張 瑋，董縉蕓，李雯雯，王新杰，吳建萍

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，鄭州 450052)

目前，心腦血管疾病仍嚴(yán)重威脅著人類的健康。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種常見(jiàn)的動(dòng)脈硬化性血管疾病，通常以血管內(nèi)皮損傷為始點(diǎn)，伴隨著炎癥、免疫反應(yīng)以及脂質(zhì)浸潤(rùn)等多過(guò)程[1]。微小RNA(microRNA, miRNA)是高度保守的小分子非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3'UTR非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)參與基因表達(dá)的調(diào)控，參與多種系統(tǒng)的生理病理過(guò)程，包括腫瘤、心腦血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌等[3，4]。研究顯示，miR-33在調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等方面發(fā)揮著重要作用，調(diào)控AS發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段。因此，miR-33可能成為AS的診斷、鑒別診斷、危險(xiǎn)分層及預(yù)后判斷的新型生物標(biāo)志物。大量中醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn)，miR-33與AS的脾虛痰濁證、氣虛血瘀證等證型密切聯(lián)系，中藥復(fù)方或單體可通過(guò)抑制miR-33改善炎癥和脂質(zhì)代謝起到防治AS的作用。本文就miR-33調(diào)控AS的相關(guān)靶點(diǎn)及中藥調(diào)控miR-33防治AS的研究進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究miR-33提供理論依據(jù)，也為AS的診斷和中藥治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 miR-33調(diào)控AS的作用機(jī)制

1.1 miR-33與炎癥

炎癥反應(yīng)的激活在AS的啟動(dòng)和進(jìn)展中起著核心作用，炎癥細(xì)胞的積累導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展[5]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的常見(jiàn)通路，通過(guò)誘導(dǎo)miR-33激活NF-κB途徑上調(diào)腫瘤壞死因子(tumor Necrosis Factor, TNF)α和白介素(interleukin, IL)6的表達(dá)，增加炎癥反應(yīng)[6]。除此之外，miR-33通過(guò)靶向于核受體相互作用蛋白(nuclear receptor interacting protein, NRIP)1的3'UTR來(lái)抑制NRIP1信號(hào)通路的活化，從而負(fù)性調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答[7]。AS斑塊中的巨噬細(xì)胞分為促炎巨噬細(xì)胞(M1型)和抗炎巨噬細(xì)胞(M2型)，巨噬細(xì)胞極化為M2型是AS斑塊消退的關(guān)鍵特征，抑制miR-33可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，延緩動(dòng)脈內(nèi)壁纖維化和減少炎癥的發(fā)生，從而減輕AS斑塊的負(fù)擔(dān)[8]。在miR-33介導(dǎo)的M2極化的過(guò)程中，需要腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)的激活[9]，并下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子肌筋膜纖維肉瘤癌基因同源物(musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog, Maf)B的表達(dá)[10]。由此推測(cè)，抑制miR-33減少炎癥因子的表達(dá)并促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化，可能是AS的潛在防治方法。

1.2 miR-33與自噬

巨噬細(xì)胞的自噬會(huì)導(dǎo)致膽固醇代謝受損和不良的胞葬等多種病理過(guò)程。在自噬過(guò)程中，蓄積在細(xì)胞質(zhì)中的脂滴被雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬小體后，與溶酶體結(jié)合并被溶酶體中的酸性水解酶水解，形成游離膽固醇，在跨膜蛋白的介導(dǎo)下從細(xì)胞質(zhì)流出至細(xì)胞外，隨血液循環(huán)回到肝臟進(jìn)行代謝，參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。自噬關(guān)鍵效應(yīng)因子，如自噬基因相關(guān)蛋白(autophagy-related protein, ATG)5/12、溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein, LAMP)1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)及AMPK信號(hào)通路依賴的轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白O3(forkhead box O3, FOXO3)、轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)共同調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)，沉默miR-33啟動(dòng)以上自噬調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)自噬通量，從而增強(qiáng)脂質(zhì)分解代謝和促進(jìn)凋亡細(xì)胞清除以減少斑塊壞死[12，13]。膽固醇流出實(shí)驗(yàn)表明，miR-33靶向人沉默調(diào)節(jié)蛋白(sirtuin, SIRT)6通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水解和流出，減少巨噬泡沫細(xì)胞的形成，進(jìn)而減少AS斑塊損傷面積[14]。因此，miR-33通過(guò)靶向自噬基因調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)和控制炎癥反應(yīng)，是延緩AS發(fā)生發(fā)展的重要途徑之一。

1.3 miR-33與線粒體功能

線粒體的主要功能是提供能量。目前研究證明，線粒體功能障礙會(huì)加重機(jī)體炎癥反應(yīng)及膽固醇蓄積的病理過(guò)程，加速AS病變的進(jìn)程。線粒體功能障礙激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NOD-like receptor protein, NLRP)3炎性小體，釋放活性IL-1β，血液?jiǎn)魏思?xì)胞被招募到炎癥血管壁，發(fā)展成M1型巨噬細(xì)胞[15]。同時(shí)線粒體功能障礙也會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積累，減少細(xì)胞膽固醇流出[16]。在維持線粒體功能中，8-氧鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNA glycosylase, OGG)1修復(fù)線粒體的氧化應(yīng)激損傷；過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferation-activated receptors, PPARs)調(diào)節(jié)線粒體氧化代謝；過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子(peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator, PGC)1α和線粒體膜溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族25中第25號(hào)成員(solute carrier family 25 member 25, SLC25A25)參與線粒體生物合成；丙酮酸脫氫酶激酶同工酶(Pyruvate dehydrogenase kinase isoenzyme, PDK)4負(fù)責(zé)線粒體呼吸；核呼吸因子(nuclear respiratory factor, Nrf)1和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)對(duì)線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[17，18，19]。抑制miR-33后可增加以上述基因的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞線粒體功能恢復(fù)，同時(shí)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇流出和改善巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[20，21]。此外，線粒體功能障礙會(huì)增加線粒體源性ROS、細(xì)胞色素C(cytochrome C, CytC)和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)的釋放，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體氧化應(yīng)激損傷和凋亡。miR-33可通過(guò)線粒體功能靶點(diǎn)改善脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)，然而miR-33對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的調(diào)控作用尚未明確，需要進(jìn)一步研究完善miR-33在線粒體功能中的重要作用。

1.4 miR-33與脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)代謝紊亂是AS的主要危險(xiǎn)因素之一，脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂時(shí)，脂質(zhì)聚積在動(dòng)脈內(nèi)壁上進(jìn)而形成斑塊，并對(duì)斑塊的穩(wěn)定性和血管腔狹窄造成影響[22]。大量研究表明，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的miRNAs中，miR-33被認(rèn)為是最重要的miRNAs之一，因?yàn)閙iR-33能夠調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵功能，包括膽固醇的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取、脂肪酸降解以及膽汁酸的合成與分泌。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在多種靶點(diǎn)的調(diào)控下，將膽固醇運(yùn)送到膽固醇合成、酯化、攝取和流出的適當(dāng)位置。單核巨噬細(xì)胞表面存在3種膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，即三磷酸腺甘結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)子(adenosine triphosphate-binding cassette, ABC)A1、G1及B類I型清道夫受體(scavenger receptor BI, SR-BI)[23]，通過(guò)抑制miR-33可調(diào)節(jié)ABCA1、ABCG1和SR-BI的表達(dá)，改善AS的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。C型1類尼曼-匹克蛋白(niemann-pick C1 protein, NPC1)是晚期核內(nèi)體和溶酶體中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的兩個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，是膽固醇流出和脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，miR-33直接靶向并抑制NPC1的表達(dá)[25]。敲除羥甾醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(oxysterol-binding protein-related protein, OSBPL)6可導(dǎo)致核內(nèi)體異常聚集，促進(jìn)細(xì)胞中游離膽固醇的積累，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇酯化減少。miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在OSBPL6中識(shí)別出miR-33結(jié)合位點(diǎn)，并在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[26]。與此同時(shí)，NF-κB信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)不僅介導(dǎo)AS進(jìn)程中的炎癥反應(yīng)，還可以通過(guò)NF-κB/miR-33a途徑上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出，可緩解胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[27]。

脂肪酸氧化水平降低和脂肪酸合成水平提高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，形成高甘油三酯引發(fā)AS。抑制miR-33能夠增加參與編碼脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶的表達(dá)，如肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT1A)、肉堿氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(carnitine O-Octanoyltransferase, CROT)、羥酰基輔酶a脫氫酶三功能多酶復(fù)合體亞基β(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional multienzyme complex subunit beta, HADHB)、蛋白激酶AMP活化催化亞基α1(protein kinase AMP activatedα1, PRKAA1)，同時(shí)可減少參與脂肪酸合成的關(guān)鍵酶的表達(dá)，如甾醇調(diào)控元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(sterol regulatory element-binding transcription factor, SREBF)1、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)、三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶(adenosine triphosphate citrate lyase, ACLY)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase, ACACA)，明顯抑制血漿超低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)和甘油三酸酯(triglyceride, TG)水平，減少脂質(zhì)在血管內(nèi)皮的沉積，降低AS發(fā)生發(fā)展的幾率[28]。

除此以外，膽汁酸合成和分泌等對(duì)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。膽汁酸合成、分泌及排泄障礙，體內(nèi)膽汁酸不足影響脂類物質(zhì)的吸收和代謝，使大量膽固醇在體內(nèi)積聚。在miR-33的沉默后，膽汁酸分泌的關(guān)鍵酶ABCB11、腺苷三磷酸酶酶I類8B成員1(ATPase class I type 8b member 1, ATP8B1)和膽汁酸合成的關(guān)鍵酶膽固醇7α羥化酶(cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1, CYP7A1)的表達(dá)明顯上調(diào)，促進(jìn)膽汁酸的合成與分泌，加速脂質(zhì)的體內(nèi)代謝[29，30]。以上結(jié)果說(shuō)明，miR-33通過(guò)膽固醇的流轉(zhuǎn)和攝取、脂肪酸降解以及膽汁酸的合成與分泌調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，通過(guò)靶向miR-33調(diào)控脂質(zhì)代謝在AS的進(jìn)程中起到重大作用。

筆者對(duì)上述miR-33調(diào)節(jié)AS的相關(guān)靶基因進(jìn)行總結(jié)，并利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建miR-33靶基因的蛋白間互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，綜合得分>0.4的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STRING[31]在線數(shù)據(jù)庫(kù)，分析蛋白質(zhì)之間的功能相互作用，可提供對(duì)疾病發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的見(jiàn)解。Cytoscape(版本3.8.2)[32]是一個(gè)開(kāi)放源碼的生物信息學(xué)軟件平臺(tái)，用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 中藥調(diào)節(jié)miR-33在防治AS中的作用機(jī)制

目前，AS的臨床治療主要采用降脂類及抗血小板類藥物，該治療方案作用靶點(diǎn)單一，會(huì)不可避免地阻斷正常生理運(yùn)行所需物質(zhì)的合成，造成肝腎功能損害。而miR-33通過(guò)調(diào)控AS進(jìn)程中的多靶點(diǎn)發(fā)揮療效作用，與中醫(yī)整體觀念與辨證論治相契合，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)和雙向性的特征。因此，深入研究中醫(yī)藥對(duì)miR-33的調(diào)控，將會(huì)為克服AS做出重大貢獻(xiàn)。

根據(jù)中醫(yī)證候分析，AS屬于“血濁”“瘀血”“痰濁”等范疇，臨床主要以活血化瘀通脈、健脾補(bǔ)氣、祛痰降濁、清熱解毒等為主要治則。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，不論是中藥復(fù)方湯劑還是中藥單體，都可通過(guò)miR-33及miR-33的靶向基因，有效抑制AS的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。在中藥復(fù)方研究方面，通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，張立的健脾祛痰化瘀自擬方[33]、劉仕利的通脈降濁煎劑[34]、秦合偉的血管軟化丸[35]、梁健的清脂通脈顆粒[36]均能抑制miR-33表達(dá)，同時(shí)還可影響SREBPs信號(hào)途徑及下游通路ABCG1、ABCA1、NPC1基因及蛋白表達(dá)，從而提高膽固醇的流出率，降低泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，在現(xiàn)代技術(shù)的基礎(chǔ)上提取出中藥單體，即復(fù)方中的有效成分。臨床治療心血管疾病的常見(jiàn)藥物有血脂康、冠心康膠囊等，血脂康、冠心康分別由紅曲、丹參單藥制成。在臨床試驗(yàn)中，Cao[37]等發(fā)現(xiàn)血脂康治療提高了患者血漿miR-33水平，同時(shí)增加細(xì)胞膽固醇輸出，減少AS的發(fā)生。丹參酮ⅡA是丹參酮中含量最豐富的生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)心腦血管等多種藥理活性作用。Yang C[38]等證實(shí)，丹參酮ⅡA可以通過(guò)下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中miR-33的表達(dá)，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮對(duì)AS的保護(hù)作用。除此以外，黃芪甲苷[39]、黃芪總黃酮[40]、枸杞多糖[41]、兒茶素[42]、荷葉生物堿[43]等通過(guò)減少miR-33的生成，調(diào)控ABCA1和NF-κB表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出和抑制炎癥反應(yīng)以改善AS。

miR-33在炎癥和脂質(zhì)代謝方面的常用靶點(diǎn)ABCA1、ABCG1、NPC1、NF-κB等已經(jīng)在中醫(yī)藥的研究中得到廣泛證實(shí)，但還有許多與炎癥和脂質(zhì)代謝相關(guān)靶點(diǎn)的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，如OSBPL6、CROT、CPT1A、HADHB、CYP7A1等。同時(shí)自噬與線粒體功能障礙也受miR-33的調(diào)控，并在AS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，而中醫(yī)藥在自噬與線粒體功能障礙等方面的研究還未展開(kāi)。因此，在miR-33的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中，這些都是尚未研究的調(diào)控靶點(diǎn)，中醫(yī)藥能否通過(guò)控制miR-33及下游靶點(diǎn)，發(fā)揮防治AS的作用，需要進(jìn)一步的明確。

3 展望

綜上所述，miR-33在AS的炎癥反應(yīng)、自噬、線粒體功能障礙和脂質(zhì)代謝等方面起到重要的調(diào)節(jié)作用。miR-33具有在血液中穩(wěn)定存在并可被檢測(cè)的特點(diǎn)，同時(shí)miR-33通過(guò)多個(gè)下游靶點(diǎn)形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，提示其具有作為AS診斷性生物標(biāo)志物和治療作用靶點(diǎn)的潛力。至今為止，AS的致病率、致殘率和病死率雖然有所下降，但仍然是導(dǎo)致血管疾病的主要病因。西藥通常使用的降脂藥和降血小板藥，雖對(duì)疾病有較高的治愈率，但存在胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損傷及影響其他正常生理功能等毒副作用，且西藥作用靶點(diǎn)單一，容易產(chǎn)生耐藥性。中藥是由天然物質(zhì)為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)變而來(lái)的，對(duì)人體傷害性較小，作用于人體也具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、雙向性的特征。現(xiàn)如今，從中醫(yī)藥處方中已挖掘出一部分中藥單體或復(fù)方，并在臨床與實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中被驗(yàn)證，中藥可通過(guò)miR-33調(diào)節(jié)炎癥、脂質(zhì)代謝等方面，對(duì)AS有明顯的療效。因此，進(jìn)行科學(xué)的實(shí)驗(yàn)深入研究中醫(yī)藥對(duì)miR-33的多靶點(diǎn)調(diào)控機(jī)制，可以挖掘出更多治療AS的中藥單體或復(fù)方，并且為中醫(yī)藥防治AS提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。