焦厚琪 霍詩天 閆黎明 李艷和 劉學芹

(1. 華中農業(yè)大學水產學院， 武漢 430070; 2. 湖北省水生動物病害防控工程技術研究中心， 武漢 430070)

與脊椎動物的機體免疫機制不同，無脊椎動物在進化過程中喪失了特異性免疫系統(tǒng)，取而代之的是它們擁有極為發(fā)達的非特異性免疫系統(tǒng)，以抵抗外界病原體的入侵和感染[1]。先天免疫系統(tǒng)主要有細胞免疫和體液免疫。細胞免疫包括血細胞對病原的吞噬，血細胞形成結節(jié)對病原體的固定及結節(jié)不斷積累形成包囊[2—4]。體液免疫主要是抗菌肽、黑色素和其他免疫因子的合成、釋放和發(fā)揮作用[5]。由于抗菌肽具有殺死或抑制微生物的能力， 因此它們在第一線發(fā)揮作用抵抗病原體的入侵[6]。

抗菌肽本質是一類具有生物活性的小分子多肽。目前在甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有抗脂多糖因子(ALFs)、甲殼素(Crustin)、溶菌酶(Lysozymes)和對蝦素(Penaeidin)等[7—9]。最早從岸蟹(C.maenus)的血淋巴中分離得到，經研究鑒定為甲殼素家族成員[10]， 隨著不斷的研究發(fā)現(xiàn)，更多的甲殼素成員在其他甲殼動物和昆蟲中被鑒定出來[11]。

甲殼素(Crustin)富含半胱氨酸并帶陽離子，一般包含N-端的信號肽、多域區(qū)(Multi-domain region)和C-端的WAP結構域[12]。多域區(qū)即富含多種不同氨基酸，包括半胱氨酸、脯氨酸或甘氨酸等。C-端的WAP結構域由約50個氨基酸構成，含有一個“4DSC”結構域，即由8個半胱氨酸殘基兩兩之間通過二硫鍵聯(lián)系形成的4對二硫鍵的結構[13]。據相關文獻報道，具有“4DSC”結構域的分子一般都有抑菌活性或蛋白酶抑制劑活性[14]。在結構分類上，根據WAP結構域的數(shù)量和多域區(qū)結構的不同，將甲殼素分為5種亞型[11]， 除了Ⅳ型有2個WAP結構域之外[16]， 其他4種亞型的甲殼素成員均只具有1個WAP功能結構域，它們的區(qū)別在于多域區(qū)的不同：Ⅰ型甲殼素的多域區(qū)富含半胱氨酸，這一類甲殼素通常存在于龍蝦和蟹類中[16，18]; Ⅱ型甲殼素的多域區(qū)富含半胱氨酸和甘氨酸，Ⅲ型甲殼素的多域區(qū)富含脯氨酸-精氨酸[18]， Ⅱ型和Ⅲ型甲殼素通常存在于對蝦中[20，20]; V型甲殼素的多域區(qū)富含半胱氨酸和芳香族氨基酸[11]， 這一類甲殼素在蟻類中首次發(fā)現(xiàn)[22]。

在甲殼類動物中已經鑒定了許多Crustin成員，多數(shù)可抑制革蘭氏陽性菌，小部分對革蘭氏陰性菌也具有抑菌效果[22—24]。最新的研究結果表明，甲殼素還具有一定的抗病毒功能[26，26]。此外，一些甲殼素分子具有蛋白酶抑制活性[28]， 這些結果表明了甲殼素在甲殼類動物先天免疫系統(tǒng)中的重要作用。在本研究中， 課題組擴增鑒定了來自克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)中的一種新型Crustin基因， 命名為Pc-CruL。進行了氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化分析; 同時檢測其在健康克氏原螯蝦中的組織分布情況及在不同細菌刺激下的表達變化， 并使用重組蛋白進行液體抑菌試驗測試了其抗菌活性; 另外， 還測定了外源重組蛋白對克氏原螯蝦感染副溶血弧菌的保護作用。結果表明，Pc-CruL是防御克氏原螯蝦細菌感染的重要免疫分子。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物克氏原螯蝦購自武漢市白沙洲水產批發(fā)市場， 重15—20 g。

質粒及菌株質粒pGEX-4T-1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為筆者所在實驗室所有；Trans5α感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞購于北京全式金；TRIzol、PCRmix、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性內切酶購自TaKaRa公司; T4 DNA連接酶購自賽默飛世爾科技公司; DNA純化回收試劑盒購自OMEGA公司。

引物序列根據GenBank中Procambarus clarkii crustin1基因序列(GQ301201.1)， 設計擴增crustin1基因CDS區(qū)全長的特異性引物， 上游加入酶切位點EcoR Ⅰ， 下游加入酶切位點BamH Ⅰ。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab. 1 Primers sequences

1.2 試驗方法

總RNA提取隨機取5只健康的克氏原螯蝦，分別提取不同組織器官的總RNA。使用預先裝有0.5 mL抗凝劑的2 mL無菌注射器，從克氏原螯蝦的腹部抽取血淋巴于無菌的1.5 mL EP管中，800×g4℃離心5min，棄上清，加入1 mL TRIzol，吹打混勻，冰浴5min。取鰓、胃、腸、心臟和肝胰腺各0.1 g于無菌的1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol，充分勻漿，將勻漿液收集于新的EP管中，冰浴5min。加入200 μL三氯甲烷，震蕩混勻，冰浴5min，12000×g4℃離心15min。離心后，各液相分層僅取上層水相至于無酶EP管中，加入等量異丙醇，混勻，冰浴10min，12000×g4℃ 離心10min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，洗滌沉淀，12000×g4℃離心5min，棄上清，重復洗滌1次。室溫干燥3—5min 待液體部分全部蒸發(fā)，加入30 μL DEPC水溶解，即得RNA。

RNA反轉錄使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。反轉錄條件如下：(1) gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL和RNA 1 μg，加H2O至10 μL，42℃條件下2min；(2) 5×Prime Spript Buffer 4 μL、Primerscript RT Engle Mix 1 μL和RT Primer Mix 1 μL，加RNase free H2O至10 μL，PCR儀中37℃反應15min，85℃反應5s，將cDNA于-20℃保存。

組織分布隨機取5只健康的克氏原螯蝦，分別提取肝胰腺、心臟、胃、腸、鰓和血淋巴的總RNA，進行反轉錄合成cDNA。并以cDNA產物為模板，進行qRT-PCR反應探究Pc-CruL基因在健康克氏原螯蝦的各個組織器官中的相對表達量。引物為qPCR-Pc-CruL-F/R(表1)， 內參為18S rRNA，引物18S-F/R(表1)。體系為：cDNA 2 μL，qPCRPc-CruL-F/R各0.8 μL， SYBR?Premix ExTaqTMⅡ10 μL。程序為：95℃ 1min；95℃ 15s；58℃20s；72℃ 20s，45個循環(huán)。qRT-PCR反應重復3次，數(shù)據采用2-ΔΔCt法分析。

表達模式將體重大小基本相同的健康克氏原螯蝦隨機分為5組，每組包含30只，并使用無菌的微量注射器，向克氏原螯蝦體內注射不同的病原細菌。分別注射25 μL的濃度為1×107CFU/mL的金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和副溶血弧菌，對照組克氏原螯蝦注射25 μL無菌的PBS。在注射后0h、3h、6h、12h及24h分別取鰓、血淋巴和胃并使用TRIzol法提取總RNA，將RNA反轉錄為cDNA。通過qRT-PCR反應探究 Pc-CruL 基因在克氏原螯蝦感染病原細菌后，血淋巴、鰓和胃在感染后不同時間點的表達變化。qRT-PCR反應重復3次，結果數(shù)據用2-ΔΔCt法分析。

重組質粒的構建(1) PCR擴增目的基因。參考Pc-CruL基因CDS區(qū)序列設計擴增引物Pc-CruL-F/R(表1)。使用反轉錄的血淋巴組織的cDNA作為模板進行PCR擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。(2) 將PCR回收產物和pGEX-4T-1質粒用限制性內切酶 EcoR Ⅰ和 BamHⅠ于37℃培養(yǎng)箱中酶切4h，連接并轉化到感受態(tài)細胞Trans5α中。具體步驟為：冰上靜置30min；42℃水浴鍋中熱激90s后迅速插入冰上再次靜置2min；向感受態(tài)細胞加入500 μL的LB培養(yǎng)基，于37℃搖床培養(yǎng)45min；取200 μL菌液涂布到含氨芐抗生素的LB瓊脂平板，置于37℃過夜培養(yǎng)。

重組質粒的提取及陽性克隆鑒定挑選單克隆菌落，接種到4 mL含0.1%氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床培養(yǎng)8—12h，并提取重組質粒。以Pc-CruL-F和Pc-CruL-R為引物進行PCR，跑膠鑒定，將陽性質粒送往武漢擎科進行測序。測序結果與 Procambarus clarkii crustin 1 基因序列(GQ301201.1)進行比對。

重組蛋白原核表達將質粒轉化至感受態(tài)細胞BL21(DE3)之后接種至LB液體培養(yǎng)基，在1 mmol/L IPTG 16℃誘導12h后，離心，將菌液重懸進行高壓破碎，離心收取上清與沉淀，制備蛋白樣品，通過SDS-PAGE分析表達情況。

重組蛋白純化步驟如下：將5 mL pEGX-4T-1-Pc-CruL表達菌株轉接到500 mL含0.1%氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)4h左右，在1 mmol/L IPTG 16℃誘導12h后，4℃ 12000 r/min離心收集細菌，PBS重懸，高壓破碎，4℃條件下12000 r/min離心30min，收取上清。采用GSTSefinose柱子進行親和柱純化，加入100 mL的PBS充分洗滌柱子，將過濾后的上清液緩慢加到柱子中，使重組蛋白與GST填料充分結合；加50 mL的Binding/WashBuffer清洗柱子，除去雜蛋白，最后用20 mL的Elution Buffer進行洗脫并將洗脫液收集于1.5 mL的EP管中。

抑菌實驗使用幾種常見的病原性細菌進行抑菌試驗。步驟如下：將細菌在37℃搖床培養(yǎng)過夜，10000 r/min離心15min，用PBS洗3次，用PB培養(yǎng)基(Poor broth media：1%胰蛋白胨，0.5%氯化鈉，pH 7.5)重懸，分別取20 μL濃度為2.5×109CFU/mL的副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌于新的1.5 mL EP管中，再向其中加入20 μL濃度為1 μg/μL的Gst-Pc-CruL重組蛋白，陰性對照組使用GST-Tag蛋白及Elution Buffer，最后再加入160 μL的PB培養(yǎng)基混勻，于37℃搖床孵育16h，使用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。實驗重復3次。

克氏原螯蝦存活率檢測將體重大小基本相同的健康克氏原螯蝦隨機分為4組，每組30只。首先向克氏原螯蝦注射25 μL濃度為1 μg/μL的重組蛋白Gst-Pc-CruL和GST-Tag，1h后注射25 μL濃度為5×107CFU/mL的副溶血弧菌，將僅注射PBS的克氏原螯蝦作為陰性對照組，僅注射副溶血弧菌的克氏原螯蝦作為陽性對照組。感染后每隔6h統(tǒng)計克氏原螯蝦的死亡情況，計算存活率。實驗在一個月內重復3次。

2 結果

2.1 Pc-CruL序列比對分析

從健康克氏原螯蝦的血淋巴組織中擴增出 Pc-CruL 編碼區(qū)的全長序列，結果表明 Pc-CruL 的編碼區(qū)全長330 bp，編碼109個氨基酸，C-端含有一個wap結構域。將克氏原螯蝦和其他的甲殼類動物的 crustin 序列blast分析，發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦與淡水螯蝦 crustin 的同源性高達64%，與青蟹 crustin 的同源性較低，僅有23%。生物信息學分析顯示克氏原螯蝦 Pc-CruL 主要與淡水螯蝦和羅氏沼蝦的crustin 親緣關系較近，與中國對蝦 crustin 、 日本龍蝦 crustin 及中華絨螯蟹 crustin 的序列同源性較低，進化上親緣關系較遠(圖1)。綜上分析， Pc-CruL 在甲殼素家族的結構分類上屬于Ⅰ型甲殼素分子。

圖1 Pc-CruL和其他物種crustin進化樹分析Fig. 1 Neighbor-joining tree of Pc-CruL and crustin of other species

2.2 Pc-CruL在克氏原螯蝦中的組織分布

通過qRT-PCR檢測 Pc-CruL 基因在健康克氏原螯蝦的各個組織中的相對表達量情況，qRTPCR結果表明 Pc-CruL 在健康克氏原螯蝦的血淋巴、心、鰓、胃、腸道和肝胰腺中均有表達，其中 Pc-CruL 在血淋巴中的表達量最高，在肝胰腺中的表達量最低(圖2)。

圖2 Pc-CruL組織分布Fig. 2 Tissue distribution of Pc-CruL

2.3 Pc-CruL表達模式

Pc-CruL在健康克氏原螯蝦的血淋巴、心、鰓、胃、腸道和肝胰腺中均有表達，為了進一步探究Pc-CruL基因在克氏原螯蝦抵抗外來病原菌入侵和感染的過程中是否發(fā)揮了作用，在鰓、胃和血淋巴中進一步檢測，探究健康克氏原螯蝦在受到病原細菌感染之后，Pc-CruL基因在鰓、胃和血淋巴的相對表達量的變化情況。克氏原螯蝦在外源注射幾種不同的病原細菌后，Pc-CruL基因在血淋巴中的表達模式并不相同。在注射金黃色葡萄球菌后，血淋巴組織中的Pc-CruL基因的mRNA水平在3h時便顯著上調(圖3A)， 嗜水氣單胞菌刺激后， 下調表達， 直到12h后上調后又開始下調(圖3C)， 然而Pc-CruL基因的表達水平并不依賴于副溶血弧菌刺激(圖3B)。與血淋巴不同，Pc-CruL基因在鰓中的表達模式相對一致，在金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌刺激后，Pc-CruL基因在3h時表達量最好后下調并保持較低的水平(圖4)。胃組織中的Pc-CruL基因在金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激后，表達水平一直較低，直到24h后才有明顯上調(圖5A和5B)， 而在嗜水氣單胞菌感染后一直處于較低的表達水平(圖5C)。總而言之，與注射了PBS的陰性對照組相比，當克氏原螯蝦感染不同的病原菌時，Pc-CruL基因的表達量在鰓、胃和血淋巴均有明顯差異，表明了Pc-CruL基因與克氏原螯蝦抵抗外來病原菌入侵的免疫反應相關。

圖4 鰓中Pc-CruL表達模式Fig. 4 The expression profiles of Pc-CruL in gill

圖5 胃中Pc-CruL表達模式Fig. 5 The expression profiles of Pc-CruL in stomach

2.4 Pc-CruL的重組表達和蛋白純化

Pc-CruL基因目的片段長度為330 bp，編碼109個氨基酸，為了探究Pc-CruL蛋白在體內和體外的生物學功能，構建重組質粒PEGX-4T-1-Pc-CruL，重組Pc-CruL蛋白大小約為37 kD，其中包含了25 kD GST-Tag標簽，使用GST-Tag親和柱純化并獲重組取蛋白。

2.5 Pc-CruL體外抑菌試驗

為了檢測Pc-CruL是否影響病原細菌的生長，進行抑菌實驗測定。將Pc-CruL重組蛋白與幾種病原菌在37 ℃下孵育12h后，使用血球計數(shù)板在顯微鏡下進行計數(shù)。計數(shù)結果表明，與重組Pc-CruL蛋白共孵育的病原細菌數(shù)量相比于陰性對照組及GST-Tag組明顯較低，重組Pc-CruL蛋白對幾種病原菌均有一定的抑制作用(圖6)， 且抑菌效果呈現(xiàn)濃度依賴型(圖7)。重組Pc-CruL蛋白對副溶血弧菌的MIC50為1 μmol/L，對金黃色葡萄球菌的MIC50為1.3 μmol/L，對嗜水氣單胞菌的MIC50為2.7 μmol/L，對維氏氣單胞菌的MIC50為2.5 μmol/L，重組Pc-CruL蛋白對副溶血弧菌的抑菌效果最明顯。

圖6 Pc-CruL的液體抑菌測定結果Fig. 6 The results of liquid antibacterial assay for Pc-CruL

圖7 Pc-CruL的液體抑菌測定結果Fig. 7 The results of liquid antibacterial assay for Pc-CruL

2.6 Pc-CruL對克氏原螯蝦感染副溶血弧菌后存活率的影響

上述實驗發(fā)現(xiàn)了Pc-CruL蛋白在體外對幾種病原菌具有一定的抑菌效果，為了進一步明確Pc-CruL蛋白的功能，探究Pc-CruL蛋白在克氏原螯蝦體內發(fā)揮的作用，向克氏原螯蝦體內注射Pc-CruL蛋白后，體內注射副溶血弧菌，每隔6h統(tǒng)計死亡數(shù)量并計算存活率。注射副溶血弧菌(Vibrio)組，Gst-Tag+Vibrio組的克氏原螯蝦在60h后，存活率僅為30%—40%，而注射了Pc-CruL+Vibrio的克氏原螯蝦存活率大約為65%(圖8)。Pc-CruL重組蛋白能夠在一定程度上保護副溶血弧菌對克氏原螯蝦的感染，提高存活率，對克氏原螯蝦具有一定的保護效果。

圖8 Pc-CruL蛋白可以提高感染副溶血弧菌克氏原螯蝦的存活率Fig. 8 Pc-CruL protein increases the survival rate of Procambarus clarkii infected with vibrio

3 討論

1999年在岸蟹中發(fā)現(xiàn)了甲殼素家族中的首位成員，是一種可以抑制革蘭氏陽性菌生長的抗菌肽[10]。甲殼素作為甲殼類動物體內重要的免疫因子，已經在不同種類的甲殼類動物中鑒定和報道[11]。本研究從健康克氏原螯蝦的血淋巴中擴增和鑒定了一種新型Crustin基因，并將其命名為Pc-CruL。Pc-CruL的序列全長為933 bp，其中包含330 bp編碼109個氨基酸的編碼區(qū)，遺傳進化生物信息學分析顯示與先前研究鑒定的type-Ⅰcrustin序列同源性為36.87%[6]， 與Pc-crustin4序列同源性為62.33%[28]，是一種新的甲殼素成員。從蛋白結構上分析，Pc-CruL的N-端具有一個低復雜性區(qū)域，C-端為WAP結構域。在低復雜性區(qū)域和WAP結構域之間存在1個精氨酸殘基、5個脯氨酸殘基和5個半胱氨酸殘基。參考Pc-CruL的序列鑒定和分析，將Pc-CruL分類為Ⅰ型甲殼素分子[16]。

為了探究Pc-CruL在克氏原螯蝦體內是否發(fā)揮功能，研究了Pc-CruL在健康克氏原螯蝦中的各個組織器官的相對表達水平和克氏原螯蝦在幾種病原細菌刺激后的實時表達水平的變化情況。組織分布結果表明Pc-CruL在健康克氏原螯蝦的血淋巴中的含量最高，在肝胰腺中的含量最低(圖2)?？赡苁且驗闄C體產生抗菌肽和免疫因子一般發(fā)生在血淋巴細胞中，血淋巴細胞也在機體發(fā)生免疫反應時發(fā)揮了重要作用[29，31]， 而在其他器官中表達較低的原因可能是血淋巴細胞的浸潤和黏附所致[6]。用幾種不同的病原菌注射感染健康的克氏原螯蝦后，Pc-CruL在鰓、血淋巴和胃中的表達水平和PBS對照組相比有不同程度的上調(圖3—5)。綜上，Pc-CruL參與了健康克氏原螯蝦感染病原細菌的免疫防御過程，Pc-CruL是克氏原螯蝦體內重要的先天免疫防御因子。

圖3 血淋巴中Pc-CruL表達模式Fig. 3 The expression profiles of Pc-CruL in hemocytes

甲殼素通常抑制革蘭氏陽性菌，但一些也可以抑制革蘭氏陰性菌[31，32]。甲殼素帶陽離子，其抑菌機制被認為是甲殼素與微生物的細胞膜發(fā)生靜電作用后，甲殼素結合在細胞膜表面并行成跨膜通道，破壞膜的結構改變其通透性，導致菌體內容物外流，使細菌死亡[33]。有研究表明，從日本對蝦和斑節(jié)對蝦中分離鑒定到的甲殼素，其抑菌機制主要是通過破壞細菌的細胞壁[34，35]; 而克氏原螯蝦中已報道的甲殼素蛋白在抑菌方面的機制尚未報道[6，28]， 作為新的甲殼素蛋白，Pc-CruL的抑菌機制不清楚，是否通過裂解破壞細菌的細胞壁達到抑菌效果，值得后續(xù)的研究。本研究中，通過體外液體抑菌試驗發(fā)現(xiàn)Pc-CruL對幾種常見的病原菌具有較好的抑菌功能(圖5); 注射重組Pc-CruL蛋白，可以顯著提高克氏原螯蝦感染副溶血弧菌的存活率(圖6)， 表明 Pc-CruL 在克氏原螯蝦抵抗外界病原細菌入侵中發(fā)揮著關鍵的作用。總而言之， Pc-CruL 作為Ⅰ型甲殼素蛋白家族新成員，是克氏原螯蝦的重要免疫防御分子，在抵抗病原入侵和感染中起著重要的作用。