王 萌，范文輝，李 翠，趙啟祖，劉文軍，李 晶

（1.中國科學院微生物研究所 病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

干擾素（interferon,IFN）是1957年由Isasc和Linderman發(fā)現(xiàn)并于1978年純化出來的一類抗病毒細胞因子[1]。當禽類受到病毒刺激時，禽干擾素由體細胞、巨噬細胞、淋巴細胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學功能。黏膜是外界與機體內(nèi)環(huán)境的分界屏障，多數(shù)病原微生物通過黏膜進入宿主。當病原體侵染黏膜細胞時，細胞上模式識別受體（pattern recognition receptors,PRRs）識別病原，誘導干擾素的產(chǎn)生。干擾素介導干擾素刺激基因（interferon stimulated gene,ISGs）的活化、調(diào)控一系列細胞因子的表達并且誘導接收干擾素信號的細胞呈抗病毒狀態(tài)，形成一個有效的天然防御機制[2]。越來越多的研究證明，禽干擾素對由病毒引起的流行性疾病有良好的抑制作用，但由于研究數(shù)據(jù)不充足等原因并沒有廣泛的應(yīng)用于市場。

禽類傳染病每年給我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，目前禽類傳染病預防疫苗種類繁多，但是并不能高效的預防禽類傳染病的暴發(fā)，因此，亟需研發(fā)高效且安全的預防禽類傳染病的免疫用藥。相對于傳統(tǒng)免疫方式，黏膜免疫由于其經(jīng)濟性及便于操作性越來越受到人們的重視，黏膜抗原的接種不僅可以增強局部免疫還可以增強系統(tǒng)免疫[3]。有研究表明，用滅活毒疫苗通過鼻內(nèi)途徑給藥，其免疫原性較差[4]，需要結(jié)合佐劑來增強疫苗的免疫原性，因此開發(fā)有效且經(jīng)濟的黏膜免疫佐劑也是禽類市場迫切需要的。

1 禽干擾素的產(chǎn)生及分類

根據(jù)基因、結(jié)構(gòu)、功能特點及同源受體的不同，IFN分為三個型，分別為IFN Ⅰ型、IFN Ⅱ型、IFN Ⅲ型[5-6]。當病原體入侵機體黏膜細胞時，細胞的PRRs對病原核酸進行識別，活化下游信號通路，誘導IFN的產(chǎn)生。

1.1 禽干擾素的產(chǎn)生 幾乎所有類型的細胞都能產(chǎn)生IFN，但有一種細胞可以產(chǎn)生大量的特異性IFN，并且是自然殺傷細胞（nature killer cell,NK）介導的清除感染細胞過程所必需，該細胞被命名為天然分泌干擾素細胞，目前常被稱為漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid DCs,pDC）?；罨蓴_素信號通路主要是依賴于PRRs，其中有三種核酸受體，第一種PRRs是維甲酸誘導基因樣解旋酶家族（retinoic acid-inducible gene Ι-like helicase,RLH），包括視黃酸誘導基因蛋白Ⅰ（retinoic acid-inducible gene Ⅰ,RIG-Ⅰ）、腫瘤分化相關(guān)基因（melanoma differentiation associated gene 5,MDA5）等；第二種PRRs是toll樣受體（toll-like receptors,TLR）家族，包括TLR3、TLR7、TLR9，可識別胞外、吞噬體及內(nèi)涵體中的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMP）；第三種是DNA感應(yīng)器[7]。

禽干擾素（chicken interferon,ChIFN）的信號通路與哺乳動物IFN的信號通路相似，但是一些關(guān)鍵的信號元件在進化上仍有較大的差異，許多關(guān)鍵的免疫基因在雞的細胞中缺失，如RIG-I、TLR8、TLR9、干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon-regulated factor,IRF3）等[8-9]。這些關(guān)鍵基因的缺失，預示著禽類有其他基因或成分來代替這些缺失基因的功能。RLH是一種胞漿PRRs可以識別病毒RNA，從而激活天然免疫反應(yīng)。在哺乳動物中RLH和MDA5/RIG-Ⅰ可以通過MAVS激活I(lǐng)RF3與NF-κB從而誘導干擾素與炎癥因子的表達。雞中缺少RIG-I，禽MDA5可以通過構(gòu)建MDA5-干擾素基因刺激物（stimulator of interferon genes,STING）-IFN β信號通路填補RIG-I的缺失[10]。雞中缺少IRF3，而雞的IRF7與IRF3最為接近，即MDA5感應(yīng)胞內(nèi)病毒基因信號從而活化MAVs，MAVs活化STING，STING活化IRF7與NF-κB，這兩個轉(zhuǎn)錄因子入核，誘導IFN的產(chǎn)生。

總之，ChIFN產(chǎn)生的信號通路與哺乳動物相似但仍存在差異，ChIFN產(chǎn)生相關(guān)的信號通路仍有很多研究留白，需要進一步研究探索。

1.2 禽干擾素的分類 與哺乳動物相似，ChIFN亦分為三種類型。三種ChIFN在進化上相差較大，彼此之間缺少序列同源性。與ChIFN Ⅱ相比，盡管ChIFN Ⅰ與ChIFN Ⅲ存在信號與功能上的同源性，但是ChIFN Ⅰ與ChIFN Ⅱ之間關(guān)系更為密切。

研究表明ChIFN與哺乳動物IFN在結(jié)構(gòu)、功能以及進化上都有一定的相關(guān)性，提示ChIFN與哺乳動物IFN可能有共同的祖先，但是兩者存在較大的差異。在人類中至少有13種編碼功能性蛋白的IFNα基因和單一的IFN β、IFN ω、IFN κ、IFN ε基因，而ChIFN Ⅰ位于性染色體上并且雞中只有12種編碼IFN α基因和單一的IFN β、IFN κ基因[11]。

ChIFN γ由169個氨基酸組成，包括19個氨基酸信號區(qū)段，分泌蛋白有145個氨基酸，約為16.9 Da[12]。ChIFN γ存在于一號染色體上，與哺乳動物IFN γ同源性達30%以上，ChIFN γ的功能結(jié)構(gòu)域與哺乳動物IFN的同源性達50%以上，說明IFN γ的功能域相對保守。

目前對ChIFN的研究，主要針對雞和鴨兩個物種。 ChIFN λ與鴨IFN λ分別于2008年與2014年被科學家發(fā)現(xiàn)并報道[13]?，F(xiàn)已在人類基因組上發(fā)現(xiàn)至少四種IFN λ，但是在雞上只有一種功能保守的ChIFN λ，其與哺乳動物IFN λ2序列相似性較高[14-15]。

2 禽干擾素的功能

細胞因子受體家族由12種不同的受體組成，這些受體由IFN介導發(fā)揮生物學功能。IFN被認為是免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)介質(zhì)，ChIFN與其特異性受體結(jié)合觸發(fā)下游信號通路從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學作用。ChIFNⅠ與ChIFNⅢ有相似的信號通路，通過Janus激酶1（Janus kinase,JAK1）與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸激酶2（tyrosine kinase 2,Tyk2）磷酸化激活Janus激酶信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase-single transducer and activator of transcription,JAK-STAT）通路，招募并磷酸化STAT1與STAT2，從而形成STAT1/STAT2二聚體，該二聚體從受體上脫落并與IRF9結(jié)合形成干擾素刺激基因因子3（interferonstimulated gene factor 3,ISGF3）復合體，入核并與干擾素刺激應(yīng)答元件（interferon-stimulated response elements,ISREs）結(jié)合從而活化一系列干擾素刺激基因（interferon stimulated gene,ISGs）表達。ChIFN Ⅱ主要通過JAK1與JAK2激酶，招募并磷酸化STAT1，使其形成同源二聚體，從而激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

2.1 禽Ⅰ型干擾素作用 IFNⅠ的受體為IFNAR1與IFNAR2組成的異二聚體，其受體在機體內(nèi)普遍表達。ChIFN α與ChIFN β有相同的受體，并且都依賴ISGs來發(fā)揮抗病毒作用，但是ChIFN α的抗病毒作用較ChIFN β強并且ChIFN α可以激活T細胞依賴的淋巴系統(tǒng)[16-17]。其中一些ISGs在哺乳動物中研究較多，Mx是一種GTPase，哺乳動物有兩種Mx蛋白，分別是Mx A與Mx B，兩者都有抗病毒的活性。不同于哺乳動物，雞只有一種Mx蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其抗病毒活性與631位的氨基酸有關(guān)[18]。PKR其以非活性形式存在細胞內(nèi)，是檢測非胞內(nèi)雙鏈RNA的感應(yīng)器。2′-5′-OAS是一種干擾素誘導酶，被雙鏈RNA激活，利用ATP合成2′-5′-寡聚腺苷酸，可以導致病毒RNA轉(zhuǎn)錄本的斷裂，從而抑制病毒的表達。在雞中有兩種編碼OAS的等位基因，分別為OAS-A、OAS-B，其中OAS-A表達頻率較OAS-B高，并且OAS-A合成 2′-5′-寡聚腺苷酸的活性較OAS-B高[19]。

表1 禽干擾素的產(chǎn)生細胞及免疫功能Table 1 Original cells and immune function of avian interferon

圖1 禽干擾素作用機制的細胞模式圖Fig.1 Cellular model of Avian inte rferon function

IFNⅠ可以促進DC的成熟及CD4+細胞分化為Th1與Th2細胞。研究表明經(jīng)IFNⅠ處理的抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells,APC）可以交叉反應(yīng)并且刺激天然CD8+細胞，導致T細胞克隆性擴增。IFN可以促進DC表達趨化因子，從而募集NK細胞、T細胞和B細胞到感染區(qū)，并且可以誘導IL15的表達，IL15對CD8+記憶細胞及NK細胞的維持十分重要[20]。IFNⅠ在天然免疫的抗病毒防御中發(fā)揮重要的作用，并且在黏膜免疫中通過調(diào)節(jié)細胞因子的表達，促進適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化。IFNⅠ與DC互作，使其成為連接天然免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁。

2.2 禽二型干擾素作用 IFN Ⅱ的受體為IFNG1與IFNG2形成的異二聚體，ChIFN γ與哺乳動物IFN γ有相似的作用。在鳥類中，IFN γ是巨噬細胞主要的調(diào)控器[21]。ChIFN γ可以抑制病毒的復制[22]，通過抑制Th2細胞因子（IL4、IL10）的產(chǎn)生，促進Th1的應(yīng)答[23]。ChIFN γ可以誘導主要組織復合物Ⅰ（major histocompatibility complex Ⅰ,MHC-Ⅰ）和主要組織復合物Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ,MHC-Ⅱ）的表達，它增強了加工呈遞抗原作用以及對細胞內(nèi)病原體的破壞作用[24]。ChIFN γ可以上調(diào)許多基因的表達，其中包括誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）。iNOS經(jīng)過免疫刺激后在巨噬細胞中被激活，產(chǎn)生大量的一氧化氮，這是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)之一[25-26]。IFN γ可以增加巨噬細胞抗原呈遞作用以及MHC-Ⅰ的表達，促進NK細胞的活化和遷移所需的白細胞的粘附與結(jié)合作用[27]。因此ChIFN γ在機體中主要起免疫調(diào)節(jié)作用。

2.3 禽三型干擾素作用 IFN Ⅲ的受體為IFN λR1與IL R2形成的異二聚體，ChIFN Ⅲ的受體IFN λR1主要表達于富含上皮細胞的組織中，如表皮、肺、胃腸道上皮細胞等，因此與IFNⅠ相比，IFNⅢ的功能范圍更有局限性[28]。ChIFN λ與哺乳動物IFN λ在功能上是較為保守的，在表皮屏障抗病毒防御上起主導作用。ChIFN λ與ChIFN γ不同，其在非表皮細胞中誘導出較低水平的CO。

IFN λ可以通過上調(diào)細胞表面的MHC-Ⅰ類分子的表達水平，促進免疫系統(tǒng)對病毒感染的識別和破壞，并通過誘導病毒感染細胞的凋亡來抑制病毒的持續(xù)感染。有研究顯示IFN Ⅲ在呼吸道中主要參與保護機體免受病毒的入侵，并且在局部抗病毒天然免疫中發(fā)揮作用[29-30]。與哺乳動物相似，ChIFN λ發(fā)揮抗病毒作用并且主要在上皮組織中發(fā)揮作用。有研究表明，ChIFN λ可以在原代的胚胎氣管，以及雞肺細胞系上抑制流感病毒的復制[31]。早期數(shù)據(jù)顯示，雖然IFN λ激活的信號通路與IFN α相似，但是他們的瞬時激活與誘導的抗病毒反應(yīng)是有差異的[32]。有報道稱，在人源細胞上IFN可以持續(xù)激活STAT1與STAT2，從而持續(xù)增加ISGs的表達，與人IFN相似，ChIFN加對信號轉(zhuǎn)導因子的活化時間也較ChIFN Ⅰ長，提示ChIFN N抗病毒作用可能較ChIFN能更為長效[33]。

ChIFN Ⅲ在上皮組織上發(fā)揮著抗病毒作用，因此ChIFN Ⅲ可能對抵御病毒入侵呼吸道、消化道等組織有一定的作用，并且與黏膜免疫關(guān)系更加密切。

3 禽干擾素的應(yīng)用

3.1 禽Ⅰ型干擾素的應(yīng)用 IFN α是連接天然免疫與適應(yīng)性免疫的重要細胞因子，在臨床上已應(yīng)用較長時間，是一種有效的抗病毒與抗腫瘤的免疫佐劑，現(xiàn)在應(yīng)用于腫瘤患者與抗感染病藥物中。ChIFNⅠ家族中ChIFN α與ChIFN β均有一定的抗病毒作用，我們前期研究了細胞水平上兩者抗病毒作用的差異，發(fā)現(xiàn)ChIFN α可以更好地促進與抗病毒相關(guān)的ISG表達。同時，在不同細胞系上針對不同的病毒進行抗病毒試驗，試驗結(jié)果均顯示ChIFN α抗病毒活性較ChIFN β高[34]。隨后，我們也發(fā)現(xiàn)短期重復口服ChIFN α可以上調(diào)免疫器官中的炎性因子表達，并且在攻毒試驗中顯示ChIFN α作為黏膜免疫佐劑可降低實驗動物咽喉部的病毒載量，說明短期重復口服ChIFN α可以抑制低致病性流感病毒的復制[35]。另外，研究表明口服ChIFN α在7日齡與33日齡的SPF雞體內(nèi)均表現(xiàn)出顯著的抗病毒效果，在7日齡SPF雞試驗組中對于H9N2亞型流感病毒的治療效果好于防御效果，而33日齡SPF雞則相反[36]。這些研究成果均為ChIFN α作為黏膜免疫佐劑防御流感病毒提供了理論依據(jù)。

在給藥途徑的研究中發(fā)現(xiàn)，ChIFN Ⅰ受體存在于消化器官上并且口服ChIFN后，消化器官中IFNR1基因表達量明顯增加[37]。通過飲水的給藥方式將ChIFN給予自然感染禽流感病毒的禽類，會降低流感病毒刺激適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抗原閾值，以激活對低致病性禽流感病毒的適應(yīng)性免疫[38]，結(jié)果顯示口服ChIFN是可行的免疫途徑。

3.2 禽二型干擾素的應(yīng)用 有研究證明IFN γ作為佐劑可以提高疫苗的效價。在給予雞與火雞ChIFN γ與重組雞痘病毒后，抗體與細胞內(nèi)的反應(yīng)及對新城疫病毒攻擊的保護作用均有所增加[39-40]。雞球蟲病是由艾美爾球蟲寄生于腸上皮細胞引起的疾病，有研究表明，重組ChIFN γ的DNA疫苗較單獨表達艾美爾球蟲蛋白cSZ抗體的DNA疫苗對雞球蟲病有更好的保護作用[41]。

另外，ChIFN α在臨床上已有初步的探索，ChIFN γ作為DNA疫苗的免疫佐劑有良好的應(yīng)用前景，但是仍需研究數(shù)據(jù)的支持。ChIFN λ作為新型ChIFN，目前還沒有應(yīng)用于市場，但就其生物功能的多樣性、受體表達的特異性、與黏膜免疫關(guān)系的密切性，ChIFN λ作為黏膜免疫佐劑有十分良好的應(yīng)用前景，因此對其進行動物試驗的深入研究及臨床研究是十分必要的。

4 展望

目前禽類傳染病的防治仍以疫苗為主，主要以白油為佐劑，通過注射的方式進行免疫。使用疫苗的同時，也隨同使用抗生素。抗生素的濫用對動物自身及環(huán)境造成一定的破壞，疫苗中白油的使用影響了禽類肉質(zhì)的質(zhì)量，傳統(tǒng)的注射免疫不僅對動物自身造成應(yīng)激還帶來了傳播傳染病的風險。

黏膜免疫主要是通過滴鼻、飲水等方式進行給藥。在集約化養(yǎng)殖中，黏膜免疫可以減少注射免疫帶來的副作用，并且黏膜免疫操作方便、經(jīng)濟、節(jié)約人力、可控性強，這些優(yōu)勢使得黏膜免疫有望成為新興的免疫方式，廣泛應(yīng)用于市場。但是黏膜環(huán)境復雜，消化道存在許多會降解抗原的酶，呼吸道的上皮粘液與鼻腔纖毛的擺動也會影響?zhàn)つっ庖咭呙缰锌乖幕钚?，因此黏膜免疫疫苗需要合適的佐劑來抵抗這些因素。

目前黏膜免疫佐劑有減毒的細菌毒素、CpG等，細菌毒素由于其毒性過大限制了其作為黏膜免疫的佐劑應(yīng)用于市場；CpG作為免疫佐劑雖然有誘導前炎性因子、趨化因子的表達及促進細胞毒性T細胞活化等[42]優(yōu)點，但是由于其成本較高，并不適于市場應(yīng)用。ChIFN可以產(chǎn)生抗病毒基因，并且通過調(diào)節(jié)細胞因子的表達對黏膜免疫起一定的調(diào)控作用，同時ChIFN是機體的天然生物分子，因此不會產(chǎn)生排異等副作用及藥物殘留等問題，ChIFN可作為黏膜免疫佐劑的優(yōu)良候選物。

我們前期對不同型的ChIFN進行克隆、表達、純化后，將ChIFN與滅活的禽流感病毒聯(lián)用，通過飲水的方式免疫7日齡的SPF雞，通過檢測免疫相關(guān)細胞因子的表達水平、抗體的產(chǎn)生情況及攻毒后動物的排毒率來探究ChIFN與滅活的流感病毒聯(lián)用對雞黏膜免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及抗病毒作用。研究顯示ChIFN α與ChIFN λ對禽流感病毒有一定防治作用。那么，深入分析多種ChIFN聯(lián)用對黏膜免疫的刺激作用及細胞因子特征是我們?nèi)蘸蟮难芯恐攸c，并利用這些多效性細胞因子通過黏膜免疫方式來預防病毒性感染及炎性疾病的發(fā)生。通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組的ChIFN可以使其在養(yǎng)殖場得到大規(guī)模的應(yīng)用，然而對于其中一些關(guān)鍵性技術(shù)問題，如提高ChIFN的表達水平、高密度發(fā)酵工藝、干擾素活性的提高以及臨床應(yīng)用方法等諸多環(huán)節(jié)也是我們?nèi)蘸筘酱芯拷鉀Q的關(guān)鍵。