夏溪　龔睿　張春英

摘要： 以5個不同花色的錦繡杜鵑品種為研究材料，通過超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-TOF-MS）方法對其花瓣中含有的花青素苷成分和含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，5個樣品花瓣中含有的花青素苷組成和含量存在明顯差異。矢車菊素類糖苷是錦繡杜鵑的主要糖苷類型，紫粉色的粉鶴品種和紫紅色的紫鶴品種中含有的花青素苷種類最多，紫紅色的紫鶴品種中飛燕草素類、錦葵素類、矮牽牛素類這3類的花青素苷種類和含量最高。玫紅色的玫瑰琉球紅品種中含有的花青素苷總量最高，推測玫紅色系中可能存在一些轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)花色素生物合成途徑的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素 3-半乳糖苷與花瓣的紅色著色相關(guān)，矢車菊花素 3-阿拉伯糖苷與花瓣的玫紅色著色相關(guān)，矮牽牛素 3-O-阿拉伯糖苷與加深花瓣的紫色著色相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 錦繡杜鵑;花色;花青素苷

中圖分類號： S685.21 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0207-07

Abstract： In this study， using Rhododendron pulchrum with five different colors as the research materials to analyze the components and contents of anthocyanin in petals by ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS）. The results showed that there were significant differences in the composition and content of anthocyanin in petals of five samples. Cyanidin glycosides were the main glycosides of Rhododendron pulchrum. Fenhe and Zihe contained the most anthocyanins. The contents and types of delphindin， malvidin and petunidin were highest in Zihe. Meiguiliuqiuhong contained the highest total amount of anthocyanins， which suggested that there may be some transcription factors up-regulating key genes in anthocyanin biosynthesis pathway. Delphinidin 3-galactoside is associated with red coloring of petals， cyanidin 3-arabinoside is associated with rose magenta coloring of petals， and the petunidin 3-O-arabinoside is associated with purpleness of petals in Rhododendron pulchrum.

Key words： Rhododendron pulchrum;flower color;anthocyanin

花色是植物的主要觀賞性狀。色素是植物花色呈現(xiàn)的基礎(chǔ)，植物體內(nèi)的色素類群主要為類黃酮、類胡蘿卜素、甜菜色素和葉綠素，其中類黃酮是最主要的色素。花青素苷是水溶性類黃酮色素中最重要的一類，廣泛存在于絕大部分陸生植物的液泡中，花卉中的主要呈色物質(zhì)大部分與之有關(guān)[1]。目前發(fā)現(xiàn)的天然花青素有天竺葵素（Pelargonidin）、矢車菊素（Cyanidin）、芍藥色素（Peonindin）、飛燕草素（Delphindin）、錦葵素（Malvidin）、矮牽牛素（Petunidin）和報春花素（Hirsutidin）等。目前應(yīng)用多種技術(shù)已在植物中鑒定了多種花青素苷的結(jié)構(gòu)[2-5]，共鑒定出700多種不同的花青素苷衍生物[6]。

杜鵑花屬（Rhododendron）植物花色豐富，具有很高的觀賞價值，關(guān)于其花青素苷的研究結(jié)果時有報道。目前已在杜鵑花中檢測出矢車菊素、天竺葵素、芍藥色素、錦葵素、飛燕草素和矮牽牛素等，其中主要以矢車菊素和飛燕草素為主[7]，這些花青素多以3-單糖苷和3，5-雙糖苷的形式存在[8]。在杜鵑花屬植物花瓣花青素苷成分方面已有部分研究[9-11]，研究人員發(fā)現(xiàn)在杜鵑花開花過程中，其花青素苷種類不變但含量差異極為顯著[12]。以上研究結(jié)果顯示，花青素苷種類和含量具有物種特異性。錦繡杜鵑（Rhododendronpulchrum）屬于杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬映山紅亞屬（Rhododendron Subgenus Tsutsusi）植物[13]，廣泛栽培于歐洲溫帶地區(qū)、亞洲和北美[14]，是中國常見的栽培杜鵑花類群[15]，具有較強的抗逆性，在長三角地區(qū)以及福建省、湖南省、廣東省的綠地栽培中應(yīng)用廣泛。Mizuta等認(rèn)為映山紅亞屬（Rhododendron Subgenus Tsutsusi）的紅色系花花青素以矢車菊素和芍藥色素為主，藍(lán)色系花花青素以飛燕草素、矮牽牛素和錦葵素為主[16]。目前關(guān)于錦繡杜鵑的研究主要集中在生物學(xué)、生理學(xué)[15，17-20]和分子標(biāo)記[21]等方面，有關(guān)花青素苷的研究多集中于提取方法[22]和抗氧化性[23]等，關(guān)于其花青素苷成分的分析僅見于錢大偉等的研究，該研究發(fā)現(xiàn)錦繡杜鵑紫色花瓣中主要花青素是芍藥色素，粉色花瓣中主要花青素是天竺葵素，而白色花瓣中未檢測到花青素[24]。但該研究僅分析了不同顏色錦繡杜鵑中含有的花青素類型，對每種花青素的具體糖苷結(jié)構(gòu)并未做進(jìn)一步的解析。

本研究以5種不同花色的錦繡杜鵑為研究對象，采用比色卡和色差儀描述植物花色的表型，利用超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-TOF-MS）方法對5種錦繡杜鵑花瓣中的花青素苷成分進(jìn)行分析，通過探討錦繡杜鵑花色和花青素苷組成及含量間的關(guān)系，為解析其呈色機理及新奇花色品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以白鶴（Baihe）、粉鶴（Fenhe）、大紅琉球紅（Dahongliuqiuhong）、玫瑰琉球紅（Meiguiliuqiuhong）、紫鶴（Zihe）5個錦繡杜鵑品種的花瓣為試驗材料，進(jìn)行花青素苷的組分和定量分析。試驗材料均栽植于上海植物園杜鵑園內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 比色和測色方法 取完全綻放的花瓣，在自然光下將花瓣中央部分與英國皇家園藝學(xué)會比色卡（RHSCC比色卡）進(jìn)行比較，使用色差儀（三恩施 NR10QC）測定花色的CIE表色系統(tǒng)中的L*、a*、b*值，每個品種隨機取3個單株作為重復(fù)。L*表示亮度，L*的數(shù)值與亮度呈正相關(guān)。a*反映紅色到綠色，a*為正值表示偏紅，a*為負(fù)值表示偏綠。b*反映黃色到藍(lán)色，b*為正值表示偏黃，b*為負(fù)值表示偏藍(lán)[25]。彩度C和色相角h分別根據(jù)公式C=1/2（a*2+b*2）和h=arctan（b*/a*）計算 [26]。

1.2.2 花青素苷成分的UPLC-Q-TOF-MS分析 采用Waters公司的超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（ACQUITY UPLC I Class UPLC/2D H Class&Vion IMS QTOF MS， UPLC-Q-TOF-MS），對花瓣花青素苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。稱取0.3 g花瓣樣品置于液氮中，加入2 ml 0.1%鹽酸甲醇提取液（甲醇∶水=70∶30，體積比）后渦旋2 min，轉(zhuǎn)置于KQ-500DE 超聲波清洗儀中25 ℃振蕩40 min，4 ℃避光提取2 h，期間每隔30 min渦旋混勻一次。隨后吸取含色素的上清液至新的離心管，于SIGMA 3K15 離心機中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)2次，取50 μl上清液于進(jìn)樣瓶上機檢測。色譜柱為WATERS ACQUITY UPLC BEH C18反相硅膠柱（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）。最佳分析條件為：流速為0.4 ml/min，柱溫45 ℃，進(jìn)樣體積1 μl，檢測波長520 nm。流動相組成為：A相，0.1%甲酸水;B相，0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序為：0 min，5% B相;3 min，20% B相;10 min，100% B相;12 min，100% B相;15 min，95% B相;19 min，95% B相。質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子源，采用正離子掃描模式，掃描范圍為50～1 000 m/z;毛細(xì)管電壓為2 000 V，錐孔電壓為40 V，錐孔氣流量為50 L/h，霧化氣流量為900 L/h，離子源溫度為115 ℃，干燥溫度為450 ℃，碰撞能量為6 eV/20～45 eV。利用Waters Mass Lynx V4.1分析質(zhì)譜結(jié)果。

1.2.3 花青素苷相對含量分析 以標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥色素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、錦葵素-3-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)品（購自Sigma公司），對花青素苷各組份進(jìn)行相對定量分析，重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用SPSS Statistics 22.0和Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 錦繡杜鵑花瓣花色表型

白鶴、粉鶴、大紅琉球紅、玫瑰琉球紅、紫鶴 5個杜鵑品種的花瓣顏色分別為白色、紫粉色、紅色、玫紅色和紫紅色（圖1）。各個品種的a*值、b*值、L*值、C值、h值見表1。

5種錦繡杜鵑中，顯示紅度的a*值在紅色和玫紅色品種中最高，白色品種中最低。顯示黃藍(lán)值的b*值在紅色品種中最高，玫紅色品種中次之，紫粉色品種中最低。與亮度相關(guān)的L*值在白色品種中最高，紫紅色品種中最低。C值表示彩度，C值越大，顏色越純，5個品種中紅色品種的C值最高，白色品種最低。5個錦繡杜鵑品種中的a*值與b*值、a*值與L*值、b*值與L*值、C值與L*值的線性擬合曲線見圖2，a*與L*呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R2=0.833 2），C值與L*值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R2=0.742 2），說明錦繡杜鵑花瓣的紅度和彩度越高，亮度越低。

2.2 錦繡杜鵑花瓣花青素苷的結(jié)構(gòu)

碎片離子峰m/z 271.06、287.05、303.05、301.07、317.06、331.08分別對應(yīng)天竺葵素（Pg）、矢車菊素（Cya）、飛燕草素（Dp）、芍藥色素（Pn）、矮牽牛素（Pt）和錦葵素（Mv）苷元。花青素苷的糖基化常見有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖和木糖等，糖基化反應(yīng)通常最先發(fā)生在3-羥基部位。根據(jù)花青素苷的特征質(zhì)荷比、分子離子峰、保留時間和A440/Avis-max值來推定花青素苷的結(jié)構(gòu)?；ㄇ嗨剀盏姆肿与x子峰裂解釋放m/z 132對應(yīng)為阿拉伯糖，m/z 162對應(yīng)一分子的己糖殘基。葡萄糖和半乳糖是參與花青素苷的常見己糖，由于花青素半乳糖苷洗脫時間小于葡萄糖苷[27]，因此花青素半乳糖苷出峰時間早于花青素葡萄糖苷，由此區(qū)分兩種糖苷類型。當(dāng) A440/Avis-max>30%時，其花青苷為 3-O-糖苷類型。

5個不同花色的錦繡杜鵑花瓣在520 nm波長下檢測出 14種花青素苷，以C1～C14為編號，見表2。其中C1、C2、C3是矢車菊素類糖苷，C4、C5、C6是芍藥色素類糖苷，C7、C8、C9是飛燕草素類糖苷，C10、C11是錦葵素類糖苷，C12是矮牽牛素類糖苷，C13是飛燕草素苷元，C14是矮牽牛素苷元。

2.3 錦繡杜鵑花瓣花青素苷的組成和含量

5個杜鵑品種中含有的花青素苷種類從少到高多分別是白鶴、玫瑰琉球紅、大紅琉球紅、粉鶴、紫鶴。紅度較高的玫瑰琉球紅和大紅琉球紅中均未檢測到錦葵素類糖苷。除白色品種外，其余品種中均含有較多種矢車菊素類糖苷，紅度最高的玫瑰琉球紅中含有的矢車菊素類糖苷種類最少。偏紫色調(diào)的粉鶴和紫鶴中含有的錦葵素類、飛燕草素類糖苷種類在所有品種中最多。

采用花青素苷標(biāo)準(zhǔn)品計算花瓣中花青素苷的相對含量。5個品種的花瓣中含有的花青素苷總量從低到高分別是白鶴、紫鶴、粉鶴、大紅琉球紅、玫瑰琉球紅。紅度最高的玫瑰琉球紅和大紅琉球紅的花青素苷總量最高，分別為200.47 μg/g和141.02 μg/g，矢車菊素類糖苷是這2個品種的主要花青素苷，分別占其總量的89.03%和98.42%。其中矢車菊素 3-O-葡萄糖苷在大紅琉球紅中占比最高，占總花青素苷含量的62.58%，而此糖苷在紅度最高的玫瑰琉球紅中未檢測到。粉鶴和紫鶴中含有的飛燕草素類、錦葵素類糖苷總量最高，這2類糖苷在紫鶴中的含量分別是在粉鶴中的7.04倍、5.24倍。5個品種中部分花青素苷由于響應(yīng)值太低計算的含量為負(fù)數(shù)，未列入表中（表3中定性檢測顯示“+”，定量未顯示數(shù)值）。

3 討論

本研究中紅度最高的2個品種中矢車菊素類糖苷含量最高，說明矢車菊素類糖苷是錦繡杜鵑花瓣紅色至紫紅色的主要呈色物質(zhì)。紅色的大紅琉球紅中積累了高濃度的矢車菊素3-O-葡萄糖苷，而此糖苷在玫紅色的玫瑰琉球紅中并未檢測到，說明矢車菊素 3-O-葡萄糖苷與加深花瓣的紅色著色相關(guān)。矢車菊素 3-阿拉伯糖苷在玫瑰琉球紅中的含量最高，推測矢車菊素 3-阿拉伯糖苷可能與錦繡杜鵑花瓣的玫紅色著色相關(guān)。矢車菊素和芍藥色素在錦繡杜鵑花瓣中的呈色與其他植物一致，它們的積累會影響花色的紅度[28]。飛燕草素決定花色藍(lán)色到藍(lán)紫色的變化[29]，但本研究發(fā)現(xiàn)并非所有的飛燕草素類色素都與藍(lán)紫色著色相關(guān)，飛燕草素 3-阿拉伯糖苷、飛燕草素 3-O-葡萄糖苷顯示與紫色著色相關(guān)，而飛燕草素 3-半乳糖苷僅在紅色樣品大紅琉球紅中檢測到，說明其可能有助于花瓣紅色的呈現(xiàn)。錦葵素類花青素苷僅在2個紫色品種中檢測到，這2個品種中還存在高含量的矮牽牛素 3-O-阿拉伯糖苷，說明矮牽牛素3-O-阿拉伯糖苷和錦葵素類花青素苷會使花瓣呈現(xiàn)紫紅色或藍(lán)紫色[30]。白鶴中檢測到花青素，猜測由于類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因等下游基因的缺陷，導(dǎo)致無色不穩(wěn)定的花青素?zé)o法轉(zhuǎn)化成有色穩(wěn)定的花青素苷[16]。其花瓣中間的綠色斑點，目前從花青素苷組成和含量水平上尚不能解釋其形成的原因。斑點成因復(fù)雜而且在不同品系中機制不同[31]，也有可能與轉(zhuǎn)座子的活性有關(guān)[32]。

錦繡杜鵑的花色缺少藍(lán)紫色，創(chuàng)新花色是錦繡杜鵑育種的主要目標(biāo)之一。一般認(rèn)為飛燕草素、錦葵素、矮牽牛素是培育藍(lán)紫色花卉的主要色素。然而本研究發(fā)現(xiàn)僅飛燕草素 3-阿拉伯糖苷、飛燕草素 3-O-葡萄糖苷、錦葵素 3-阿拉伯糖苷、錦葵素 3-O-葡萄糖苷和矮牽牛素3-O-阿拉伯糖苷這5種花青素苷含量的增加會促進(jìn)花瓣藍(lán)紫色化的程度。因此，選擇積累較高含量的藍(lán)紫色相關(guān)花青素苷和較少紅色相關(guān)花青素苷的樣本，可作為培育藍(lán)紫色錦繡杜鵑的理想親本。pH值也是影響杜鵑花色的重要因素，研究結(jié)果表明只有藍(lán)紫色相關(guān)花青素苷存在且表皮組織pH大于4的情況下，才能產(chǎn)生藍(lán)紫色[33]。黃酮和黃酮醇是重要的助色素物質(zhì)，對花色也有重要的影響。Heursel等認(rèn)為由于黃酮醇的存在導(dǎo)致映山紅雜交后代中出現(xiàn)了藍(lán)色調(diào)的花色[34]。因此，調(diào)節(jié)花青素苷和黃酮醇的合理比例，增加助色素含量，有助于擴大花色的變異。利用基因工程技術(shù)積累花瓣中的飛燕草色素培育藍(lán)色花已有相關(guān)報道[35]，可為錦繡杜鵑的分子育種提供借鑒。

4 結(jié)論

5種不同花色的錦繡杜鵑中共檢測到5種花青素，分別為矢車菊素、芍藥色素、飛燕草素、錦葵素和矮牽牛素。這5種花青素進(jìn)一步糖基化形成12種花青素苷。矢車菊素類糖苷是錦繡杜鵑的主要糖苷類型，其中飛燕草素 3-半乳糖苷有助于花瓣紅色的呈現(xiàn)，矢車菊素 3-O-葡萄糖苷與加深花瓣的紅色著色相關(guān)。矢車菊素 3-阿拉伯糖苷可能與錦繡杜鵑花瓣的玫紅色著色相關(guān)。飛燕草素 3-阿拉伯糖苷、飛燕草素 3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素3-O-阿拉伯糖苷和錦葵素類花青素苷有助于花瓣藍(lán)紫色的呈現(xiàn)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究花色的分子調(diào)控機制和花色新品種的培育提供了依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張震林）

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