任國梁 董志國 ， 李德盛 夏 青 柳佳玲 崔振權 梁夏菲

(1. 江蘇海洋大學， 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室， 連云港 222005; 2. 江蘇海洋大學， 江蘇省海洋生物技術重點實驗室， 連云港 222005; 3. 江蘇省海洋生物技術協(xié)同創(chuàng)新中心， 連云港 222005)

化感作用(Allelochemical)是植物或微生物向周圍環(huán)境中釋放化學物質進而影響到其他植物生長的一種克生作用[1—3]。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是在海洋中廣泛分布的一種優(yōu)質硅藻餌料， 常被應用于蝦、蟹、貝的苗種餌料[4—6]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種重要的生防芽孢桿菌(Bacillus subtilis)， 可分泌對多種真菌與細菌有抑制作用的化學物質， 如脂類抗生素、寡肽酶、抑菌蛋白類及一些細胞外物質等[7—10]。解淀粉芽孢桿菌被廣泛應用于抑制病原菌等方面，如解淀粉芽孢桿菌BN-9對大腸桿菌具有抑制作用[11]，解淀粉芽孢桿菌G1對痢疾病原菌具有拮抗作用[12]，及對植物病毒如黃瓜花葉病毒(CMV)和甜瓜花葉病毒(MMV)的侵染等[13]。除了抑制作用， 有研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌FZB45具有肌醇六磷酸酶活性，可以在缺磷的條件下刺激植物生長[9]。而且解淀粉芽孢桿菌微膠囊無毒， 對養(yǎng)殖水體中的理化因子的影響也在常見水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的安全濃度范圍內(nèi)， 因此被作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的水質改良劑而大面積應用[14]。近年來， 研究大型水生植物浸取液與微藻之間的化感作用日益增多[15—18]， 但是在微生物尤其是解淀粉芽孢桿菌對海洋微藻的作用方面的研究相對較少。本文以海水中常見的硅藻餌料三角褐指藻為實驗材料， 探究解淀粉芽孢桿菌及其分泌物對三角褐指藻的化感作用。

1 材料與方法

1.1 菌株獲得及其代謝物的制備

供試菌株為解淀粉芽孢桿菌B5， 由本實驗室從對蝦養(yǎng)殖海水中直接分離、篩選、鑒定后備用。用種子培養(yǎng)基接種經(jīng)發(fā)酵后的解淀粉芽孢桿菌制備種子培養(yǎng)液， 再用發(fā)酵培養(yǎng)基接種種子培養(yǎng)液制備發(fā)酵液。

種子培養(yǎng)基: 葡萄糖、磷酸氫二鉀各2.5 g， 胰蛋白胨17 g， 氯化鈉25 g， 蒸餾水1000 mL， 121℃， 滅菌0.5h。

發(fā)酵培養(yǎng)基: 玉米粉2.9 g， 豆餅粉12.5 g， 磷酸氫二鉀1.5 g， 氯化鈉27.6 g， 蒸餾水1000 mL， 121℃，滅菌0.5h。

發(fā)酵采用16 L發(fā)酵罐。發(fā)酵條件: 裝液系數(shù)0.75， 初始pH 7.5， 接種量3%， 發(fā)酵溫度31℃， 機械攪拌轉速180 r/min， 通氣量1.2 vvm， 發(fā)酵周期36h。

代謝產(chǎn)物獲取方法: 取部分發(fā)酵產(chǎn)物在0.22 μm的微孔的條件下進行超濾， 得到解淀粉芽孢桿菌菌液和其代謝產(chǎn)物; 另一部分不經(jīng)超濾， 為解淀粉芽孢桿菌液和代謝產(chǎn)物的混合液， 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 三角褐指藻培養(yǎng)條件

供試三角褐指藻藻種取自上海海洋大學藻種室。初始濃度為1×105cells/mL， 逐級擴培后于5 L錐形瓶中長期培養(yǎng)。自然海水取自江蘇連云港周邊海域， 經(jīng)抽濾、滅菌后使用。光照培養(yǎng)箱參數(shù)設置為: 溫度20℃， 光強63 μmol photons/(m2·s)， 光暗比為12h∶12h。營養(yǎng)液為含硅的f/2培養(yǎng)液。每天定時取樣且搖動培養(yǎng)瓶， 期間維持藻液pH在7.9—8.1。

1.3 三角褐指藻生長曲線的繪制

用血球計數(shù)板計數(shù)， 并換算長期培養(yǎng)藻液的濃度。稀釋藻液， 使其濃度分別為原來的20%、40%、60%、80%和100%， 在663 nm波長處分別測量吸光值， 繪制藻密度與吸光度的線性標準曲線，為后續(xù)計算三角褐指藻細胞數(shù)提供參考。

1.4 解淀粉芽孢桿菌對三角褐指藻的化感作用

本次實驗所用錐形瓶規(guī)格為250 mL， 使用前均經(jīng)反復沖洗及高壓滅菌處理。將處于對數(shù)生長期的三角褐指藻50 mL接種到200 mL新鮮培養(yǎng)液中，初始密度為每毫升1.83×106個(1.83×106ind./mL)。實驗進行4d， 菌-藻共培條件同1.2。

實驗設置對照組、實驗組和空白組3個不同組別， 每處理三次重復。對照組只接種三角褐指藻(I組); 實驗組分為3組， 每組先接種與對照組等量的三角褐指藻， 再分別接種數(shù)量級為109的解淀粉芽孢桿菌液(菌液組P+B)、解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物(代謝物組P+M)、解淀粉芽孢桿菌液及代謝產(chǎn)物混合液(混合液組P+BM)， 添加量分別為100、500和1000 μL; 空白組也分為三組， 不接藻種， 分別對應對照組添加相同劑量的解淀粉芽孢桿菌添加液。每天定時測量每組的吸光值， 計算三角褐指藻細胞濃度， 其中實驗組藻細胞濃度計算時， 最終吸光值為對照組吸光值減去對應空白組的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

抑制率公式:PI(%)＝(1-N/N0)×100%。其中，N0和N分別為對照組三角褐指藻濃度和試驗組三角褐指藻濃度;PI為抑制比例，PI=50%時對應的濃度為EC50。

數(shù)據(jù)用SPSS 23軟件做顯著性分析， 并進行Duncan多重比較， 以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結果

2.1 解淀粉芽孢桿菌菌液對三角褐指藻生長的影響

與對照組相比， 在前3天時P+B100、P+B500、P+B1000三組的生長率沒有顯著變化， 但是三角褐指藻的藻細胞數(shù)均低于對照組， 到第4天時藻細胞數(shù)顯著低于對照組(P＜0.05， 圖1)。P+B100組抑制率呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢， P+B500與P+B1000兩組在第1天時抑制率顯著高于P+B100組， 到第2天有所下降， P+B100組抑制率在第3天開始大幅度增加，對應的藻細胞數(shù)增加速率放緩， P+B500組在第2至第3天抑制率顯著增加， 所對應的藻細胞數(shù)最少(圖2)。實驗結束， P+B100、P+B500和P+B1000的三角褐指藻藻細胞數(shù)分別比對照組低28.52%、35.56%和22.36%。

圖2 添加解淀粉芽孢桿菌菌液組三角褐指藻抑制率Fig. 2 Inhibition rate of P. tricornutum added with B. amyloliquefaciens bacterial solution

2.2 解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對三角褐指藻生長的影響

在第1至第4天P+M100、P+M500和P+M1000三組藻細胞數(shù)均顯著低于對照組(P＜0.05)， 到第3天P+M1000組藻細胞數(shù)與其他三組相比迅速降低， 表現(xiàn)出很好的抑制性， 隨著解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物添加量增加， 三角褐指藻生長率隨之減少， P+M1000組在第3天發(fā)現(xiàn)藻細胞數(shù)降低的現(xiàn)象(圖3)。P+M100、P+M500和P+M1000三組在第1天抑制率增長迅速，在第2至第3天3組抑制率的增長均放緩， 在第3至第4天P+M100和P+M500兩組抑制率有所下降，P+M1000抑制率迅速升高(圖4)。實驗結束， P+M100、P+M500和P+M1000的三角褐指藻藻細胞數(shù)分別比對照組低11.80%、41.20%和56.69%。

圖3 添加解淀粉芽孢桿菌代謝物組三角褐指藻生長曲線Fig. 3 Growth curve of P. tricornutum with the metabolite group of B. amyloliquefaciens

圖4 添加解淀粉芽孢桿菌代謝物組三角褐指藻抑制率Fig. 4 Inhibition rate of P. tricornutum in the metabolite group of B. amyloliquefaciens

2.3 解淀粉芽孢桿菌及代謝產(chǎn)物混合液對三角褐指藻生長的影響

與對照組相比， P+BM100、P+BM500和P+BM1000三組三角褐指藻均生長緩慢， 在第1至第2天P+BM1000藻細胞數(shù)呈下降趨勢， P+BM100和P+BM500藻細胞數(shù)第1至第3天呈緩慢增長的態(tài)勢，在第3至第4天則開始降低， P+BM1000組則明顯低于其他三組(圖5)。P+BM100、P+BM500和P+BM1000三組對三角褐指藻均表現(xiàn)出了較好的抑制性， 但都沒有超過50%， 在第2天時P+BM1000組抑制率超過50%達到了51.32%。到第3天時P+BM500和P+BM1000兩組對三角褐指藻的抑制率均超過50%， 分別達到了54.87%與65.05%(圖6)。實驗結束， P+BM100、P+BM500和P+BM1000三組的藻細胞數(shù)分別比對照組低了37.32%、54.93%和64.96%。

圖5 添加混合液組三角褐指藻生長曲線Fig. 5 Growth curve of P. tricornutum with mixed solution group

圖6 添加混合液組三角褐指藻抑制率Fig. 6 Inhibition rate of P. tricornutum in mixed solution group

2.4 相同條件下不同添加物對三角褐指藻生長的影響

添加解淀粉芽孢桿菌菌液、代謝產(chǎn)物以及混合物三組三角褐指藻細胞數(shù)均低于對照組， 添加物的量的不同對藻細胞數(shù)的數(shù)量也有影響。除P+B100組外， 其余各組藻細胞數(shù)均隨著添加物的量的增加而減少。添加物的量相同時， 除P+M100組外， 其余實驗組均表現(xiàn)為解淀粉芽孢桿菌菌液、代謝產(chǎn)物、混合物依次減少的現(xiàn)象(圖7)。而三者對三角褐指藻的抑制率則同三角褐指藻的藻細胞數(shù)相反(圖8)， 除P+B500組外， 其余實驗組抑制率均隨添加物的增加而增加， 且P+BM500、P+M1000和P+BM1000三組對三角褐指藻的抑制率均達到50%以上， 分別為54.87%、56.67%和65.05%。

圖7 添加不同物質組三角褐指藻細胞數(shù)Fig. 7 Number of P. tricornutum cells with different substance groups

圖8 添加不同物質組三角褐指藻抑制率Fig. 8 Inhibition rate of P. tricornutum with different substance groups

3 討論

化感作用是植物或者微生物向周圍環(huán)境中釋放代謝產(chǎn)物從而影響與它臨近的植物或微生物的生長[19]。研究表明， 水生植物與微生物之間的化感作用可以對水域生態(tài)系統(tǒng)的結構造成影響， 過去近30年中， 許多研究學者對“藻-菌”相互關系進行探索， “藻-菌”相互關系一直是海洋微藻研究方面的熱點[20—24]。解淀粉芽孢桿菌作為一類重要的生防微生物， 不僅對植物生長具有促進作用， 其在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物還可抑制藻類生長。朱芝秀等[25]在對解淀粉芽孢桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)， 從鯽腸道分離得到一株解淀粉芽孢桿菌菌株JX001對嗜水氣單胞菌具有較好的抑制作用。許波[26]在進行一株芽孢桿菌溶藻活性物質的分離及結構分析的研究中發(fā)現(xiàn)， 解淀粉芽孢桿菌A對銅綠微囊藻905A具有溶藻性， 同時發(fā)現(xiàn)T1芽孢桿菌是一株擁有高效殺藻作用的菌株， 具有較強的溶藻活性。李成果[27]研究發(fā)現(xiàn)， 芽孢桿菌的抑菌物質伊枯草菌具有抑制植物A病原菌孢子生長的作用， 解淀粉芽孢桿菌L3不僅對西瓜枯萎病發(fā)生具有防控作用， 同時對西瓜的生長具有明顯的促生作用。本研究在實驗室中探究了解淀粉芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物對三角褐指藻生長的影響。結果表明， 解淀粉芽孢桿菌、其代謝產(chǎn)物和兩種混合液均表現(xiàn)出了抑制三角褐指藻生長的特性， 解淀粉芽孢桿菌對三角褐指藻的抑制作用不明顯， 代謝產(chǎn)物和兩種的混合液對三角褐指藻表現(xiàn)出了明顯的抑制效果。

本研究在培養(yǎng)介質中， 添加解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物組與添加混合液組明顯抑制了三角褐指藻的生長， 說明解淀粉芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物有抑制作用且存在一個閾值， 在這個閾值之下， 存在著濃度效應， 濃度越高抑制作用越明顯。這與于靚等的研究結果一致， 他們認為解淀粉芽孢桿菌T1所產(chǎn)生的溶藻活性物質在一定藻細胞數(shù)范圍內(nèi)， 抑藻效果隨著T1無菌濾液濃度的增加而顯著加強[28]。在同等的濃度下， 添加解淀粉芽孢桿菌組不如其他兩組抑制作用明顯， 添加混合液組與添加代謝產(chǎn)物組所顯示出的抑制作用遠強于添加解淀粉芽孢桿菌組，添加混合液組的抑制作用又比添加代謝產(chǎn)物組更強， 由此說明解淀粉芽孢桿菌與其代謝產(chǎn)物對三角褐指藻的抑制作用可以疊加， 二者同時存在時抑制效果最強。而這兩組表現(xiàn)出的抑制效果沒有特別大的差異。由此說明解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物在對三角褐指藻產(chǎn)生的抑制效果中起主要作用。

綜上所述， 解淀粉芽孢桿菌對三角褐指藻沒有明顯的抑制作用， 但其高濃度的代謝產(chǎn)物與兩者混合液可有效的抑制三角褐指藻的生長， 并存在著一個閾值， 在這個閾值之下， 具有濃度效應， 濃度越高抑制效果越明顯， 解淀粉芽孢桿菌與其代謝產(chǎn)物對三角褐指藻的抑制作用可以疊加， 二者同時存在時抑制效果最強。