葛紅梅 周雅茹 柳詩(shī)鶯 王賢哲 韓興燁 汪淑廉 胡春香

(1. 湖北工業(yè)大學(xué)河湖生態(tài)修復(fù)與藻類(lèi)利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430068; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 武漢 430072)

34億年前， 藍(lán)藻是地球上唯一的光合自養(yǎng)生物，當(dāng)今， 它仍然是很多生境中非常重要的光合植物類(lèi)群， 特別是作為嚴(yán)酷貧瘠生境中最早的初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)地球生態(tài)系統(tǒng)的形成和演化起著非常重要的作用。而它成功拓殖的根源很大部分來(lái)自細(xì)胞外的胞外多糖(Exopolysaccharides， EPS)， 因這部分的存在大大提高了藍(lán)藻抵抗干旱、輻射、風(fēng)沙和鹽堿等多種脅迫的能力[1，2]。

藍(lán)藻光合作用的初級(jí)產(chǎn)物大多數(shù)是糖原[3]。雖然糖原不僅調(diào)節(jié)胞內(nèi)碳濃度、抵御饑餓[4]， 還具有抵抗鹽脅迫和氧化損傷的功能[5]， 但為了抵御和適應(yīng)多種脅迫環(huán)境， 藍(lán)藻還分配相當(dāng)?shù)哪芰康桨?，特別地形成由緊密結(jié)合的莢膜多糖(Capsular polysaccharides， CPS)和松散結(jié)合能分泌到周?chē)h(huán)境中的釋放多糖(Released polysaccharides， RPS)構(gòu)成的EPS。而且由于糖原[6]和EPS[7，8]誘人的工業(yè)應(yīng)用前景， 大量研究都只關(guān)注其中一方的積累， 僅少量研究探討了藍(lán)藻糖原和EPS在同一培養(yǎng)條件下的變化規(guī)律， 如Ge等[9]研究發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)度明顯影響具鞘微鞘藻細(xì)胞內(nèi)糖原與胞外EPS的分配格局; Myriam等[10]通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和統(tǒng)計(jì)分析， 推斷出光強(qiáng)、溫度、高鹽和氮限制是能影響鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospira platensis)EPS和糖原合成和分泌的環(huán)境因子， 其中光強(qiáng)的影響作用最明顯， 而并未在實(shí)驗(yàn)條件下研究鈍頂節(jié)旋藻在同一培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞中碳流在糖原/EPS代謝生物合成途徑中的分配。大量研究發(fā)現(xiàn)， 氮限制[6]、光[6，7，9]、鹽[3]和重金屬[8]脅迫等逆境環(huán)境明顯刺激藍(lán)藻EPS的分泌或糖原的合成， 在沙漠環(huán)境中， 營(yíng)養(yǎng)元素的匱乏是極其常見(jiàn)的?；诖?，本文以分布在生物土壤結(jié)皮中的藍(lán)藻優(yōu)勢(shì)種具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatusGomont)為實(shí)驗(yàn)材料，研究其在不同營(yíng)養(yǎng)元素缺失條件下細(xì)胞胞外EPS和胞內(nèi)糖原合成的規(guī)律， 以探究具鞘微鞘藻胞外多糖和糖原代謝合成過(guò)程中碳流分配規(guī)律， 從而深入了解結(jié)皮藍(lán)藻抵抗逆境的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藻種及其培養(yǎng)

具鞘微鞘藻(FACHB-896)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)， 最初分離自騰格里沙漠沙坡頭試驗(yàn)站的生物結(jié)皮中。M. vaginatus在10 L BG-11[11]培養(yǎng)基中通氣培養(yǎng)， 收集藻體， 并用蒸餾水清洗3遍后轉(zhuǎn)接到含50 mL培養(yǎng)基的100 mL的錐形瓶中。培養(yǎng)基為分別缺失NO3-、PO43-、Mg2+、Ca2+和Fe2+離子的BG-11及BG-11; BG-11培養(yǎng)基為對(duì)照， 缺失NO3-、PO43-、Mg2+、Ca2+和Fe2+離子的培養(yǎng)基分別為BG-11中未加入NaNO3、K2HPO4、MgSO4、CaCl2和檸檬酸鐵銨等化合物。藻種和實(shí)驗(yàn)藻體都在25℃(±1℃)， 40 μE/(m2·s)單側(cè)白質(zhì)光連續(xù)光照培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行， 每瓶每天手動(dòng)搖4次。

1.2 生物量測(cè)定

在培養(yǎng)第4和第8天取樣， 每次取樣20 mL， 藻體用蒸餾水清洗1遍后， 8000×g離心4min， 真空冷凍干燥(Christ ALPHA 1-2 LD plus， German)后稱重。

1.3 光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光合效率(Fv/Fm)的測(cè)定

取2 mL藻液， 暗適應(yīng)15min后， 然后用便攜式植物效率分析儀(PEA， Hansatech ， UK)測(cè)定其光合活性。最大熒光時(shí)的飽和脈沖為1500 μE/(m2·s)。

1.4 葉綠素a含量的測(cè)定

葉綠素a含量的測(cè)定參照Lan等[12]的方法， 稱取一定的干樣， 然后置于研缽中， 在避光條件下，80%的丙酮溶液中研磨藻細(xì)胞， 4℃冰箱中避光放置一夜， 離心后測(cè)定上清液在663、490和384 nm波長(zhǎng)下的吸光值。按公式葉綠素a含量=1000×(1.02×A663-0.0.027×A384+ 0.01×A490)/92.5 計(jì)算， 單位mg/g。

1.5 糖的測(cè)定

收集藻細(xì)胞后的培養(yǎng)基用于測(cè)定釋放的多糖(Released polysaccharides， RPS)的含量[13]; 細(xì)胞莢膜多糖(Capsular polysaccharides， CPS)含量的測(cè)定參照葛紅梅等[14]的方法， 將稱重干藻加蒸餾水于80℃水浴6h， 離心(3000×g， 15min)后， 上清液用分子截留量3500 D的透析袋透析2d， 然后測(cè)定糖含量?？偟陌舛嗵?Extracellular polysaccharides， EPS)是RPS和CPS含量的總和。細(xì)胞內(nèi)總糖的測(cè)定參照葛紅梅等[14]的方法進(jìn)行。RPS、CPS和細(xì)胞內(nèi)總糖的定量測(cè)定均用苯酚硫酸法進(jìn)行[15]。

糖原的測(cè)定參照Ge等[9]的方法， 將干藻樣用80%乙醇清洗， 加入蒸餾水于120℃高壓1h， 用α淀粉葡糖苷酶于57℃過(guò)夜， 然后按照測(cè)定葡萄糖的方法進(jìn)行[16]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)值是3個(gè)平行的平均值， 數(shù)據(jù)利用Oneway ANOVA 進(jìn)行方差分析， 在SPSS 18.0軟件上進(jìn)行。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)生長(zhǎng)的影響

如圖1所示， 無(wú)論是在第4還是第8天，M. vaginatus在分別缺NO3-和Mg2+培養(yǎng)基的生物量明顯低于對(duì)照(全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基;P＜0.05)， 而在分別缺少Ca2+和Fe2+培養(yǎng)基中的生物量與對(duì)照的幾乎相同(P＞0.05; 圖1); 在缺 P O34-培養(yǎng)基中的生物量在第8天時(shí)明顯低于對(duì)照(P＜0.05)。

圖1 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)具鞘微鞘藻生物量的影響Fig. 1 Effects of nutrient deficiency on biomass of M. vaginatus

2.2 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)Fv/Fm和葉綠素a含量的影響

如圖2所示， 在培養(yǎng)的第4和第8天， 在缺NO3-的培養(yǎng)基中，M. vaginatusPSⅡ的最大光合效率(Fv/Fm)明顯高于對(duì)照(P＜0.01)， 缺P(pán)O43-培養(yǎng)物的Fv/Fm值明顯低于對(duì)照(P＜0.01; 圖2)， 而缺Mg2+培養(yǎng)物的Fv/Fm值與對(duì)照無(wú)明顯差異(P＞0.05; 圖2)。缺Ca2+或缺Fe2+培養(yǎng)物在第4天時(shí)的Fv/Fm值均明顯高于對(duì)照(P＜0.05; 圖2)， 而在第8天時(shí)， 與對(duì)照的無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05)。

圖2 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)具鞘微鞘藻Fv/Fm的影響Fig. 2 Effects of nutrient deficiency on Fv/Fm of M. vaginatus

如圖3所示， 無(wú)論是在培養(yǎng)的第4還是第8天， 缺NO3-或缺Mg2+的M. vaginatus培養(yǎng)物， 其葉綠素a含量均明顯低于其他處理(P＜0.01)， 而缺Ca2+或缺Fe2+培養(yǎng)物的葉綠素a含量與對(duì)照的無(wú)明顯差異(P＞0.05; 圖3)。缺P(pán)O43-培養(yǎng)物在培養(yǎng)第4天時(shí)的葉綠素a含量與對(duì)照無(wú)明顯差異(P＞0.05)， 而到第8天時(shí)， 明顯低于對(duì)照(P＜0.01; 圖3)。

圖3 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)具鞘微鞘藻葉綠素a的影響Fig. 3 Effects of nutrient deficiency on chlorophyll a of M.vaginatus

2.3 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)EPS各部分及其總量的影響

圖4a顯示了在營(yíng)養(yǎng)缺失條件下M. vaginatus釋放到培養(yǎng)基中RPS的情況。與對(duì)照相比， 實(shí)驗(yàn)設(shè)定的營(yíng)養(yǎng)缺失條件并未刺激M. vaginatus釋放RPS， 相反， 第8天時(shí)， 在分別缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+培養(yǎng)基中的RPS量均明顯低于對(duì)照(P＜0.05)， 缺Fe2+培養(yǎng)基中RPS量與對(duì)照幾乎相同(P＞0.05)。

如圖4b所示， 無(wú)論是在培養(yǎng)的第4還是第8天，缺NO3-培養(yǎng)物的CPS含量明顯低于對(duì)照(P＜0.01)，而缺P(pán)O43-或缺Mg2+培養(yǎng)物的CPS含量均與對(duì)照無(wú)明顯差異(P＞0.05)， 缺Ca2+或缺Fe2+培養(yǎng)物的CPS含量均明顯高于對(duì)照(P＜0.05; 圖4b)。各處理的RPS/CPS比值都小于1， 尤其在第8天時(shí)， 分別缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+培養(yǎng)物的RPS/CPS比值都明顯低于對(duì)照(P＜0.01; 圖4c)， 即表明在營(yíng)養(yǎng)缺失條件下，M. vaginatus在胞外合成EPS過(guò)程中， 優(yōu)先合成CPS， 較少合成RPS。

營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)M. vaginatusEPS的影響如圖4d所示。無(wú)論是在培養(yǎng)的第4還是第8天， 缺NO3-或缺P(pán)O43-培養(yǎng)物合成的EPS量均明顯少于對(duì)照(P＜0.01)，而缺Mg2+、Ca2+或Fe2+培養(yǎng)物的EPS量均與對(duì)照無(wú)明顯差異(P＞0.05; 圖4d)。

圖4 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)具鞘微鞘藻RPS、CPS、RPS/CPS、EPS的影響Fig. 4 Effects of nutrient deficiency on RPS， CPS， RPS/CPS and EPS of M. vaginatus

2.4 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)細(xì)胞內(nèi)總糖的影響

圖5顯示了在營(yíng)養(yǎng)缺失條件下M. vaginatus細(xì)胞內(nèi)總糖的情況。在培養(yǎng)第4天時(shí)， 各處理間的細(xì)胞內(nèi)總糖無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05); 到第8天時(shí)， 缺NO3-培養(yǎng)物胞內(nèi)總糖含量明顯高于其他各處理組(P＜0.01)， 而缺P(pán)O43-、Mg2+、Ca2+或Fe2+培養(yǎng)物的胞內(nèi)總糖含量均與對(duì)照無(wú)明顯差異(P＞0.05; 圖5)。

圖5 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)具鞘微鞘藻細(xì)胞內(nèi)總糖的影響Fig. 5 Effects of nutrient depletion on total intracellular carbohydrate of M. vaginatus

2.5 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)糖原的影響

圖6顯示了在營(yíng)養(yǎng)缺失條件下M. vaginatus合成糖原的情況。與對(duì)照相比， 無(wú)論是在培養(yǎng)的第4還是第8天， 缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+等營(yíng)養(yǎng)鹽均明顯促進(jìn)了M. vaginatus體內(nèi)糖原的合成(P＜0.01)， 而缺Fe2+直到第8天時(shí)才明顯促進(jìn)了糖原的合成(P＜0.01)。

圖6 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)具鞘微鞘藻糖原的影響Fig. 6 Effects of nutrient depletion on glycogen of M. vaginatus

2.6 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)EPS/糖原比值的影響

如圖7所示， 無(wú)論在培養(yǎng)的第4還是第8天， 缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+的培養(yǎng)物其EPS/糖原比值在1.7—8.0， 且明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)， 而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 各培養(yǎng)條件下EPS/糖原比值基本無(wú)變化(P＞0.05)。

圖7 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)具鞘微鞘藻EPS/糖原比值的影響Fig. 7 Effects of nutrient depletion on the ratio of EPS/glycogen in M. vaginatus

3 討論

3.1 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)生長(zhǎng)的影響

氮、磷、鎂、鈣等大量元素及鐵等微量元素是非固氮藻類(lèi)生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素， 當(dāng)某種元素長(zhǎng)期缺乏時(shí)， 生物體的生長(zhǎng)和生理功能則受到一定抑制[17，18]。在本研究中， 缺NO3-、PO43-或Mg2+明顯影響了藻體的生長(zhǎng)和葉綠素a的合成， 而Ca2+或Fe2+的缺乏則對(duì)這兩項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯影響。氮和鎂是葉綠素的主要組成元素， 因而可能對(duì)該藻的生長(zhǎng)和葉綠素a合成影響更為明顯， 而藻細(xì)胞內(nèi)鈣和鐵元素在短時(shí)期內(nèi)能滿足自身生長(zhǎng)和葉綠素a合成的需求。

3.2 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)EPS分泌的影響

有研究發(fā)現(xiàn)， 影響藍(lán)藻EPS分泌的主要營(yíng)養(yǎng)元素包括可利用的碳、氮、磷和硫[19，20]， 其中碳和氮主要通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)的碳氮比例而影響EPS的分泌，即當(dāng)碳氮比大于一定閾值時(shí)， 藻細(xì)胞向外分泌EPS[19，21]。一般氮限制因抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)， 造成體內(nèi)碳的過(guò)剩， 而明顯促進(jìn)藍(lán)藻EPS的分泌[19，21]。在多數(shù)情況下， 缺磷、低磷或缺硫條件可以刺激藍(lán)藻胞外多糖的釋放[22，22]。一般而言， 磷濃度的增加基本不影響胞外多糖的產(chǎn)量。鹽濃度(NaCl)的增加促進(jìn)EPS的分泌與藻細(xì)胞通過(guò)分泌EPS抵抗環(huán)境逆境有關(guān)[13，23]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 氮缺乏明顯抑制M .vaginatus分泌RPS、CPS和EPS， 且限制了其生長(zhǎng)， 這與以前的大多數(shù)研究結(jié)果相反， 但與Tiscner和Davis等[24]的研究結(jié)果相同。這可能是因?yàn)榈荕. vaginatus生長(zhǎng)和體內(nèi)物質(zhì)合成的重要元素， 缺乏氮素時(shí)， 細(xì)胞內(nèi)蛋白合成受到限制， 但胞內(nèi)碳含量并未過(guò)剩， 將有限的能量用于生長(zhǎng)和體內(nèi)代謝等， 但不向外分泌RPS， 則就明顯抑制了EPS的分泌。磷缺乏也抑制M. vaginatusRPS和EPS的分泌，與以前在魚(yú)腥藻Anabaenaspp.、膠鞘藻Phormidiumsp.和曲殼藻Achnanthes brevipes中研究結(jié)果相似[25，27]。鎂、鈣或鐵缺乏既不影響M. vaginatusEPS的分泌， 也不影響其生長(zhǎng)， 這與在2種藍(lán)桿藻Cyanothece16Som2和C.closterium中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似[22，27]。這些結(jié)果說(shuō)明EPS的分泌受培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)元素的影響。氮、磷、鎂、鈣或鐵的缺乏并未刺激M. vaginatus總EPS的分泌， 很可能是由于細(xì)胞傾向?qū)⒛芰績(jī)?yōu)先存儲(chǔ)在體內(nèi)， 幫助其抵抗?fàn)I養(yǎng)缺失時(shí)的不良環(huán)境， 使碳流較少向外輸出。

3.3 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)RPS和CPS分配模式的影響

藍(lán)藻的EPS是由緊密結(jié)合的CPS和松散結(jié)合的RPS組成， 它們對(duì)細(xì)胞的功能和重要性上也是有偏重[28]， 合成膠鞘有利于保護(hù)藻細(xì)胞[29]， 而分泌RPS是為改善細(xì)胞外界的環(huán)境， 如增加周?chē)h(huán)境中有機(jī)碳含量和酶活性[1]。以前研究發(fā)現(xiàn)， 水華藍(lán)藻Microcystis aeruginosa[30，31]在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的EPS中以CPS為主， Nicolaus等[26]研究發(fā)現(xiàn)一些藍(lán)藻以CPS為主， 而一些藍(lán)藻以RPS為主。在我們的研究中， 與對(duì)照相比，M. vaginatus在營(yíng)養(yǎng)元素缺失條件下， 在向胞外分泌的EPS中， 分泌更多的CPS， 而較少分泌RPS。這說(shuō)明在營(yíng)養(yǎng)元素受到限制時(shí)，M.vaginatus將有限的能量?jī)?yōu)先合成利于自身生存的CPS。這種經(jīng)濟(jì)合理的能量分配模式將十分有利于其在貧瘠沙漠地區(qū)生存。

3.4 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)糖原合成的影響

目前， 外界環(huán)境因素對(duì)糖原合成的影響已有很多報(bào)道， 主要集中在營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件方面。在藍(lán)藻中， 當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺失抑制細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)或突然增加能量輸入時(shí)， 糖原會(huì)大量積累[4，5，32]。氮限制會(huì)明顯促進(jìn)藍(lán)藻糖原的積累[4，5，33]。磷、硫磷限制同樣會(huì)促進(jìn)極大節(jié)旋藻Arthrospira maxima體內(nèi)糖原的積累[33]。有研究發(fā)現(xiàn)高鹽濃度同樣會(huì)明顯促進(jìn)極大節(jié)旋藻Synechococcus elongatusPCC 7942和集胞藻Synechocystissp. PCC 6803糖原的積累[4，5]。在我們的研究中， 氮和磷缺乏也明顯促進(jìn)了藍(lán)藻體內(nèi)糖原的積累， 而且發(fā)現(xiàn)鎂、鈣或鐵缺乏也明顯促進(jìn)糖原的合成， 尤其是氮或鎂缺乏對(duì)糖原合成促進(jìn)作用最明顯?？赡苁且?yàn)榈玩V限制明顯抑制了M. vaginatus的生長(zhǎng)和葉綠素a的合成， 而光合活性并未受到抑制， 將過(guò)剩的碳用于體內(nèi)糖原的積累， 因而氮和鎂缺乏時(shí)的促進(jìn)糖原合成作用最明顯。而磷的缺乏限制了M. vaginatus的生長(zhǎng)， 但對(duì)葉綠素a的合成沒(méi)影響， 鈣和鐵的缺乏對(duì)M. vaginatus的生長(zhǎng)和葉綠素a的合成都無(wú)明顯影響， 因而磷、鈣和鐵的缺乏對(duì)糖原的積累作用要弱些。這些結(jié)果說(shuō)明在短暫營(yíng)養(yǎng)缺失條件下， 細(xì)胞會(huì)存儲(chǔ)能量物質(zhì)， 但不同的營(yíng)養(yǎng)離子限制對(duì)其累積作用是有差異的。這些結(jié)果進(jìn)一步表明糖原含量的增高可能與其抵抗逆境環(huán)境有關(guān)。

3.5 營(yíng)養(yǎng)缺失對(duì)EPS和糖原分配模式的影響

在營(yíng)養(yǎng)缺失時(shí)， 具鞘微鞘藻傾向存儲(chǔ)糖原， 但仍將高于合成糖原的碳流用于合成EPS。尤其在氮缺乏時(shí)， EPS/糖原值最小， 細(xì)胞內(nèi)總糖含量最高， 細(xì)胞分配能量更經(jīng)濟(jì)。營(yíng)養(yǎng)缺失明顯影響具鞘微鞘藻EPS和糖原的分配格局， 這種能量分配模式可能十分有利于其在貧瘠沙漠地區(qū)生存。

4 結(jié)論

(1) NO3-、PO43-或Mg2+缺乏明顯抑制了M. va-ginatus的生長(zhǎng)和葉綠素a的合成(P＜0.05)， 而Ca2+或Fe2+缺乏則這兩個(gè)指標(biāo)無(wú)明顯影響(P＞0.05)。(2)氮、磷、鎂、鈣或鐵的缺乏均未刺激M. vaginatus總EPS的分泌(P＞0.05)， 而明顯促進(jìn)了糖原的合成(P＜0.01)。營(yíng)養(yǎng)缺失明顯影響了該藻在合成EPS和糖原方面的能力和物質(zhì)分配， 細(xì)胞傾向?qū)⒐烫籍a(chǎn)物以糖原形式存儲(chǔ)在體內(nèi)， 幫助其抵抗?fàn)I養(yǎng)缺失時(shí)的不良環(huán)境。(3)營(yíng)養(yǎng)缺失時(shí)，M. vaginatus在合成EPS的過(guò)程中， 將有限的能量?jī)?yōu)先分配用于合成利于自身生存的CPS， 較少向外分泌RPS， 這種經(jīng)濟(jì)合理的能量分配模式將十分有利于其在貧瘠沙漠地區(qū)生存。(4)營(yíng)養(yǎng)缺失明顯影響具鞘微鞘藻EPS和糖原的分配模式， 這種能量分配模式可能十分有利于其抵抗貧瘠沙漠環(huán)境。