劉 齊，楊世興，張 文，齊敦武，付為國

（1.江蘇大學農(nóng)業(yè)工程研究院，鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學醫(yī)學院，鎮(zhèn)江 212013；3.成都大熊貓繁育研究基地四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都 610081）

林麝（Moschus berezovskii），偶蹄目（Artiodactyla）麝科（Moschidae）麝屬（Moschus）動物，俗名獐子，香獐，是國家一級保護動物，雄麝可分泌麝香，具有極高的經(jīng)濟價值[1]。目前林麝患病死亡率極高[2]，已有對一些已知疾病的診斷及預防研究[3]，但缺少對未知病因的研究。

病毒宏基因組學（ viral metagenomics）是宏基因組學的一個分支學科，逐漸應用于醫(yī)學、環(huán)境以及生物檢測方面[4]。病毒宏基因組學技術突破了傳統(tǒng)檢測技術的局限，不僅能研究特定環(huán)境范圍內的病毒群落組成，還能深度挖掘新型病毒[5-7]。然而，目前以病毒角度研究林麝的報道幾乎沒有。本文運用病毒宏基因組學方法結合二代測序技術和生物信息學技術，充分利用采集的糞便樣本，有效檢測出林麝糞便內的新型環(huán)狀病毒，并對新型環(huán)狀病毒的特點進行初步分析。

環(huán)狀病毒（Circovirus）是環(huán)形單鏈DNA（single-stranded DNA,ssDNA）病毒，屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae），主要編碼的蛋白有Rep（Replication）蛋白和Cap（Capsid）蛋白[8-10]。目前已經(jīng)從人和脊椎動物以及無脊椎動物體內檢測到環(huán)狀病毒[11-15]。

1 材料和方法

1.1 林麝糞便樣品的采集 由工作人員使用一次性用具采集林麝糞便樣本，避免交叉污染，使用干冰低溫運輸至實驗室，用1.5 mL或2 mL RNase-free離心管從每份糞便樣本中取部分，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑 RNA消化酶及DNA消化酶、文庫RNA逆轉錄試劑盒購自Life Technologie公司；濾菌器0.45 μm cutoff（100×）購自Millipore公司；文庫核酸提取試劑盒、文庫產(chǎn)物純化試劑盒購自QIAGEN公司； Klenow大片段DNA聚合酶購自紐英倫生物技術（北京）有限公司公司；文庫接頭試劑盒購自Illumina公司；文庫篩選購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法 運用病毒宏基因組學的方法構建9個林麝糞便病毒核酸DNA文庫，其中5個文庫含11份樣品，另外4個文庫含10份樣品。參考文獻[16-17]分析病毒宏基因組學DNA文庫構建及病毒宏基因組學生物信息學，從而獲得環(huán)狀病毒的全基因組。其具體步驟如下：

1.3.1 樣品前處理 加DPBS（dulbecco phophate buffered saline）緩沖液于95份林麝糞便樣本中，充分混勻后離心13 000 ×g離心5 min，取上清液，混合獲得9個林麝糞便樣品池。利用0.45 μm微孔濾膜過濾去除真核及原核細胞后用DNA及RNA消化酶除去樣本中無病毒衣殼保護的游離核酸。

1.3.2 文庫構建 樣品酶消化處理完成后，樣品中來自非病毒核酸的比例大大減小，病毒核酸所占的比例得到相應提高，隨后依據(jù)QIAamp MinElute Virus Spin Kit試劑盒抽提病毒核酸。使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，逆轉錄完成后，使用Klenow酶進行反應合成雙鏈DNA。得到的產(chǎn)物用于構建文庫，采用Illumina公司生產(chǎn)的試劑盒（Viral metagenomics）構建病毒宏基因組學高通量測序文庫。

1.3.3 文庫的純化 由于測序平臺對文庫DNA的測序要求是DNA長度介于300～800 bp，所以本研究采用Ampure Beads對文庫病毒DNA序列進行篩選以及優(yōu)化。用產(chǎn)物純化試劑盒除去文庫中的引物二聚體。

1.3.4 生物信息學分析 在Illumina公司測序完畢后，運用病毒宏基因組學實驗分析平臺對測序所得的原始數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，主要過程為：去除序列里的真核及原核基因組序列，之后，去除序列末端的低質量的序列部分，再去除在建庫過程中加入的接頭引物序列，最后，將純凈的序列組裝拼接形成重疊群，然后blastp搜索，從本地病毒蛋白數(shù)據(jù)庫和本地非病毒蛋白數(shù)據(jù)庫中進行檢索，信息以病毒組病毒的網(wǎng)頁形式輸出，包括病毒群落組成、每段序列所屬病毒分類以及與已知病毒相似度以及病毒基因組的覆蓋率。最終病毒基因文庫信息結果以友好的網(wǎng)頁形式界面呈現(xiàn)出來。

1.3.5 病毒全基因組獲得 使用Geneious 2019.0.3分析得到新型環(huán)狀病毒的全基因組序列。用Geneious 2019.0.3和NCBI BLAST分析新型環(huán)狀病毒的全基因組結構。NCBI blastp找出與該新型環(huán)狀病毒相近的環(huán)狀病毒，進行同源性比對。

1.3.6 病毒流行病學調查 使用Geneious 2019.0.3設計巢式P C R引物，F(xiàn) 1（外套上游）：5′-TGGATTTCCCAGTGCCACTC-3′；R1（外套下游）：5′-TGGCATATCGTTAAGTGGGGT-3′；F2（內套上游）：5′-GTACTAGTCTCTGAAAGTT GCTCA-3′；R2（內套下游）：5′-GGTCGCATGTA AAGACACTGC-3′。外套PCR條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共31個循環(huán)；72℃延伸5 min。內套PCR條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共31個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳目的片段位置為315 bp。

1.3.7 系統(tǒng)發(fā)育分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索出99個與該新型環(huán)狀病毒相關病毒毒株的ORF1編碼的氨基酸序列。使用Mega 7.0進行序列多重比對以及最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 病毒宏基因組學生物信息分析結果 采用病毒宏基因組學的方法，構建林麝糞便樣本文庫，分析第9個文庫的結果。發(fā)現(xiàn)一個新型類似環(huán)狀病毒的序列片段，長為4557 bp，使用Geneious Map to Reference功能拼接獲得該病毒環(huán)形基因組序列，病毒全長3552 bp，命名為ls-cyc。將其基因組序列提交至GenBank，獲得GenBank登錄號：MK886724。

2.2 新型林麝環(huán)狀病毒全基因組結構及分析 序列分析顯示，該圓環(huán)病毒樣（Circovirus-like）病毒ls-cyc全基因組序列GC含量39.00%，包含兩個ORF（如圖1A所示）。ORF2是最大的開放閱讀框，長1953 nt（1572-3172 nt），編碼大小為651的衣殼蛋白。ORF1大小為1386 nt（1794～3179 nt）編碼一個462 aa的Rep蛋白，該蛋白質與GenBank中其他環(huán)狀病毒Rep蛋白的氨基酸同源性為32.00%～39.00%。ORF1與ORF2間約 221 nt 的片段中含有一個20 nt的頸環(huán)結構（TTGGCTCCCTTAGTATTAAT）（見圖1B）。

圖1 新型林麝環(huán)狀病毒全基因組結構圖Fig.1 Genomic organization of the novel cyclovirus

2.3 新型林麝環(huán)狀病毒的系統(tǒng)進化分析 基于Rep蛋白質序列的系統(tǒng)進化樹表明，ls-cyc株與來自豬的圓環(huán)狀病毒（GenBank登錄號：MH170058.1）和鴨相關環(huán)狀病毒（GenBank登錄號：NC_030134.1）聚類（如圖2所示）。序列相似度分析表明ls-cyc株的Rep蛋白序列與（GenBank登錄號：MH170058.1）的Rep蛋白序列相似度最高為34.31%。

圖2 新型林麝環(huán)狀病毒Rep蛋白編碼產(chǎn)物氨基酸系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of replication protein

2.4 新型林麝環(huán)狀病毒流行病學分析 用基于Rep蛋白基因序列設計的巢式PCR引物，對95份林麝糞便樣品進行篩選，凝膠電泳結果顯示共15份林麝糞便樣本呈該環(huán)狀病毒陽性，其陽性率為15.79%。

3 討論

圓環(huán)病毒（Circovirrus）屬于人畜共患病毒，亦可通過昆蟲傳播感染，主要宿主動物是綿羊、牛、山羊和小型反芻動物[11,18-20]。本研究第一次從林麝糞便中檢測到一種新型環(huán)狀病毒，命名為ls-cyc（GenBank登錄號：MK886724），并且獲得了該病毒的全基因組序列。研究表明，該病毒基因組為環(huán)形，全長為3552 nt，包含兩個ORF。其中，ORF1大小為1386 nt（1794～3179 nt），編碼一個462 aa的復制相關蛋白。ORF2是最大的開放閱讀框，長1953 nt（1572～3172 nt），編碼大小為651 aa的蛋白?；贠RF1進行blastp比對，與豬血清相關環(huán)狀病毒（Porcine serum-associated circular virus，GenBank登錄號：MH170058.1）的ORF1的序列相似度最高為34.31%。ORF2則未找到同源性蛋白，推測由于該病毒變異性較高。環(huán)狀系統(tǒng)進化樹分析得ls-cyc右與Cyclovirus聚為一個大的分支，左與Circularvirus、Geminivirus、Genomoviridae聚為一個大分支，其中與來自豬的圓環(huán)狀病毒（GenBank登錄號：MH170058.1）和鴨相關環(huán)狀病毒（GenBank登錄號：NC_030134.1）為聚類最近，推測這一聚類結果與該病毒的結構相關。為研究該病毒在林麝的流行狀況，篩選PCR結果顯示95份林麝糞便樣品中僅有15份呈陽性，說明該病毒在林麝之間并未廣泛傳播。

本研究首次從林麝體內發(fā)現(xiàn)了1株新型環(huán)狀病毒并分析其基因組序列，對林麝的病毒研究及環(huán)狀病毒的遺傳多樣性、宿主適應性及致病性等方面具有重要意義。同時，新型環(huán)狀病毒的發(fā)現(xiàn)為未來潛在的致病性病毒的監(jiān)測及預警等奠定了重要基礎。