齊建軍 孫紅霞 趙建利

北京洛娃日化有限公司，北京，101300

1 研究背景

隨著新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情全球大范圍流行，消毒作為預(yù)防控制疾病擴散、避免疫區(qū)交叉感染的重要環(huán)節(jié)，成為社會關(guān)注的熱點。使用消毒劑是進行消毒的主要手段，消毒劑的需求大幅度提高導(dǎo)致一時物資緊缺，及時供應(yīng)迫在眉睫，作為生產(chǎn)消毒劑的日化行業(yè)責無旁貸。

消毒劑的種類繁多，合適的場所和條件下合理使用正確種類的消毒劑至關(guān)重要，過度使用可能導(dǎo)致達不到消毒效果和消毒劑的浪費，使用不當會造成安全問題或者對人體造成傷害。冠狀病毒的粒子囊膜由雙層脂質(zhì)組成，是化學消毒劑的主要作用部位，其對乙醚、氯仿和其他脂溶劑敏感，SARS病毒和新型冠狀病毒（2019-nCoV）均為親脂病毒，因此其對消毒劑的抗力比較弱，對熱力、紫外線和中低效消毒劑均很敏感。中國疾病預(yù)防控制中心專家指出，75%乙醇、乙醚、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，同時季銨鹽類消毒對新冠病毒也有很好的殺滅效果。

冠狀病毒不耐熱、喜干燥，但是低溫、低濕環(huán)境有利于冠狀病毒生存，所以進口冷鏈食品成為新冠病毒很好的“藏身之所”，需要開發(fā)一款刺激性小、腐蝕性低、穩(wěn)定性好、殺菌效果可靠的低溫型消毒液。乙醇、乙醚、氯仿屬于易燃易爆物，在儲存和使用過程中存在火災(zāi)隱患，同時易揮發(fā)，開啟后需要在短期內(nèi)盡快使用，當濃度降低后消毒效果會明顯下降。含氯消毒劑和過氧乙酸有著明顯的缺陷，其腐蝕性非常強，有刺激性氣味，穩(wěn)定性差，不易保存。

2 季銨鹽的特點

季銨鹽是一類重要的陽離子表面活性劑，由叔胺和烷化劑反應(yīng)制得，被廣泛用作外科手術(shù)和醫(yī)療器械的殺菌消毒劑，工業(yè)循環(huán)水處理的殺菌滅藻劑，油田水回注的處理劑，林業(yè)和建筑行業(yè)的防腐劑，家庭個人、公共衛(wèi)生和硬表面的洗滌消毒劑，家畜的消毒洗凈劑，肉類、蛋類和其他食品加工設(shè)備的洗凈殺菌劑，以及用于配制具有殺菌功能的洗衣液、洗手液等洗滌產(chǎn)品。季銨鹽消毒劑的作用機制主要是其在水中帶正電荷，可以吸附于帶負電荷的微生物表面，形成微團，通過滲透作用進入細胞膜的類脂層和蛋白層，從而改變細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)容物外滲，導(dǎo)致微生物死亡；同時又凝固蛋白質(zhì)，使酶和結(jié)構(gòu)蛋白變性，破壞微生物的代謝，將微生物殺死[1]。銨鹽烷基通過與細菌表面蛋白質(zhì)分子結(jié)合，改變細菌胞膜的通透性，繼而發(fā)生溶胞作用，破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)，引起細菌死亡，達到滅菌的效果[2]。

季銨鹽種類繁多，按照其結(jié)構(gòu)不同，可分為單長鏈季銨鹽、雙長鏈季銨鹽、雙長鏈雙季銨鹽和其他季銨鹽。單長鏈季銨鹽常見的是烷基二甲基芐基鹵化銨和烷基二甲基苯氧乙基鹵化銨，以苯扎氯銨（別名潔爾滅，十二烷基二甲基芐基氯化銨）為代表。雙長鏈季銨鹽有雙烷基雙甲基鹵化銨和雙長鏈雙季銨鹽類化合物，以雙癸基二甲基氯化銨為代表。由于單一的季銨鹽殺菌劑在某些使用環(huán)境下殺菌效果會受到限制，且長期單獨使用會產(chǎn)生耐藥性，研究人員發(fā)現(xiàn)復(fù)配型的季銨鹽協(xié)同作用會具有更優(yōu)異的廣譜殺菌效果和許多別的優(yōu)點，如延長殺菌周期、擴大抗菌譜和抗菌范圍、降低使用濃度、防止細菌產(chǎn)生抗藥性等[3]。

3 配方開發(fā)

由于單一品種的季銨鹽消毒劑殺菌譜狹小，消毒應(yīng)用范圍有限，所以市面上大多產(chǎn)品采用復(fù)配技術(shù)。通過研究不同種類的季銨鹽獨特的殺菌作用機制，在配方中添加多種季銨鹽進行復(fù)配，因協(xié)同作用得到放大、應(yīng)用范圍更廣，可以廣泛對抗致病性細菌、真菌、病毒等微生物。常用的單鏈季銨鹽包括十二烷基三甲基氯化銨、十二烷基二甲基芐基溴化銨、十二烷基二甲基苯氧基溴化銨、十四烷基二甲基吡啶溴化銨，雙鏈季銨鹽包括雙癸基甲基羥乙基氯化銨、雙癸基二甲基氯化銨、雙辛基癸基二甲基氯化銨。本產(chǎn)品采用比較有代表性的單長鏈季銨鹽和雙長鏈季銨鹽進行配比，找到最優(yōu)配方?？偧句@鹽含量控制在3～5 g/L。

冷鏈食品外包裝流體環(huán)節(jié)較為復(fù)雜，容易攜帶病毒和有害微生物，在人們處理和搬運時容易接觸造成交叉感染。一些常用的消毒劑在低溫條件下會失效，溫度低了以后，消毒劑的消毒能力顯著下降，特別是如果消毒液結(jié)冰，肯定就沒有效果了，哪怕不結(jié)冰，它的消毒效果也會下降很多倍。為了讓消毒液在-18℃條件下保持液體狀態(tài)、無析出、無結(jié)晶、性狀與常溫一致，還需加入抗凍劑，選用丙二醇、乙醇、異丙醇和甘油中的一種或幾種作為抗凍劑。

4 低溫實驗室殺菌試驗

《低溫消毒劑衛(wèi)生安全評價技術(shù)要求》（國衛(wèi)辦監(jiān)督函〔2020〕1062號）于2020年12月31日發(fā)布，文件中規(guī)定用于低溫冷凍物品表面消毒的低溫消毒劑，需要在低溫條件下進行實驗室微生物殺滅試驗和模擬現(xiàn)場試驗，代表菌株為大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌。

4.1 染菌載體制備

指標菌分別為大腸埃希菌（8099）和金黃色葡萄球菌（ATCC6538），購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，試驗用培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）。實驗室殺滅試驗采用脫脂無菌白平紋棉布片（1.0 cm×1.0 cm）為載體。

使用TSB配制染菌用菌懸液，微量移液器吸取菌懸液10 μL，滴染于載體，涂抹均勻，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min干燥制成染菌載體（下稱菌片）。把干燥后菌片在-18℃恒溫條件下，放置30 min，備用。

4.2 中和劑鑒定試驗

試驗分組：第1組為消毒劑+菌懸液進行培養(yǎng)，觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制能力。第2組為（消毒劑+菌懸液）+中和劑進行培養(yǎng)，觀察殘留消毒劑被中和后，受到清毒劑作用后的試驗菌是否能恢復(fù)生長。第3組為中和劑+菌懸液進行培養(yǎng)，觀察中和劑是否抑菌。第4組為（消毒劑+中和劑）+菌懸液進行培養(yǎng)，觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。第5組為稀釋液+菌懸液進行培養(yǎng)，作為菌數(shù)對照。第6組為稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，作為陰性對照。

中和劑選用D/E中和肉湯，以金黃色葡萄球菌為試驗菌進行3次重復(fù)試驗。在-18℃恒溫條件下，-18℃過夜（＞8 h）保存的低溫型季銨鹽消毒液的中和劑鑒定結(jié)果為：第1組生長平均菌落數(shù)為0 cfu/片，第2組生長平均菌落數(shù)為122 cfu/片，第3組、第4組和第5組生長平均菌落數(shù)分別為2.68×106cfu/片、2.65×106cfu/片和2.87×106cfu/片，三組間誤差率3.81%，第6組為陰性對照（表1）。

表1 中和劑鑒定試驗結(jié)果

4.3 載體定量殺菌試驗

依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）第2.1.1.7.5（1）項。試驗用-18℃過夜（＞8 h）保存的低溫型季銨鹽消毒液，在-18℃恒溫條件下，作用時間為5.0 min、10.0 min和15.0 min，重復(fù)3次試驗。

4.4 試驗結(jié)果

結(jié)果表明，用D/E中和肉湯作為中和劑，可有效中和消毒液原液對試驗菌的殘留作用，且中和劑、中和產(chǎn)物對試驗菌生長無明顯影響，表明所選擇的中和劑及其濃度適宜。

在-18℃恒溫條件下，應(yīng)用-18℃過夜（＞8h）保存的低溫型季銨鹽消毒液，作用5.0 min、10.0 min和15.0 min，對布片載體上金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的殺滅對數(shù)值均＞3.00，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）消毒合格和《低溫消毒劑衛(wèi)生安全評價技術(shù)要求》微生物殺滅試驗的規(guī)定。

5 模擬現(xiàn)場試驗

依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）第2.1.2.9項。取10片菌片，放入環(huán)境溫度：-18.0℃、相對濕度45%的冷庫環(huán)境中，置于最難消毒的位置，保持30 min。用裝有-18℃過夜（＞8h）保存的低溫型季銨鹽消毒液的噴灑裝置，進行噴灑消毒，作用10.0 min，將菌片取出，放入含有5 ml中和劑溶液的試管內(nèi)，作為試驗組。將同批次的中和劑、稀釋液接種培養(yǎng)基，作為陰性對照組。取-18℃冷庫環(huán)境中同條件下放置的2片菌片，放入稀釋液中做適當稀釋，作為陽性對照組。分別取試驗組、陽性對照組和陰性對照組樣本各1.0 ml接種平皿，一式兩份，傾注胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，計數(shù)存活菌落數(shù)，計算殺滅對數(shù)值。

結(jié)果表明，對最難消毒位置處30個布片載體上金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的平均殺滅對數(shù)值分別為6.39和6.42，大于規(guī)定的3.00，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）消毒合格和《低溫消毒劑衛(wèi)生安全評價技術(shù)要求》現(xiàn)場試驗的規(guī)定。

6 理化試驗

消毒液在使用時存在接觸人體皮膚及黏膜的風險，對季銨鹽在配方中的濃度均有限量要求，準確分析其含量，能夠指導(dǎo)合理使用，既保證使用效果又減少對環(huán)境的危害，同時還能為產(chǎn)品質(zhì)量控制以及監(jiān)督檢測提供參考。季銨鹽活性物含量依照GB/T 26369—2020《季銨鹽類消毒劑衛(wèi)生要求》附錄A.4四苯硼鈉滴定法進行測定，重復(fù)測定3次。將低溫型季銨鹽消毒液原液密封包裝置于37℃恒溫箱存放90 d后，按同樣方法測季銨鹽含量，下降率為7.4%，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）將產(chǎn)品貯存有效期為2年的要求。

依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）第四章1.6電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定消毒液中鉛、砷、汞的含量，對低溫型季銨鹽消毒液進行重金屬分析檢測，檢測結(jié)果均為未檢出。同時對低溫型季銨鹽消毒液進行金屬腐蝕性測定，用該消毒液浸泡已經(jīng)洗凈、脫脂并干燥的金屬片72 h，結(jié)果得出其對不銹鋼和銅基本無腐蝕，對碳鋼和鋁有輕度腐蝕。所有低溫型季銨鹽消毒液應(yīng)避免長時間接觸碳鋼和鋁制品。

7 毒理試驗

目前國內(nèi)的毒理學試驗以動物活體試驗為主，檢測結(jié)果如下。

（1）急性經(jīng)口毒性試驗：低溫型季銨鹽消毒液對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗LD50＞5000mg/kg體重，毒性分級屬于實際無毒級，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）的要求。

（2）皮膚刺激試驗：一次完整皮膚刺激試驗結(jié)果表明，低溫型季銨鹽消毒液使用原液對家兔最高皮膚刺激指數(shù)均為0，刺激強度屬無刺激性，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）的要求。

（3）小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗：結(jié)果表明，各劑量組與陰性對照組相比，動物骨髓嗜多染紅細胞微核率無顯著性差異（P＞0.05）；環(huán)磷酰胺陽性對照組與陰性對照組相比，有顯著性差異（P＜0.01）。各劑量組動物骨髓PCE/NCE的比值均大于0.1，表明受試樣品對骨髓沒有明顯抑制作用，且樣品各劑量組PCE/NCE的比值與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。在給藥期間，各劑量組動物未見明顯異常表現(xiàn)。低溫型季銨鹽消毒液對小鼠骨髓嗜多染紅細胞無致微核作用，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）的要求。

8 討論

在抗擊此次疫情中為廣大醫(yī)護人員和人民群眾提供洗滌、消毒、殺菌保障的消毒液、殺菌洗衣液、殺菌洗手液等洗滌產(chǎn)品中，季銨鹽類消毒殺菌劑起到了關(guān)鍵的作用。季銨鹽消毒殺菌劑具有高效、低毒、不易受pH變化的影響、持續(xù)時間長的特點，且對黏液層有較強的剝離作用，化學性能穩(wěn)定，分散及緩蝕作用較好，還具有滅藻、絮凝等特點[4]。

本項目研發(fā)的低溫型季銨鹽消毒液主要應(yīng)用范圍包括：用于-18℃冷庫中物體表面的消毒，包括冷凍食品外包裝、墻面地面、工具貨架等表面；也可用于冷鏈食品集裝箱及運輸車輛的消毒。該消毒液為外用消毒液，不得口服；不得用于餐具消毒，避免與食品接觸。因為季銨鹽為陽離子表面活性劑，其不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與過氧化物、碘或高錳酸鉀同用，以免影響消毒效果。食品行業(yè)消毒對消毒劑的要求比較其他領(lǐng)域要高，不僅要求毒性低，還要求對環(huán)境比較友好。開發(fā)的低溫型季銨鹽消毒液正是本著這個思路設(shè)計和所進行的試驗。實驗結(jié)果證明，該消毒液在較低濃度條件下可快速殺滅細菌，屬實際無毒級，對完整皮膚無刺激性，完全符合對冷鏈食品外包裝的消毒要求。