馬曉靜 胡洋 李正剛 王丹彧*

（1.四平市食品藥品檢驗(yàn)所 吉林四平 136000；2.第964醫(yī)院第二門(mén)診部）

1 前言

黃曲霉毒素（AF）是黃曲霉菌寄生曲霉菌的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)植物及土壤中，是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類健康危害極為嚴(yán)重的一類霉菌毒素，花生、稻米、玉米、小麥等糧油類產(chǎn)品最易受其污染，嚴(yán)重影響人體健康。尤其是AFB1，具有極強(qiáng)的急性毒性和致癌性[1-5]。黃曲霉毒素因其強(qiáng)致癌性危害人體健康，故成為中藥質(zhì)量監(jiān)測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。的檢測(cè)為痕量分析，技術(shù)較為復(fù)雜近幾年來(lái)，黃曲霉毒素備受關(guān)注。

目前，各地花生衣藥材的來(lái)源不一，吉林省花生衣藥材的主要來(lái)源為東北四粒紅和白沙類，主要集中在松原市和四平市。由于花生衣的加工較為粗放，存在被黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，本文采用免疫親和柱凈化HPLC法[6-12]，測(cè)定花生衣藥材中黃曲霉毒素的含量，評(píng)估樣品及加工過(guò)程的安全性，為吉林省花生衣藥材的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持，以期為相關(guān)人員提供參考。

2 儀器與材料

高效液相色譜儀（Agilent 1260A，安捷倫公司）；光化學(xué)衍生器（KRC-25，青島普瑞邦）；超聲波清洗器（KQ-600E，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（125D-1CN，賽多利斯公司）。

黃曲霉毒素混合對(duì)照品（批號(hào)：610001-201804，AFB1含量0.93μg/ml，AFB2含量0.30μg/ml，AFG1含量0.93μg/ml，AFG2含量0.35μg/ml，中國(guó)食品藥品檢定研究院），甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

10批四粒紅類花生衣和10批白沙類花生衣藥材，均來(lái)自吉林省松原市和四平市的花生加工廠；吉林省企業(yè)提供2批，山東省企業(yè)提供1批，網(wǎng)購(gòu)1批；其具體基原不明，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院包海鷹教授鑒定為落花生Arachis hypogaea L.的干燥種皮。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18，250×4.6 mm，5μm；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（40：20：40）；流速：0.8 mL/min；柱溫：25℃。以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)λex=360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λex=450 nm。相鄰的2個(gè)色譜峰的分離度＞1.5。

3.2 溶液的制備

3.2.1 黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液的制備

精密量取混合對(duì)照品溶液1 ml，置于20 ml量瓶中，加入70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為黃曲霉毒素對(duì)照品的貯備溶液。精密量取對(duì)照品貯備溶液2 ml，置于50ml量瓶中，加入70%甲醇的稀釋至刻度，搖勻，即得黃曲霉毒素濃度依次1.9 ng/ml、0.6 ng/ml、1.9 ng/ml和0.7 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

精密稱定經(jīng)粉碎的花生衣藥材（過(guò)2號(hào)篩）粉末15 g，置于均質(zhì)瓶中；加入氯化鈉2 g，精密加入70%的甲醇溶液75 ml，11 000 r/min高速攪拌2 min，5 000 r/min離心10 min；精密量取上清液15 ml，置于50ml的量瓶中；用水稀釋至刻度，搖勻，5000r/min離心5 min；量取上清液20 ml，過(guò)免疫親合柱，流速為3 m/min；使用20 ml的水洗脫，棄去洗脫液；讓空氣進(jìn)入，將水?dāng)D出，用一定量甲醇進(jìn)行洗脫；收集洗脫液，置于2 ml的量瓶中；加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過(guò)，即得。

3.2.3 空白溶液

照3.2.2項(xiàng)下的制備方法，不加入樣品，其它同法處理，即可。

3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液，注入液相色譜，記錄色譜圖，得到黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的色譜峰，可見(jiàn)空白無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

3.4 線性試驗(yàn)

精密量取3.2.1中的混合對(duì)照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積；以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

線性方程：AFB1Y=2960.7X-0.0288，r=1.000，線性范圍：0.009 3 ng~0.046 5 ng；AFB2Y=7429.4X+0.3177，r=0.999 9，線性范圍：0.003 0 ng~0.015 0 ng；AFG1Y=1163.5X+1.2988，r=0.999 9，線性范圍：0.009 3 ng~0.046 5 ng；AFG2Y=4278.1X+0.5727，r=0.999 8，范圍0.003 5 ng~0.017 5 ng。

3.5 檢出限與定量限

3.5.1 檢出限

取供試品粉末約15 g，精密加入黃曲霉毒素混合對(duì)照品貯備溶液50μl；按照3.2.2中的方法法操作，得到檢出限供試品溶液；照3.1中的色譜條件測(cè)定色譜峰，并計(jì)算信噪比。

結(jié)果顯示，AFB1的檢出限為0.16μg/kg，S/N=5；AFB2的檢出限為0.05μg/kg，S/N=4；AFG1的檢出限為0.16μg/kg，S/N=7；AFG2的檢出限為0.06μg/kg，S/N=7。

3.5.2 定量限

精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液1.5 ml，置于10 ml容量瓶中；加入甲醇稀釋至刻度，精密量取50μl；加入供試品粉末約15 g，精密稱定；按照3.2.2中的方法操作，得到定量限供試品溶液；按照3.1中的色譜條件測(cè)定色譜峰，計(jì)算信噪比。

結(jié)果顯示，AFB1的檢出限為0.5μg/kg，S/N=16；AFB2的檢出限為0.2μg/kg，S/N=12；AFG1的檢出限為0.5μg/kg，S/N=19；AFG2的檢出限為0.2 μg/kg，S/N=20。

3.6 回收率試驗(yàn)

取批號(hào)為HSY-1的樣品，粉碎（過(guò)2號(hào)篩），稱取約15 g，共6份，精密稱定；精密加入黃曲霉毒素混合對(duì)照品50μl，按照3.2.2的方法操作，得到供試品溶液；依照建立的方法測(cè)定供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的含量。

結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1的平均收率為111%，RSD%=0.8%（n=6）；黃曲霉毒素B2的平均回收率為108%，RSD%=1.0%（n=6）；黃曲霉毒素G1的平均回收率為95%，RSD%=1.2%（n=6）；黃曲霉毒素G2的平均回收率為108%，RSD%=0.8%（n=6）。按照《中國(guó)藥典》2015年四部分析方法的驗(yàn)證指導(dǎo)原則，回收率應(yīng)為75%～120%，通過(guò)試驗(yàn)可知，本文測(cè)定方法的準(zhǔn)確度滿足方法驗(yàn)證要求。

3.7 樣品測(cè)定

取花生衣樣品，按照3.2.2項(xiàng)中的方法制備供試品溶液，按照3.1中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，結(jié)果顯示，24批樣品中均未檢出。

4 討論

本文對(duì)《中國(guó)藥典》2015年版中的黃曲霉毒素檢測(cè)方法進(jìn)行完善：通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的調(diào)整，改善對(duì)照品的分離度；通過(guò)改變?nèi)軇纳茦恿窟^(guò)大時(shí)對(duì)照品峰變型的問(wèn)題；借助高速勻漿、免疫親和柱凈化，排除雜質(zhì)干擾。試驗(yàn)結(jié)果證明，該方法的回收率良好。

花生衣藥材的來(lái)源為食品落花生的種皮，檢測(cè)食品中黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)眾多，限度不一，方法也不盡相同[13-14]。本文收集的24批樣品中均未檢出黃曲霉毒素，原因可能為：吉林省落花生的采收及加工時(shí)節(jié)多在每年10月份至次年2月，該時(shí)間段的溫度和濕度均較低，使花生衣藥材較為干燥容易儲(chǔ)存，在加工和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中不易受黃曲霉毒素污染。