石鵬輝，范偉光，張 珍，蘇苗苗，孟 娟，路新利

（1.保定市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 071000；2.保定市人民醫(yī)院感染科，河北 保定 071000；3.河北省疾病預(yù)防控制中心艾滋病研究所，河北 石家莊 050021）

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）侵犯人體免疫系統(tǒng)引起的疾病[1]。HIV感染人體后會(huì)大量破壞淋巴細(xì)胞，尤其是CD4+T細(xì)胞。免疫細(xì)胞被大量破壞會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損，增加AIDS患者惡性腫瘤及機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療（antiretroviral therapy，ART）是目前治療AIDS最有效的方法，主要通過刺激免疫系統(tǒng)大量生成CD4+T細(xì)胞來抑制病毒復(fù)制[3]。產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子是HIV-1持續(xù)感染的免疫特征之一[4]。血清趨化因子受體5（C-X-C chemokine receptor 5，CXCR5）是濾泡輔助性T細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志物，其在引導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入B細(xì)胞區(qū)以促進(jìn)B細(xì)胞分化和親和力成熟方面起關(guān)鍵作用，并可能與HIV、乙型肝炎病毒、EB病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒等引起的慢性感染的嚴(yán)重程度有關(guān)[5-6]?？扇苄猿绦蛐约?xì)胞死亡受體-1（soluble programmed cell death receptor-1，sPD-1）與T淋巴細(xì)胞功能衰竭及凋亡密切相關(guān)[7]。雖然ART可以有效抑制HIV復(fù)制，但慢性炎癥和免疫激活持續(xù)存在，增加了心血管疾病等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）屬于含硫基的非必需氨基酸，其可作為預(yù)測心血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[9]。因此，本研究擬通過動(dòng)態(tài)觀察HIV-1感染者ART治療前后血清CXCR5、sPD-1、Hcy水平的變化，探討這些指標(biāo)在HIV-1感染預(yù)后評估中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年6月—2019年12月保定市人民醫(yī)院確診的AIDS患者120例（AIDS組），其中男96例、女24例，年齡（35.8±3.7）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)保定市疾病預(yù)防控制中心采用免疫印跡法確認(rèn)為HIV-1抗體陽性；（2）符合《中國艾滋病診療指南（2018版）》[10]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；（3）患者均接受相同方案的ART；（4）患者對本研究均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡等其他自身免疫系統(tǒng)性疾??；（2）合并結(jié)核、乙型肝炎、丙型肝炎等感染性疾病；（3）合并糖尿病、高血壓、心血管疾病及腦血管疾病。另選取同期保定市人民醫(yī)院體檢健康者45名作為正常對照組，其中男35名、女10名，年齡（34.9±3.5）歲。2個(gè)組之間性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)保定市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 AIDS患者于入院次日采用口服替諾福韋、拉米夫定和依非韋倫的方式進(jìn)行ART。替諾福韋服用劑量為300 mg，1次/d；拉米夫定服用劑量為300 mg，1次/d；依非韋倫服用劑量為600 mg，1次/d。持續(xù)用藥12個(gè)月，嚴(yán)格按照《中國艾滋病診療指南（2018版）》[10]要求定期隨診。動(dòng)態(tài)監(jiān)測患者用藥期間CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)、HIV病毒載量、血清CXCR5、sPD-1、Hcy及血脂的變化。

1.2.2 樣本采集 分別采集AIDS患者不同時(shí)間點(diǎn)（治療前1 d及治療后3、6、12個(gè)月）和正常對照者體檢當(dāng)日清晨的空腹靜脈血，將血液樣本分別置于普通促凝真空采血管和乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTA-K2）抗凝真空采血管中，每管各5 mL。取EDTA-K2抗凝血樣本50 μL，用于CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余樣本離心后分別留取血清或血漿，置于-80 ℃中冷凍儲存，備用。

1.2.3 CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù) 在流式細(xì)胞分析管中加入EDTA-K2抗凝血樣本50 μL，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）及配套Multitest CD4抗體試劑盒測定CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)。嚴(yán)格按儀器和試劑說明書操作。

1.2.4 CXCR5、sPD-1、Hcy及血脂檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定血清CXCR5、sPD-1水平，試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，檢測儀器為iMark酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）。Hcy、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司，檢測儀器為AU680全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.2.5 HIV-1病毒載量檢測 采用cobas TaqMan 48病毒載量檢測系統(tǒng)（瑞士羅氏公司）定量檢測AIDS患者行ART治療前及治療后3、6、12個(gè)月的血漿HIV-1載量。儀器線性范圍為20～107拷貝/mL

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評估各項(xiàng)指標(biāo)與CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)、HIV-1載量的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIDS組治療前與正常對照組各項(xiàng)指標(biāo)比較

AIDS組治療前sPD-1和Hcy水平均顯著高于正常對照組（P＜0.01），CXCR5、CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)均顯著低于正常對照組（P＜0.01）。TG、TC、HDL-C、LDL-C水平2個(gè)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 AIDS組治療前與正常對照組各項(xiàng)指標(biāo)比較

2.2 AIDS患者ART中各項(xiàng)指標(biāo)動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果

與治療前比較，AIDS患者CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)、CXCR5水平均隨ART時(shí)間的延長顯著升高（P＜0.05），在治療6個(gè)月時(shí)達(dá)到峰值；Hcy、TC、TG、LDL-C水平在治療12個(gè)月時(shí)顯著升高（P＜0.05）；HDL-C無變化；HIV-1載量在治療3個(gè)月時(shí)顯著下降（P＜0.05），治療6個(gè)月時(shí)降低更顯著（P＜0.05），治療12個(gè)月與治療6個(gè)月差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療12個(gè)月時(shí)血清sPD-1水平明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表2 AIDS組ART過程中各項(xiàng)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果

2.3 AIDS患者治療12個(gè)月時(shí)CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)及HIV-1載量與CXCR5、sPD-1、Hcy的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)與CXCR5、Hcy均呈正相關(guān)（r值分別為0.192、0.401，P＜0.05），與sPD-1呈負(fù)相關(guān)（r=-0.708，P＜0.05）；HIV-1載量與CXCR5、Hcy均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.682、-0.318，P＜0.05），與sPD-1呈正相關(guān)（r=0.368，P＜0.05）。

3 討論

ART能有效抑制HIV復(fù)制，促進(jìn)機(jī)體免疫重建，降低異常免疫激活，臨床表現(xiàn)為HIV-1載量明顯下降，CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯升高[11]。本研究結(jié)果顯示，AIDS患者行ART后，CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯上升，免疫系統(tǒng)得以重建，而HIV-1載量明顯下降，基本達(dá)到了病毒抑制的效果。

CXCR5屬于B淋巴細(xì)胞組織因子，其不僅表達(dá)于B細(xì)胞表面，還是濾泡輔助性T細(xì)胞表面重要的標(biāo)志物。CXCR5具有抑制病毒轉(zhuǎn)錄的功能[12]。MYLVAGANAM等[13]在猿猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）實(shí)驗(yàn)和ADAMS等[14]在HIV精英控制者（elite controller，EC）研究中均得出了相同的結(jié)論。HE等[15]發(fā)現(xiàn)，CXCR5與HIV載量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.564 8，P=0.035 3）。本研究結(jié)果顯示，AIDS患者治療前CXCR5水平顯著低于正常對照者（P＜0.01），且隨著ART時(shí)間的延長，患者CXCR5水平顯著升高，在治療6個(gè)月時(shí)CXCR5水平達(dá)到峰值，同時(shí)，CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多，HIV-1載量明顯下降，提示免疫功能逐漸得到恢復(fù)。這說明在HIV感染進(jìn)程中，外周血CXCR5水平變化可反映病情的嚴(yán)重程度，對ART有一定的指導(dǎo)意義。

有研究結(jié)果顯示，程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）在HIV-1致病過程中起重要作用，是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)清除病毒、促進(jìn)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素[16]。PD-1/程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）通路在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中扮演著重要的角色，在自身免疫性疾病、免疫耐受、移植排斥及腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[17]。PD-1是1型跨膜蛋白，其跨膜區(qū)由基因的第3個(gè)外顯子編碼，缺失該外顯子的轉(zhuǎn)錄本PD-1Δex3的編碼產(chǎn)物可被分泌至細(xì)胞外，即sPD-1。肖金鳳等[18-19]證實(shí)了sPD-1與HIV感染及病情進(jìn)展密切相關(guān)。SEUNG等[20]的研究結(jié)果顯示，阻斷PD-1可抑制慢性HIV感染的人源化小鼠的病毒復(fù)制。本研究結(jié)果顯示，AIDS患者治療前血清sPD-1水平顯著高于正常對照者（P＜0.01），表明HIV感染可誘導(dǎo)sPD-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道[21-22]一致。本研究結(jié)果還顯示，ART 6個(gè)月時(shí)，AIDS患者血清sPD-1水平變化不明顯，治療12個(gè)月時(shí)出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）；Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清sPD-1水平與CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.708，P＜0.05），而與HIV-1載量呈正相關(guān)（r=0.368，P＜0.05）。提示抗病毒治療一方面可抑制HIV-1復(fù)制，另一方面可能通過下調(diào)sPD-1水平來恢復(fù)PD-1/PD-L1通路，使患者免疫功能得到部分重建。

UCCELLI等[23]的研究結(jié)果顯示，在HIV陽性人群中，高Hcy血癥發(fā)生率高達(dá)28.6%，提示HIV感染者的Hcy代謝過程更易受到干擾。有隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，行ART＞6個(gè)月的HIV感染者血清Hcy水平大幅度升高[24]，與本研究結(jié)果一致。ART藥物可通過干擾Hcy代謝過程中的2種代謝途徑——再甲基化（甲基四氫葉酸還原酶）和轉(zhuǎn)硫作用（β-胱硫醚合成酶）來影響血清 Hcy的水平[25]。也有學(xué)者認(rèn)為，產(chǎn)生高水平Hcy的部分原因與Hcy在代謝過程可能受HIV本身及ART藥物的雙重影響有關(guān)[26]。本研究結(jié)果顯示，AIDS患者經(jīng)ART 12個(gè)月后，TC、TG、LDL-C水平較治療前明顯升高（P＜0.05），說明AIDS患者血脂異常與抗病毒治療有關(guān)，其原因可能與ART會(huì)引起機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，過氧化反應(yīng)會(huì)促進(jìn)機(jī)體大量生成氧自由基，機(jī)體在氧自由基誘發(fā)下會(huì)分解生物膜不飽和脂，從而導(dǎo)致血脂水平升高[27-29]。

綜上所述，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測AIDS患者ART過程中CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)、HIV-1載量、CXCR5、sPD-1、Hcy和血脂的變化，有助于及時(shí)了解HIV感染的進(jìn)展情況，為預(yù)防藥物并發(fā)癥的發(fā)生、適時(shí)更新治療方案、提高治療效果提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。