徐明元，徐貴森，楊曉鯤，羅 勇，關(guān)思書(shū)，范云飛

（中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診科，四川 成都 610083）

在全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查中，腰疼高居第6位[1]。該病不僅會(huì)給患者帶來(lái)生理上的痛苦，還常會(huì)導(dǎo)致焦慮、抑郁等精神疾病的發(fā)生[2]。眾多研究結(jié)果表明，腰疼與椎間盤(pán)退行性變性（簡(jiǎn)稱(chēng)退變）密切相關(guān)，主要特征之一是髓核細(xì)胞外基質(zhì)的降解。髓核細(xì)胞外基質(zhì)主要是由Ⅱ型膠原和蛋白聚糖構(gòu)成，使髓核能夠保留水分，緩沖和吸收機(jī)體的負(fù)荷。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）是切割蛋白聚糖和膠原蛋白的主要酶，其成員蛋白在退變的椎間盤(pán)中呈現(xiàn)高表達(dá)，與髓核細(xì)胞外基質(zhì)分解和椎間盤(pán)退變的進(jìn)展密切相關(guān)[3-4]。此外，椎間盤(pán)退變可導(dǎo)致腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和巨噬細(xì)胞抑制因子（macrophage inhibition factor，MIF）等炎癥因子的異常表達(dá)，并刺激髓核等鄰近椎間盤(pán)組織，加重退變的嚴(yán)重程度[5]。本研究擬通過(guò)探討MMP和ADAMTS與椎間盤(pán)退變程度及炎癥因子的相關(guān)性，為臨床防治椎間盤(pán)退變提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年11月—2019年11月中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的椎間盤(pán)退變患者160例。所有患者均符合椎間盤(pán)退變相關(guān)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者術(shù)前均行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查，并依據(jù)檢查結(jié)果進(jìn)行Pfirrmann分級(jí)[6]（級(jí)別越高，椎間盤(pán)退變程度越嚴(yán)重），包括：Ⅰ級(jí)30例，其中男17例、女13例，年齡（59.91±12.24）歲；Ⅱ級(jí)32例，其中男18例、女14例，年齡（61.28±12.71）歲；Ⅲ級(jí)35例，其中男20例、女15例，年齡（59.35±13.14）歲；Ⅳ級(jí)33例，其中男18例、女15例，年齡（60.74±13.21）歲；Ⅴ級(jí)30例，其中男18例、女12例，年齡（61.33±13.57）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合椎間盤(pán)退變相關(guān)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）擬接受相關(guān)手術(shù)治療；（3）患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤者；（2）合并嚴(yán)重心、腦、腎等系統(tǒng)性疾病者；（3）合并血液及免疫系統(tǒng)疾病者；（4）合并感染性疾病者；（5）臨床資料不全者。

1.2 方法

收集所有患者手術(shù)時(shí)的椎間盤(pán)髓核組織約5 g，存入液氮中保存，統(tǒng)一檢測(cè)。取出液氮凍存的組織樣本，加入適量液氮，用研缽磨成細(xì)粉。采用RNeasy微型試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）提取總RNA，采用UV-vis 1200分光光度計(jì)（日本日立公司）測(cè)定總RNA含量。將RNA轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），逆轉(zhuǎn)錄體系：0.5 μg RNA、4 μL dNTP混合液（40 μmol/L）、4 μL 5×RT緩沖液[含50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、75 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2]、2 μL基礎(chǔ)混合液、2 μL二硫蘇糖醇、1 μL HiFiScript逆轉(zhuǎn)錄酶，添加不含RNase的dH2O至20 μL。采用Prism 7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）。擴(kuò)增體系：反應(yīng)總體積為20 μL，包括2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL dH2O和10 μL SYBR。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同Pfirrmann分級(jí)組各項(xiàng)指標(biāo)比較結(jié)果

Ⅳ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、IL-1αmRNA和IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組和Ⅲ級(jí)組（P＜0.05），且Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組依次升高（P＜0.05），Ⅳ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組、Ⅴ級(jí)組ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅰ級(jí)組和Ⅱ級(jí)組（P＜0.05），Ⅱ級(jí)組顯著高于Ⅰ級(jí)組（P＜0.05），Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組MMP-1 mRNA、MMP-13 mRNA、ADAMTS-1 mRNA、IL-6 mRNA和IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同Pfirrmann分級(jí)組各項(xiàng)指標(biāo)比較結(jié)果

2.2 各項(xiàng)指標(biāo)與Pfirrmann 分級(jí)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、ADAMTS-4 mRNA、ADAMTS-5 mRNA、IL-1αmRNA及IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量與Pfirrmann分級(jí)均呈正相關(guān)（rs值分別為0.935、0.921、0.873、0.567、0.412、0.372，P＜0.05）。

2.3 各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、ADAMTS-4 mRNA、ADAMTS-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與IL-1αmRNA、IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性

3 討論

椎間盤(pán)是脊柱椎體之間的功能單位，由層狀纖維環(huán)、軟質(zhì)凝膠狀髓核及軟骨終板3個(gè)部分構(gòu)成，共同作為椎體之間的減震器，完成脊柱的彎曲和扭轉(zhuǎn)[7]。在正常椎間盤(pán)中，髓核細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分解處于平衡狀態(tài)，當(dāng)分解速率超過(guò)合成時(shí)常會(huì)導(dǎo)致椎間盤(pán)的退變。MMP和ADAMTS是髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程中關(guān)鍵的蛋白水解酶，幾乎對(duì)髓核細(xì)胞外基質(zhì)所有成分都有降解作用[8]。其中MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13是參與髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程的主要MMP[9]。MMP-3是降解過(guò)程中的重要前體酶，其對(duì)Ⅱ型膠原的降解活性是MMP-1的5～10倍[10]。MMP-9是一種明膠酶，在膠原酶裂解后進(jìn)一步降解變性膠原或明膠[11]。MMP-1和MMP-13均為膠原酶，主要作用于纖維狀膠原蛋白。有研究結(jié)果顯示，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，MMP-1 mRNA和MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量未升高，提示MMP-1和MMP-13在髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解中的作用不明顯[12]。TAKAHASHI等[13]的研究結(jié)果顯示，椎間盤(pán)中MMP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量可隨著機(jī)械負(fù)荷的加重而明顯升高，其表達(dá)異常導(dǎo)致的椎間盤(pán)退變程度可隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。ZHANG等[12]的研究結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量在椎間盤(pán)退變過(guò)程中明顯上調(diào)，且起著關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果顯示，Pfirrmann分級(jí)Ⅳ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組和Ⅲ級(jí)組（P＜0.05），且Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組依次升高（P＜0.05），而各組間MMP-1 mRNA、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量與Pfirrmann分級(jí)均呈正相關(guān)（rs值分別為0.935、0.921，P＜0.05）。ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5在正常椎間盤(pán)和退變椎間盤(pán)中均有分布，但在退變的椎間盤(pán)中表達(dá)較高[14]。PATEL等[15]采用免疫印跡法檢測(cè)了退變?cè)缙诤屯砥谧甸g盤(pán)中ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示晚期椎間盤(pán)退變組織中ADAMTS-4蛋白的表達(dá)顯著高于早期（P＜0.05）。CHEN等[16]的研究結(jié)果顯示，隨著椎間盤(pán)退變的進(jìn)展，ADAMTS-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅰ級(jí)組和Ⅱ級(jí)組（P＜0.05），且Ⅱ級(jí)組顯著高于Ⅰ級(jí)組（P＜0.05），而Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組間ADAMTS-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，ADAMTS-4 mRNA、ADAMTS-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與Pfirrmann 分級(jí)均呈正相關(guān)（rs值分別為0.873、0.567，P＜0.05）。由此可見(jiàn)，MMP-3、MMP-9、ADAMTS-4和ADAMTS-5可能在髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

此外，椎間盤(pán)退變是TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的潛在來(lái)源[17]，椎間盤(pán)退變引起的炎癥反應(yīng)可促進(jìn)炎癥因子表達(dá)的增加，并刺激髓核等鄰近椎間盤(pán)組織，進(jìn)而加重退變程度。本研究結(jié)果顯示，Ⅳ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組IL-1αmRNA和IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組和Ⅲ級(jí)組（P＜0.05），且Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組依次升高（P＜0.05）；Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，IL-1αmRNA及IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量與Pfirrmann分級(jí)均呈正相關(guān)（rs值分別為0.412、0.372，P＜0.05）。提示炎癥因子在椎間盤(pán)退變過(guò)程中扮演著重要角色。LI等[18]的研究結(jié)果顯示，椎間盤(pán)退變?cè)絿?yán)重，MMP-9 mRNA和IL-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量越高。ZHANG等[12]分析了30例接受腰椎融合手術(shù)的腰痛患者的退變軟骨終板樣本，以10例無(wú)腰痛史且因椎體爆裂性骨折行腰椎手術(shù)的患者為對(duì)照，結(jié)果表明，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)與IL-1αmRNA、IL-1βmRNA呈正相關(guān)（r值分別為0.577、0.407、0.571和0.486，P＜0.05），MMP-3、MMP-9可能受IL-1α、IL-1β的調(diào)節(jié)。WANG等[19]采用TNF-α處理人類(lèi)椎間盤(pán)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA呈高表達(dá)，并通過(guò)核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路促進(jìn)聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的降解。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β可通過(guò)多配體蛋白聚糖4途徑促進(jìn)ADAMTS-5 mRNA表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)聚集蛋白聚糖的降解作用[20]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在經(jīng)IL-1β處理的大鼠NP細(xì)胞中，ADAMTS-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，并通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB通路增強(qiáng)聚集蛋白聚糖的降解[21]。本研究結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與IL-1αmRNA和IL-1βmRNA均呈正相關(guān)（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，IL-1α、IL-1β與MMP-3、MMP-9、ADAMTS-4、ADAMTS-5均有一定的聯(lián)系。

綜上所述，ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9、IL-1α和IL-1β與椎間盤(pán)退變有關(guān)，可反映病情的嚴(yán)重程度。