì)胞癌中l(wèi)ncRNAs的生物學(xué)功能及其機(jī)制，可為臨床治療提供有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。

近年來，lncRNAs已在多種腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，這為腫瘤的治療帶來了戰(zhàn)略性的改變，lncRNAs也是如今很多研究的重點(diǎn)。在舌鱗狀細(xì)胞癌中曾報(bào)道過lncRNAs的調(diào)節(jié)障礙，與舌鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的lncRNA的研究可提供預(yù)后和疾病監(jiān)測(cè)標(biāo)記并可能提供潛在的新的治療靶點(diǎn)，例如，lncRNA GIHCG通過調(diào)節(jié)miR-429促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[11]。LncRNA TUC338過表達(dá)可在體外促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖并抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[12]。LncRNA CASC15通過靶向miR-33a-5p促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[13]。受這些研究的啟發(fā)，我們?cè)噲D確定TTTY15在舌鱗狀細(xì)胞癌中的作用。我們?cè)?0例舌鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織對(duì)照組中檢測(cè)到TTTY15，數(shù)據(jù)顯示，TTTY15在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯升高，而TTTY15高表達(dá)的患者預(yù)后比低表達(dá)者差。TTTY15在舌鱗狀細(xì)胞癌中的高表達(dá)可以促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移。

miRNAs可作為促腫瘤基因或抑腫瘤基因調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展。例如，雙重功能的miRNA-186-5p可靶向FGF 2和RelA抑制多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生[14]。miR-106a-363可促進(jìn)尤文肉瘤的生長[15]。另外，越來越多的證據(jù)表明miRNAs的失調(diào)與舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制有關(guān)。例如，miR-183可促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株SCC25細(xì)胞凋亡[16]。miR-22通過抑制CD147表達(dá)抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖[17]。miRNA-802通過靶向MAP2K4抑制舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[18]。與此同時(shí)，miR-337-3p的過表達(dá)在癌癥發(fā)生和發(fā)展的許多細(xì)胞過程中起著抑癌的作用。例如，miR-337-3p通過調(diào)節(jié)CAPN4來抑制透明細(xì)胞腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。miR-337-3p可靶向STAT3和RA1A調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌中的紫杉烷敏感性，miR-337-3p表達(dá)缺失可促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，miR-337-3p在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著下調(diào)。miR-337-3p的過表達(dá)在體外抑制了舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

miRNA和lncRNA的相互作用在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的確切作用尚不清楚。了解miRNA和lncRNA之間的相互作用，將極大地促進(jìn)惡性腫瘤基于miRNA/lncRNA的診斷和治療的發(fā)展。例如，上調(diào)的Lnc-SNHG1通過阻斷miR-577和激活WNT2B/Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展[21]。LncRNA SNHG20通過調(diào)節(jié)miR-495參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程[22]。Lnc-SNHG1可作為miR-497的海綿促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[23]。本研究中，我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了TTTY15與miR-337-3p之間的結(jié)合位點(diǎn)，并用雙熒光素酶報(bào)告法證實(shí)miR-337-3p中含有TTTY15的結(jié)合位點(diǎn)。此外，我們還證實(shí)了TTTY15與miR-337-3p直接結(jié)合。我們還發(fā)現(xiàn)，在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，TTTY15通過抑制miR-337-3p的表達(dá)發(fā)揮了促癌作用。表明TTTY15直接靶向并下調(diào)miR-337-3p的表達(dá)從而影響舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。

據(jù)報(bào)道，JAK2在幾乎所有組織中表達(dá)并與許多病理進(jìn)展相關(guān)，而且JAK2在一些癌癥中充當(dāng)癌基因[23]。例如，JAK2過表達(dá)是鼻咽癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子[24]。JAK2基因敲除通過STATs和PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、自噬和抗增殖作用[25]。此外，JAK2是人類癌癥中多個(gè)miRNAs的直接下游靶點(diǎn)，例如，胰腺癌中miR-216a的下調(diào)可能導(dǎo)致JAK 2過度表達(dá)和/或異常激活，從而加劇胰腺癌的發(fā)展[26]。MiR-375通過靶向JAK2抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[27]。而在肝癌中，JAK2已經(jīng)被證明是miR-337-3p的直接靶點(diǎn)。在本研究中，TTTY15的過表達(dá)抑制miR-337-3p的表達(dá)，而促進(jìn)JAK2的表達(dá)。因此，我們認(rèn)為TTTY15可以通過靶向miR-337-3p參與調(diào)節(jié)舌鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中JAK2的表達(dá)。

綜上所述，我們強(qiáng)調(diào)TTTY15作為“ceRNA”通過sponge miR-337-3p來促進(jìn)JAK2的表達(dá)，從而在體外促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。我們的研究結(jié)果為舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路，也為舌鱗狀細(xì)胞癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。