楊 蒙 蒙， 劉 詩 文， 劉 冰 南

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蝦青素(astaxanthin)作為葉黃素家族中的一種，是類胡蘿卜素的氧化衍生物。蝦青素屬于萜烯類不飽和化合物，具備極強的抗氧化能力，可有效提高機體的免疫力，在心血管疾病、腫瘤和某些免疫系統(tǒng)類疾病的治療與預(yù)防方面具有巨大的潛能[1]。與化學(xué)合成的蝦青素相比，天然來源的蝦青素具有更好的活性。法夫酵母作為蝦青素的一種天然來源，其發(fā)酵條件簡單，易于實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。但法夫酵母最適細胞生長和色素合成的溫度在20 ℃左右，發(fā)酵中后期需消耗大量能源降溫，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，難于工業(yè)化生產(chǎn)。目前報道的提高法夫酵母生產(chǎn)蝦青素溫度的方法主要是原生質(zhì)體融合和化學(xué)誘變。通過原生質(zhì)體融合的方式獲得的耐熱菌株，蝦青素產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比顯著降低[2]，甚至不能生產(chǎn)蝦青素[3]。通過將外源基因整合到法夫酵母基因組以提高蝦青素生產(chǎn)溫度的方法未見報道。

本實驗將外源熱激蛋白編碼基因整合到法夫酵母基因組上，構(gòu)建耐熱基因工程菌株，以期提高法夫酵母耐熱性，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株：E.coliTop10；法夫酵母XanthophyllomycesdendrorhousCBS6938；嗜熱菌ThermusthermophilesHB8 CGMCC1.6492。

所用引物如表1所示。

1.2 方 法

1.2.1 法夫酵母質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 質(zhì)粒pUC18-18S的構(gòu)建

根據(jù)法夫酵母18S rDNA基因序列(GenBank：D 31656.1)，以SalⅠ作為酶切位點設(shè)計引物18S-F和18S-R，以法夫酵母基因組DNA作為模板，使用高保真酶Dpx(Tolobio)進行18S rDNA片段PCR擴增。18S rDNA片段與去磷酸化的pUC18質(zhì)粒線性化載體用T4連接酶(Takara)在16 ℃連接30 min，構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-18S。構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中擴增，用質(zhì)粒小提試劑盒(上海生工)提取質(zhì)粒。以M13F-47和M13R-47為引物進行菌落PCR，驗證質(zhì)粒pUC18-18S是否構(gòu)建成功。

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.2.1.2 質(zhì)粒pUC18-kan-18S的構(gòu)建

在pUC18-18S質(zhì)粒中添加G418抗性基因kan(816 bp，GenBank：KY 860085.1)作為標記，以質(zhì)粒pET-28為模板，以kan-F0和kan-R0為引物，使用高保真酶進行kan基因PCR擴增。根據(jù)法夫酵母基因組中肌動蛋白基因(GenBank：X 89898.1)啟動子(pact，580 bp)和終止子(tact，552 bp)的序列，以SalⅠ作為酶切位點來設(shè)計啟動子引物Pact-F、Pact-R1和終止子引物Tact-F1、Tact-R1，以法夫酵母基因組DNA作為模板，使用高保真酶進行啟動子和終止子片段PCR擴增[4]。將tact-kan-pact通過融合PCR進行連接，連接后的片段與pUC18-18S質(zhì)粒分別用SalⅠ酶切，用T4連接酶進行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴增并提取質(zhì)粒。以M13F-47，kan-F0，Tact-F1為引物進行質(zhì)粒測序，驗證質(zhì)粒pUC18-kan-18S是否構(gòu)建成功。

1.2.2 法夫酵母熱激蛋白元器件的構(gòu)建

提取純化質(zhì)粒pUC18-kan-18S，利用HindⅢ37 ℃酶切1 h。以T.thermophilesHB8基因組為模板，以groes-F和groes-R為引物，采用高保真聚合酶進行PCR擴增，得到306 bp的PCR產(chǎn)物groes(Gene ID：3168828)。以法夫酵母基因組為模板，分別以Pact-groes-F、Pact-groes-R和Tact-groes-F、Tact-groes-R為引物擴增得到片段pact和tact。將pact-groes-tact采用融合PCR方法連接，經(jīng)Hind Ⅲ酶切后，連接到酶切后的pUC18-kan-18S質(zhì)粒上，進行測序，命名為pUC18-kan-18S-groes。

1.2.3 法夫酵母感受態(tài)細胞的電擊轉(zhuǎn)化

感受態(tài)細胞制備和電擊轉(zhuǎn)化參考文獻[5]的方法，采用Eppendorf Eporator電轉(zhuǎn)化儀，具體電擊條件：電轉(zhuǎn)儀電壓500 V，時間5 ms。電擊后菌液涂布于含有50 μg/mL G418的PDA抗性平板上，進行陽性克隆篩選。

1.2.4 法夫酵母XD-G外源基因表達鑒定

2% XD-G種子液接種于PD液體培養(yǎng)基中(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L)，25 ℃振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，每12 h取樣一次，離心去上清，菌體液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，進行RNA提取。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，groes-F1和groes-R1為引物進行PCR。

1.2.5 法夫酵母XD-G發(fā)酵動力學(xué)曲線測定

取9個250 mL搖瓶，裝液量50 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)120 h，每次隨機抽取3瓶取樣，HPLC法測定蝦青素含量[6]、葡萄糖消耗以及細胞OD600。

2 結(jié)果與討論

2.1 法夫酵母表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將法夫酵母18S rDNA基因插入pUC18上作為同源片段，構(gòu)建pUC18-18S質(zhì)粒。將法夫酵母肌動蛋白啟動子pact-G418抗性基因kan-肌動蛋白終止子tact融合成一個片段，構(gòu)建可在法夫酵母中表達的G418抗性基因盒。將基因盒連接到pUC18-18S上構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-kan-18S。經(jīng)測序，證明質(zhì)粒pUC18-kan-18S構(gòu)建成功。

2.2 法夫酵母熱激蛋白元器件的構(gòu)建

嗜熱棲熱菌能夠在75 ℃條件下生長，是由于其細胞內(nèi)含有豐富的熱激蛋白[7]。在高溫環(huán)境下，熱激蛋白能夠幫助熱變性的蛋白質(zhì)恢復(fù)原有的空間構(gòu)象和功能，從而幫助細胞抵御熱脅迫[8]。基因groes編碼的熱激蛋白10(HSP10)通常作為一種輔助蛋白，常與熱激蛋白HSP60(groes基因)形成圓柱形結(jié)構(gòu)，能夠特異性的識別由于高溫導(dǎo)致變性的蛋白質(zhì)，使其進入中空部分，幫助受損蛋白質(zhì)重新正確折疊后，釋放出修復(fù)后的蛋白質(zhì)[9]。

采用融合PCR技術(shù)，將啟動子pact、熱激蛋白基因groes和終止子pact連為一條基因片段，目的基因P-groes-T(1 512 bp)融合結(jié)果如圖1所示。

按構(gòu)建pUC18-kan-18S的方法，將目的基因P-groes-T連接到質(zhì)粒pUC18-kan-18S，構(gòu)建法夫酵母熱激蛋白元器件，命名為pUC18-kan-18S-groes，質(zhì)粒示意圖如圖2所示。將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，利用Amp LB平板進行陽性克隆篩選。以groes-F和groes-R為引物，通過菌落PCR篩選陽性克隆菌株，結(jié)果如圖3所示。

M，DNA marker；1，目的基因groes圖3 質(zhì)粒pUC18-kan-18S-groes的PCR結(jié)果Fig.3 PCR result of positive clones for plasmidpUC18-kan-18S-groes

2.3 耐熱工程菌株的構(gòu)建

2.3.1 法夫酵母XD-G陽性克隆菌株的篩選

挑取抗性平板上生長的法夫酵母菌落進行裂解，以裂解液為DNA模板，以groes-F和groes-R為引物進行PCR，結(jié)果如圖4所示。有3株菌落出現(xiàn)目的基因groes條帶。產(chǎn)物測序，并與groes基因序列比對，驗證該PCR產(chǎn)物為groes基因。結(jié)果表明，groes基因已成功整合到法夫酵母基因組上，命名為法夫酵母XD-G。

M，DNA marker；1，2，3，目的基因groes圖4 法夫酵母XD-G的PCR驗證Fig.4 PCR result of X. dendrorhous XD-G

將法夫酵母XD-G分別置于25、28、30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，測定不同培養(yǎng)條件下XD-G的蝦青素質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果表明，XD-G在25 ℃能夠生長并合成蝦青素，蝦青素質(zhì)量分數(shù)為177.7 μg/g，表明XD-G與野生型法夫酵母相比，培養(yǎng)溫度提高了5 ℃。因此，將目的基因groes整合到法夫酵母基因組上，能夠保護法夫酵母合成蝦青素的相關(guān)酶，使其在25 ℃條件下仍具有活性。但是當培養(yǎng)溫度升高到28～30 ℃，XD-G生物量顯著降低且無蝦青素生成。

2.3.2 法夫酵母XD-G外源基因表達鑒定

如圖5所示，經(jīng)鑒定groes在法夫酵母mRNA水平上有表達，目的基因產(chǎn)物大小為119 bp。PCR產(chǎn)物純化后測序，序列經(jīng)過比對證明為groes目的基因。結(jié)果表明，法夫酵母XD-G在25 ℃培養(yǎng)條件下，外源基因groes在法夫酵母mRNA水平上有表達，但表達量偏低。groes編碼的HSP 10 是典型的熱激蛋白，通常情況HSP 10作為協(xié)助伴侶分子與groes編碼的HSP 60熱激蛋白形成筒狀結(jié)構(gòu)，協(xié)助非天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)和新生肽鏈進行正確折疊，對提高細胞耐熱性發(fā)揮著重要作用[10]。有學(xué)者對釀酒酵母耐熱元器件進行篩選，發(fā)現(xiàn)雖然熱激蛋白基因groes在mRNA上的表達量相較于其他熱激蛋白基因表達量較低，但是插入熱激蛋白基因groes獲得的釀酒酵母工程菌S.c-GroES耐熱性最好[7]。本實驗獲得的法夫酵母耐熱工程菌株法夫酵母XD-G中熱激蛋白基因groes在mRNA上表達量較低，但能夠有效地將法夫酵母最適培養(yǎng)溫度提高5 ℃，與這一結(jié)果相一致。

M，DNA marker；1～5分別為培養(yǎng)12，24，48，72，96 h的目的基因groes圖5 法夫酵母XD-G中g(shù)roes基因在mRNA水平上的表達驗證Fig.5 Expression of the groes gene in X.dendrorhousXD-G at mRNA level

2.4 法夫酵母XD-G發(fā)酵動力學(xué)曲線

如圖6所示，法夫酵母XD-G于84 h時OD600達到最大值，進入菌體發(fā)酵的穩(wěn)定期，此時葡萄糖完全消耗，蝦青素合成達到最大值177.7 μg/g。法夫酵母野生型菌株在25 ℃條件下生物量極低且無蝦青素生成，說明法夫酵母發(fā)酵受溫度影響明顯。在20 ℃的條件下，發(fā)酵96 h后蝦青素產(chǎn)量為140.3 μg/g[11]。與野生型法夫酵母相比，基因工程菌株法夫酵母XD-G的培養(yǎng)溫度提高到25 ℃，菌體的生長速度減慢，蝦青素產(chǎn)量提高了26.7%。在發(fā)酵培養(yǎng)初期，法夫酵母XD-G生長緩慢，說明外源基因groes表達需要一定時間，當表達一定量的熱激蛋白后，熱激蛋白可保護菌體由于升溫帶來的損害。蝦青素產(chǎn)量提高的原因可能是溫度升高導(dǎo)致氧化壓力提高，有研究表明氧化壓力使更多的萜類化合物代謝流進入蝦青素合成途徑[12]。

圖6 法夫酵母XD-G發(fā)酵動力學(xué)曲線Fig.6 Kinetics of X. dendrorhous XD-G

3 結(jié) 論

實驗通過無縫拼接的方式構(gòu)建了法夫酵母表達載體pUC18-kan-18S。從嗜熱棲熱菌HB8基因組中獲得熱激蛋白基因groes，采用融合PCR及無縫拼接的方法構(gòu)建了熱激蛋白元器pUC18-kan-18S-groes。將熱激蛋白元器件電擊轉(zhuǎn)化到法夫酵母感受態(tài)細胞中，篩選出pUC18-kan-18S-groes陽性克隆菌株法夫酵母XD-G，并驗證了其在RNA水平上有一定表達。升高培養(yǎng)溫度至25 ℃，法夫酵母XD-G能夠在25 ℃條件下生長并合成蝦青素，發(fā)酵84 h蝦青素產(chǎn)量達到177.7 μg/g，比20 ℃培養(yǎng)時蝦青素產(chǎn)量提高了26.7%。