張鷺，錢(qián)大瑋，唐志書(shū)*，宋忠興，王明耿，劉峰，陳衍斌，許剛，許洪波

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）/陜西中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 咸陽(yáng) 712083；

2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；

3.山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，山東 菏澤 274000；

4.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院 陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 712046

山楂核（山楂種子）是山楂加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，占山楂果實(shí)干質(zhì)量的30%。隨著山楂產(chǎn)品產(chǎn)量的增加，世界各地每年產(chǎn)出大量山楂核（僅中國(guó)每年就生產(chǎn)約150萬(wàn)t）?；瘜W(xué)成分研究結(jié)果表明，山楂核主要含有木脂素類(lèi)成分，通過(guò)干餾技術(shù)可將山楂核中的木脂素等大分子裂解為大量酚類(lèi)單體和低聚物，即干餾液[1]。前期關(guān)于山楂核干餾液的藥理作用研究表明，其具有顯著的抗炎及抗菌活性，已被開(kāi)發(fā)成抗菌藥品（如紅核婦潔洗液）[2-3]，用于治療由白色念珠菌感染后引發(fā)的霉菌性陰道炎，臨床療效較好。

此前，研究者采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)山楂核干餾液的化學(xué)組成進(jìn)行了分析，共鑒定了90 余個(gè)化合物，主要為小分子酚、醛、呋喃類(lèi)[4-6]。目前，有關(guān)山楂核干餾液質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分多選擇糠醛和愈創(chuàng)木酚[7]。前期研究表明，這2 個(gè)成分不是山楂核干餾液的特征性成分，同時(shí)其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[8]。截至目前，山楂核干餾液抗炎和抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本研究通過(guò)建立山楂核干餾液4個(gè)流分的GC-MS 明晰其主要成分，并使用灰色關(guān)聯(lián)度分析法計(jì)算主要色譜峰與其抗炎、抗菌作用的關(guān)聯(lián)度，從而明確其發(fā)揮抗炎、抗菌作用的化合物，為山楂核干餾液的臨床應(yīng)用及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞與菌株

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；白色念珠菌（菌株編號(hào)：ATCC 10231）購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器

5977-7890A 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，HP-5MS型毛細(xì)管色譜柱均購(gòu)自安捷倫科技有限公司；XS205DU 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（美國(guó)梅特勒-托利多儀器公司）；ICO240 型恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；HYQ240S 型全溫雙層搖床（中國(guó)常州愛(ài)華儀器公司）；Synergy?H1 型多功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰凈化設(shè)備有限公司）；BX53F 型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；5804R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）。

1.3 試藥

山楂核購(gòu)自山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，并經(jīng)過(guò)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室胡本祥教授鑒定為山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟種子。

RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：2049224）、胎牛血清（批號(hào)：2001003）、胰蛋白酶（批號(hào)：2043176）、磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：2031104）均購(gòu)于Biological Industries公司；酵母提取物（批號(hào)：20201118）、蛋白胨（批號(hào)：20200918）、麥芽提取物（批號(hào)：20200812）和葡萄糖（批號(hào)：20200918）均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)公司；兩性霉素B（AMB，批號(hào)：K1919038）購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；N-硝基-L-精氨酸甲基酯鹽酸鹽（L-NAME，批號(hào)：WXBC9273V）和脂多糖（LPS，批號(hào)：L4391）來(lái)源于大腸桿菌0111：B4，購(gòu)自Sigma 公司；正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品C8～C40（批號(hào)：E129360，美國(guó)Sigma-Aidrich公司）。

2 方法

2.1 山楂核干餾液的制備與分離

將山楂核1170 g 置于蒸餾釜中，升溫至150 ℃保持60 min，以除去水分和揮發(fā)性成分。之后，將溫度升至270 ℃，收集蒸餾出的液體產(chǎn)物（干餾液）300 g。取干餾液20 g，經(jīng)D101型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱分離，依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%的甲醇水溶液和甲醇洗脫，得到4 個(gè)流分Fr.A（6 g）、Fr.B（4 g）、Fr.C（1.1 g）和Fr.D（3.3 g）。

2.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于96 孔板中，放置培養(yǎng)箱孵育4 h 后，設(shè)置對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥（L-NAME）組、山楂核干餾液組及4 個(gè)流分組。對(duì)照組加入培養(yǎng)基；模型組加入終質(zhì)量濃度為1μg·mL-1的LPS；陽(yáng)性藥組加入L-NAME（終質(zhì)量濃度為26～400 μg·mL-1的5 個(gè)梯度）和終質(zhì)量濃度為1μg·mL-1的LPS；給藥組分別加入山楂核干餾液[0.1%二甲基亞砜（DMSO）稀釋使終 質(zhì)量濃度 為3～240 μg·mL-1的7 個(gè)梯度]、4 個(gè)亞流分（0.1% DMSO 稀釋使終質(zhì)量濃度為2～300μg·mL-1的8個(gè)梯度）和終質(zhì)量濃度為1μg·mL-1的LPS。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)有3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入噻唑藍(lán)（MTT）0.5μg·mL-1，孵育4 h；棄去上清液，加入DMSO 溶解后，用酶標(biāo)儀于492 nm 檢測(cè)吸光度（A）并按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞活性，空白中只加入了培養(yǎng)液。

2.3 一氧化氮（NO）檢測(cè)

LPS 刺激炎癥模型已被廣泛用于研究各種天然衍生物的抗炎活性。NO抑制作用已普遍用作抗炎效果的指標(biāo)，L-NAME是精氨酸的類(lèi)似物，能抑制NO產(chǎn)生，故用作陽(yáng)性對(duì)照[9]。將RAW264.7 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞與質(zhì)量濃度均同2.2 項(xiàng)下的山楂核干餾液、L-NAME和4個(gè)流分孵育2 h，再加入終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的LPS 刺激處理20 h，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)有3 個(gè)復(fù)孔，采用Griess 法檢測(cè)細(xì)胞生成NO 的量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 抗菌活性測(cè)試

AMB 是多烯類(lèi)真菌抗生素，其通過(guò)與真菌細(xì)胞膜中的麥角固醇結(jié)合，從而改變膜通透性來(lái)引起真菌生長(zhǎng)停止或者死亡，對(duì)白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用[10]，可作為抗菌作用的陽(yáng)性對(duì)照。采用微量稀釋法測(cè)定AMB、山楂核干餾液和4 個(gè)流分的抗菌活性。設(shè)置對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、山楂核干餾液組及4個(gè)流分組。取制備好的菌懸液（5×106CFU·mL-1）100μL 分別加入96 孔板中，對(duì)照組加入培養(yǎng)基；陽(yáng)性藥組加入AMB 終質(zhì)量濃度為0.5～75.0 μg·mL-1的8 個(gè)梯度；給藥組分別加入山楂核干餾液和4 個(gè)亞流分（0.1% DMSO 稀釋使終質(zhì)量濃度為0.16～23 mg·mL-1的8個(gè)梯度質(zhì)量濃度），每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，在30 ℃下培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT20μL，避光培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔再加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀在492 nm 處測(cè)定A，以不加測(cè)試樣品組為空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式（1）計(jì)算抗菌活性。

2.5 GC-MS分析

2.5.1 供試品制備 分別稱取Fr.A、Fr.B、Fr.C和Fr.D 各10 mg，分別置于4個(gè)10 mL量瓶中，再加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度為1μg·mL-1的供試品溶液，過(guò)0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5.2 色譜條件 色譜柱為HP-5MS 型毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣；體積流量為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測(cè)器溫度為300 ℃；進(jìn)樣量為2 μL，不分流；升溫程序見(jiàn)表1。

表1 供試品GC-MS升溫程序

2.5.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度為250 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲5 min；質(zhì)譜掃描模式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z45～650；所得數(shù)據(jù)經(jīng)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所數(shù)據(jù)庫(kù)2014（NIST 2014）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索匹配，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)及文獻(xiàn)已報(bào)道物質(zhì)進(jìn)行核對(duì)。保留指數(shù)（RI）的測(cè)定采用相同的氣相色譜條件測(cè)定正構(gòu)烷烴（C8～C40）的保留時(shí)間，按公式（2）計(jì)算出4個(gè)流分中各揮發(fā)性化合物的RI。

tR（x）、tR（n）、tR（n+1）分別表示待測(cè)化合物，含碳數(shù)n和碳數(shù)n+1 的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間且tR（n）＜tR（x）＜tR（n+1）。

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.6.1 原始數(shù)據(jù)的無(wú)量綱化處理 原始數(shù)據(jù)的變換采用均值變換法。變換的母序列記為{X0（t）}，子序列記為{Xi（t）}。將山楂核干餾液4 個(gè)流分的抗炎（抗菌）活性的藥效指標(biāo)作為母序列，山楂核干餾液4個(gè)流分的特征峰峰面積作為子序列。

2.6.2 絕對(duì)差序列及關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 在t=k時(shí)（k為峰號(hào)），母序列記為{X0（k）}，子序列記為{Xi（k）}，按公式（3）計(jì)算母序列與子序列的絕對(duì)差序列Δ0i（k）。按公式（4）計(jì)算在t=k時(shí)母序列與子序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)η（k）。

m為4個(gè)流分，Y0（k）為山楂核干餾液4個(gè)流分抗炎（抗菌）藥理藥效指標(biāo)；Yi（k）為山楂核干餾液4 個(gè)流分各特征峰峰面積歸一化數(shù)值；k為峰號(hào)；ρ為分辨系數(shù)，作用是削弱最大絕對(duì)差數(shù)值的失真，提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的顯著性差異，ρ∈（0，1），本實(shí)驗(yàn)中ρ取0.5；∣Y0（k）-Yi（k）∣為母序列與子序列的絕對(duì)差值；|Y0(k) -Yi(k)|為絕對(duì)差值的最小值，又記為Δmin；Y0(k) -Yi(k)|為絕對(duì)差值的最大值，又記為Δmax。

2.6.3 關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 按公式（5）計(jì)算關(guān)聯(lián)度（r），r是對(duì)時(shí)間序列幾何關(guān)系的比較，是母序列與子序列各個(gè)時(shí)刻的關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值，n為子序列的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)。

2.6.4 結(jié)果分析 通過(guò)Graph pad 8.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。取4 個(gè)流分中化合物的含量為獨(dú)立變量，4 個(gè)流分的50%最低抑菌濃度（MIC50）作為因變量計(jì)算關(guān)聯(lián)度。如果灰色關(guān)聯(lián)度分析的值較低，則該化合物對(duì)白色念珠菌的MIC50較小，表明其可能具有較強(qiáng)抗菌活性。同理對(duì)其抑制NO 生成的活性結(jié)果進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 山楂核干餾液和4個(gè)亞流分的細(xì)胞活性

細(xì)胞活力測(cè)試結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)L-NAME質(zhì)量濃度為269.70μg·mL-1時(shí)，與對(duì)照組比較，對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞造成的損傷已經(jīng)基本恢復(fù)，故用作山楂核干餾液細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性藥組質(zhì)量濃度；山楂核干餾液在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)（質(zhì)量濃度不超過(guò)240μg·mL-1）時(shí)對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞不產(chǎn)生損傷，L-NAME、Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D質(zhì)量濃度分別不超過(guò)404.55、149.50、67.13、16.50、36.69μg·mL-1時(shí)對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞不會(huì)造成損傷。同時(shí)山楂核干餾液、L-NAME 和4 個(gè)亞流分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)LPS 刺激的RAW264.7細(xì)胞造成的損傷尚具有一定的恢復(fù)作用。

圖1 山楂核干餾液和4個(gè)亞流分對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞活性的影響（,n=3）

3.2 山楂核干餾液和4個(gè)亞流分體外抗炎活性

NO 測(cè)試結(jié)果（圖2）表明，L-NAME 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 量的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（193.01±27.66）μg·mL-1，質(zhì)量濃度為269.70μg·mL-1時(shí)NO產(chǎn)生量與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合L-NAME 細(xì)胞活性測(cè)試結(jié)果，選擇269.70μg·mL-1作為山楂核干餾液抗炎活性實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性藥組質(zhì)量濃度；山楂核干餾液顯著抑制了LPS刺激的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 的量，其IC50為（31.93±1.95）μg·mL-1，表明山楂核干餾液有較好的抗炎活性。4 個(gè)亞流分（Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D）對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 均有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞生成NO的IC50分別為10.86±0.76）、（6.25±0.81）、（5.57±0.70）、（19.20±0.42）μg·mL-1；其中Fr.C 和Fr.B 的IC50均較低，兩者抑制LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 作用明顯強(qiáng)于山楂核干餾液和L-NAME，抗炎活性佳，結(jié)合細(xì)胞活性測(cè)試結(jié)果，F(xiàn)r.C 約從33μg·mL-1開(kāi)始產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而Fr.B 約從67.13 μg·mL-1開(kāi)始產(chǎn)生細(xì)胞毒性，綜合考慮Fr.B抗炎活性和安全性最佳。

圖2 山楂核干餾液和4個(gè)亞流分對(duì)LPS激活的RAW264.7細(xì)胞中NO產(chǎn)生的影響（,n=3）

3.3 山楂核干餾液和4個(gè)亞流分體外抗菌活性

體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，AMB 抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的MIC50為（2.65±0.52）μg·mL-1，在其質(zhì)量濃度為4.69 μg·mL-1時(shí)，較2.34 μg·mL-1時(shí)的抑菌效果更佳，故作為山楂核干餾液抗菌活性實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性藥組質(zhì)量濃度；山楂核干餾液對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)有抑制作用，其MIC50為（2.72±0.03）mg·mL-1，且在測(cè)試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制作用呈現(xiàn)較好的劑量依賴性。Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D 對(duì)白色念珠菌均具有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，MIC50分別為（2.98±0.54）、（0.91±0.03）、（3.42±0.13）、（2.40±0.08）mg·mL-1，4 個(gè)流分中Fr.B 的抗菌活性最為顯著，其抑制白色念珠菌的作用明顯強(qiáng)于山楂核干餾液。

3.4 山楂核干餾液亞流分的GC-MS分析結(jié)果

為了進(jìn)一步研究并分析出山楂核干餾液中發(fā)揮體外抗炎和抗菌作用的主要有效成分。利用GC-MS測(cè)得山楂核干餾液4個(gè)亞流分的氣相色譜圖（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)山楂核干餾液4 個(gè)亞流分有12 個(gè)共有峰。對(duì)抗炎抗菌活性較高的Fr.B 流分譜圖進(jìn)行分析，主要呈現(xiàn)13 個(gè)色譜峰，其峰面積總和占到總峰面積的87.67%，具體質(zhì)譜信息見(jiàn)表2。

表2 山楂核干餾液4個(gè)亞流分GC-MS圖譜峰的指認(rèn)結(jié)果

圖4 山楂核干餾液4個(gè)亞流分的氣相色譜圖

3.5 山楂核干餾液抗炎灰色關(guān)聯(lián)度分析

采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究山楂核干餾液中發(fā)揮體外抗炎和抗菌作用的主要有效成分。以3.4 項(xiàng)下12 個(gè)共有成分峰面積為獨(dú)立變量，以4 個(gè)亞流分抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 的作用結(jié)果為因變量，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。所選的評(píng)價(jià)指標(biāo)與藥效呈負(fù)相關(guān)，r越低，抑制LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 的IC50越小，表明該化合物具有較強(qiáng)抗炎活性。結(jié)果顯示（表3），12 個(gè)成分對(duì)抗炎作用貢獻(xiàn)大小順序?yàn)?＞6＞2＞9＞8＞3＞7＞5＞11＞12＞10＞1，其中，色譜峰4、6、2 和9 號(hào)對(duì)山楂核干餾液抗炎作用貢獻(xiàn)較大。

3.6 山楂核干餾液抗菌灰色關(guān)聯(lián)度分析

在本研究中所選的評(píng)價(jià)指標(biāo)與藥效呈負(fù)相關(guān)，r越低，化合物對(duì)白色念珠菌的MIC50較小，表明該化合物具有較強(qiáng)抗菌活性。山楂核干餾液體外抑制白色念珠菌的灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果（表3）表明，12個(gè)成分對(duì)抗菌作用貢獻(xiàn)大小順序?yàn)?＞2＞9＞11＞7＞6＞5＞8＞10＞12＞3＞1，其中化合物4、2、9 和11 對(duì)山楂核干餾液抗菌作用貢獻(xiàn)較大。

表3 抗炎、抗菌活性關(guān)聯(lián)度分析

通過(guò)熱圖對(duì)4 個(gè)亞流分抗炎和抗菌灰色關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行可視化分析（圖5），結(jié)果表明，2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、1，2，5-三甲氧基-3-甲基苯、2，6-二甲氧基苯酚和乙酰丁香酮可能是山楂核干餾液抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 作用的關(guān)鍵活性成分；2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、乙酰丁香酮和二氫芥子醇可能是山楂核干餾液抑制白色念珠菌的關(guān)鍵活性成分。

圖5 山楂核干餾液4個(gè)亞流分12個(gè)共有峰峰面積與其抗炎IC50和抗菌MIC50活性的熱圖分析

4 討論

中藥譜效關(guān)系研究是將中藥化學(xué)成分譜圖與中藥藥效活性有機(jī)結(jié)合，采用相關(guān)性分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、主成分分析等多種數(shù)學(xué)分析模型，可多角度、更全面地進(jìn)行中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)、中藥有效部位篩選等[11-14]?；疑P(guān)聯(lián)度分析方法強(qiáng)調(diào)因素間相關(guān)程度的順序，其“幾何對(duì)應(yīng)”的特點(diǎn)也可使動(dòng)態(tài)指標(biāo)的原始信息得到充分的利用。該方法對(duì)樣本數(shù)量和數(shù)據(jù)規(guī)律性的要求較低，適用于評(píng)價(jià)中藥化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)聯(lián)程度，篩選功效成分[15-16]。

迄今為止，山楂核干餾液抗炎和抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，本研究中以LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞生成NO 模型評(píng)價(jià)4 個(gè)亞流分的抗炎作用，用微稀釋法評(píng)估其體外抑制白色念珠菌活性，采用GC-MS 對(duì)山楂核干餾液的4 個(gè)亞流分進(jìn)行分析，得到了12 個(gè)共有化合物，其中4-乙基-2-甲氧基苯酚可抑制生物膜的形成，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[17]；4-甲氧基-3-羥基苯乙酮具有抗炎活性，可防止醋酸引起的結(jié)腸損傷[18]；丁香醛是一種酚類(lèi)化合物，有抑制環(huán)氧合酶-2（COX-2）活性的作用，IC50為3.5 μg·mL-1[19]?？啡┻€具有多種生物學(xué)活性[20]，如增加活性氧的形成，對(duì)細(xì)胞器、核酸和蛋白質(zhì)造成損害，并干擾微生物的進(jìn)化[21-22]。此外，其還可以抑制初級(jí)代謝中的酶，如乙醇脫氫酶，進(jìn)而影響白色念珠菌的生長(zhǎng)[23]。實(shí)驗(yàn)又使用灰色關(guān)聯(lián)度分析法建立化學(xué)成分和抗炎抗菌作用的譜效關(guān)系，得出山楂核干餾液中各成分對(duì)抗菌抗炎作用貢獻(xiàn)的大小，并且篩選出山楂核干餾液中2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、1，2，5-三甲氧基-3-甲基苯、2，6-二甲氧基苯酚和乙酰丁香酮4 個(gè)成分為其體外抗炎作用的關(guān)鍵活性成分；2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、乙酰丁香酮和二氫芥子醇為其抗菌作用的關(guān)鍵活性成分。其中2，6-二甲氧基苯酚在抑制白色念珠菌的生長(zhǎng)中起重要作用，該結(jié)果與Rao 等[24]的研究一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚抗炎作用和抗菌作用均較強(qiáng)，因此其可能是治療霉菌性陰道炎的主要活性化合物，但體內(nèi)作用有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究結(jié)果為闡明山楂核干餾液抗炎和抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及山楂核干餾液質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為開(kāi)發(fā)具有抗炎和抗菌作用的山楂核干餾液新產(chǎn)品提供了參考。