梁光平，楊 俊*，吳云秋，萬路平，阮麗君，宋志軍

（1遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，遵義 563006；2廣西壯族自治區(qū)藥用植物園西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，南寧 530023）

鬼臼毒素（podophyllotoxin）是一種具有顯著抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，但因其存在水溶性較差、骨髓抑制、易產(chǎn)生耐藥性等缺陷嚴重制約了臨床應(yīng)用［1-2］。雖然許多藥學(xué)工作者對鬼臼毒素進行了大量的結(jié)構(gòu)改造，相繼也發(fā)現(xiàn)了依托泊苷（etopo?side）、替尼泊苷（teniposide）等藥物［3］。然而，它們在臨床應(yīng)用時依然存在水溶性差、易耐藥、嚴重的胃腸道功能紊亂等缺陷。因此，尋找更安全、選擇性更好的鬼臼毒素類衍生物十分必要。

研究表明［4-5］，N-芐氧羰基甘氨酰-L-脯氨酸（ZGly-Pro-OH）能特異性激活FAPα 酶，導(dǎo)致腫瘤細胞行為發(fā)生改變。這在表阿霉素［6］、吉西他濱［7］、沙蟾毒精［8］、蟾毒靈［9］等多個副作用較強的小分子中得以證實，這些副作用較強的小分子在與Z-Gly-Pro-OH 連接后，它們對正常器官或組織的副作用均有顯著的降低。結(jié)合文獻對鬼臼毒素構(gòu)效關(guān)系的報道［10］，本課題組前期借助計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)篩選鬼臼毒素C4-OH 與Z-Gly-Pro-OH 之間的連接臂，最終獲得130余個虛擬分子［11］。從這些虛擬分子中可知，采用氨基酸作為連接臂時，形成的虛擬分子與FAPα 酶具有更多的結(jié)合位點。為進一步研究氨基酸作為連接臂在該類鬼臼毒素衍生物研發(fā)中的價值，本研究采用不同的氨基酸將鬼臼毒素與Z-Gly-Pro-OH 進行拼接，合成了10 個新的鬼臼毒素衍生物，并通過測試它們的抗腫瘤活性，以期為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型鬼臼毒素候選分子提供參考。

1 合成路線

合成路線如路線1所示。以鬼臼毒素為原料，通過與N-Cbz保護的不同氨基酸進行酯化反應(yīng)，中間體Ⅰ脫除Cbz保護基得到中間體Ⅱ，最后與N-芐氧羰基甘氨酰-L-脯氨酸（Z-Gly-Pro-OH）進行酰胺化反應(yīng)制得目標化合物Ⅲ。同時，鬼臼毒素與ZGly-Pro-OH 直接進行酯化反應(yīng)得到目標化合物Ⅳ。

2 實驗部分

2. 1 儀器和試劑

Avance NEO 400 MHz、600MHz 核磁共振儀（德國Bruker 公司，CDCl3為溶劑，TMS 為內(nèi)標）；LCMS-8045 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；CKX41 倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；ELx808酶標儀（美國BioTek公司）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義瑞德儀器）；DFY-10L/80 低溫恒溫反應(yīng)浴（鞏義予華儀器公司）；MTT 試劑盒（上海碧云天公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）。所有化學(xué)試劑均為市售化學(xué)純或分析純，未經(jīng)純化處理直接使用。

2. 2 化學(xué)合成

中間體Ⅰa 在50 mL 的反應(yīng)管中，依次加入鬼臼毒素（0. 207 g，0. 5 mmol）、N-芐氧羰基-L-丙氨酸（0. 167 g，0. 75 mmol，1. 5 eq.）、DMAP（0. 183 g，1. 50 mmol，3. 0 eq.）、無水CH2Cl2（10 mL），攪拌溶解，N2保護下，0 ℃冷卻攪拌30 min 后，再加入DCC（0. 155 g，0. 75 mmol，1. 5 eq.），自然升溫到室溫，薄層色譜（TLC）監(jiān)測，約2 ~ 3 h 反應(yīng)完全，加入乙酸乙酯（50 mL × 2）萃取，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮溶劑，得無色油狀物，產(chǎn)物未經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。中間體Ⅰb ~ Ⅰh按照相同方法合成得到。

中間體Ⅱa 取上一步濃縮至干的油狀化合物Ⅰa（0. 20 g，0. 287 mmol）于100 mL的茄形瓶，N2保護下，依次加入CH2Cl2（10 mL）、PdCl2（5. 0 mg，0. 29 mmol，0. 1 eq.）、三乙胺（0. 12 mL，0. 86 mmol，3. 0 eq.），攪拌溶解，室溫下緩慢滴加三乙基硅烷（0. 14 mL，0. 86 mmol，3. 0 eq.）的CH2Cl2溶液（1 mL），薄層色譜（TLC）監(jiān)測，約20 ~ 40 min反應(yīng)完全，緩慢滴加三氟乙酸（0. 5 mL）終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌30 min，加入1 mol/L 的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH 至8，硅藻土過濾，濾液用乙酸乙酯萃?。?0 mL × 2），依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮溶劑，得淺黃色油狀物，產(chǎn)物未經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。中間體Ⅱb ~ Ⅱh按照相同方法合成得到。

Scheme 1 Synthetic route of FAPα-activated podophyllotoxin derivatives

化合物Ⅲa 參照中間體Ⅰa 的方法制備，在50 mL 的反應(yīng)管中，依次加入中間體Ⅱa（0. 207 g，0. 5 mmol）、Z-Gly-Pro-OH（0. 75 mmol，1. 5 eq.）、DMAP（0. 183 g，1. 50 mmol，3. 0 eq.）、無水CH2Cl2（10 mL），攪拌溶解，N2保護下，0 ℃冷卻攪拌30 min 后，再加入DCC（0. 155 g，0. 75 mmol，1. 5 eq.），自然升溫到室溫反應(yīng)，薄層色譜（TLC）監(jiān)測，約3 ~ 4 h 反應(yīng)完全，加入乙酸乙酯（50 mL × 2）萃取，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮溶劑，得粗產(chǎn)品，采用硅膠柱色譜分離純化［洗脫劑：乙酸乙酯-石油醚（2∶1）］，得白色固體，即目標化合物Ⅲa。目標化合物Ⅲb ~Ⅲi、Ⅳ按照相同方法合成得到。

化合物Ⅲa 白色固體，總收率38. 6%；mp 180 ~181 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 38 ~ 7. 30（7H，m，Ar-H × 5，NH × 2），6. 84（1H，s，Ar-H），6. 52（1H，s，Ar-H），6. 38（2H，s，-OCH2O-），5. 96（2H，d，J= 6. 9 Hz），5. 72（1H，s），5. 12（2H，s，Ar-CH2），4. 60（1H，d，J= 4. 3 Hz），4. 57（1H，d，J=7. 5 Hz），4. 51 ~ 4. 42（1H，m），4. 36（1H，dd，J=9. 0，7. 1 Hz），4. 24 ~ 4. 14（1H，m），4. 00（2H，d，J= 14. 7 Hz），3. 81（3H，s，-OCH3），3. 75（6H，s，-OCH3× 2），3. 66 ~ 3. 51（2H，m），3. 42（1H，dd，J=16. 7，8. 9 Hz），2. 86 ~ 2. 76（1H，m），2. 42 ~ 2. 32（1H，m），2. 18 ~ 2. 11（1H，m），2. 06 ~ 1. 98（1H，m），1. 96 ~ 1. 86（1H，m），1. 42（3H，d，J= 7. 2 Hz，CH3）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 6（C==O），173. 3（C==O），170. 8（C==O），168. 5（C==O），156. 3（C==O），152. 6（C × 2），148. 2，147. 6，137. 0，136. 2，134. 8，132. 1，128. 5（C × 2），128. 2，128. 1（C × 2），127. 8，109. 6，108. 1，108. 0，107. 2，101. 6（-OCH2O-），74. 4，71. 1，67. 0，60. 7（-OCH3），59. 9，56. 2（-OCH3），56. 1（-OCH3），48. 7，46. 5，45. 4，43. 6，43. 4，38. 5，29. 7，24. 9，17. 5（CH3）；ESI-MS（m/z）：796. 2［M + Na］+。

化合物Ⅲb 白色固體，總收率5. 8%；mp 104 ~105 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 39 ~ 7. 29（7H，m，Ar-H × 5，NH × 2），6. 87（1H，s，Ar-H），6. 53（1H，s，Ar-H），6. 38（2H，s，OCH2O），5. 97（2H，d，J= 6. 6 Hz），5. 69（1H，s），5. 12（2H，s，Ar-CH2），4. 61（1H，d，J= 4. 4 Hz），4. 44（1H，dd，J=13. 7，6. 5 Hz），4. 36（1H，dd，J= 9. 2，7. 1 Hz），4. 24 ~ 4. 12（2H，m），4. 05 ~ 3. 96（2H，m），3. 81（3H，s，OCH3），3. 75（6H，s，OCH3× 2），3. 60 ~ 3. 53（1H，m），3. 42（1H，dd，J= 16. 7，9. 2 Hz），2. 93（1H，dd，J= 14. 5，4. 5 Hz），2. 85 ~ 2. 74（1H，m），2. 45 ~ 2. 36（1H，m），2. 19 ~ 2. 10（1H，m），2. 05（1H，dd，J= 10. 0，6. 7 Hz），1. 92 ~ 1. 84（1H，m），1. 82 ~ 1. 74（1H，m），1. 40 ~ 1. 31（3H，m），0. 91（3H，t，J= 7. 3 Hz，CH3）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 6（C==O），173. 0（C==O），170. 8（C==O），168. 5（C==O），156. 3（C==O），152. 7（C × 2），148. 3，147. 7，137. 2，136. 3，134. 9，132. 2，128. 6（C × 2），128. 2，128. 1（C × 2），127. 9，109. 6，108. 1（C × 2），107. 3，101. 6，74. 4，71. 3，67. 1，60. 8（OCH3），60. 0 56. 2（OCH3× 2），52. 9，46. 5，45. 5，43. 7，43. 5，38. 6，33. 9，27. 2，24. 9，18. 9，13. 7（CH3）；ESI-MS（m/z）：824. 3［M + Na］+。

化合物Ⅲc（Ⅲb的C4β異構(gòu)體） 白色固體，總收率28. 5%；mp 187 ~ 188 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 38 ~ 7. 30（6H，m，Ar-H × 2，NH），7. 20（1H，d，J= 6. 9 Hz，NH），6. 80（1H，s，Ar-H），6. 50（1H，s，Ar-H），6. 38（2H，d，J= 5. 1 Hz，OCH2O），5. 95（2H，d，J= 11. 2 Hz），5. 78（1H，d，J= 5. 4 Hz），5. 11（2H，d，J= 9. 5 Hz，Ar-CH2），4. 55（1H，d，J= 6. 9 Hz），4. 41（1H，dd，J= 9. 6，6. 7 Hz），4. 36（1H，d，J= 3. 8 Hz），4. 33 ~ 4. 27（2H，m），4. 04 ~3. 96（2H，m），3. 83（3H，s，OCH3），3. 80（6H，s，OCH3× 2），3. 58 ~ 3. 51（1H，m），3. 43 ~ 3. 37（1H，m），3. 24（1H，dd，J= 9. 2，3. 8 Hz），2. 92 ~ 2. 85（1H，m），2. 38 ~ 2. 31（1H，m），2. 15 ~ 2. 08（1H，m），2. 07 ~ 1. 97（1H，m），1. 91 ~ 1. 82（1H，m），1. 52 ~ 1. 43（1H，m），1. 28 ~ 1. 20（3H，m），0. 84（3H，t，J= 7. 3 Hz，CH3）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：177. 1（C==O），172. 2（C==O），170. 7（C==O），168. 4（C==O），156. 3（C==O），153. 3（C × 2），148. 5，147. 3，138. 9，136. 9，136. 3，130. 9，128. 5（C × 2），128. 2，128. 1（C × 2），126. 0，109. 7，108. 0，105. 6（C × 2），101. 4（OCH2O），73. 0，70. 6，67. 0，60. 8（OCH3），60. 0，56. 2（OCH3× 2），52. 8，46. 4，45. 6，44. 0，43. 4，39. 7，33. 6，27. 3，24. 9，18. 8（CH2），13. 6（CH3）；ESI-MS（m/z）：824. 2［M +Na］+。

化合物Ⅲd 白色固體，收率23. 8%；mp 114 ~115 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 44（1H，d，J= 7. 1 Hz，NH），7. 38 ~ 7. 32（5H，m，Ar-H），7. 31（1H，d，J= 4. 7 Hz，NH），6. 89（1H，s，Ar-H），6. 52（1H，s，Ar-H），6. 38（2H，s，OCH2O），5. 97（2H，d，J= 9. 5 Hz，Ar-H），5. 92（1H，d，J= 9. 3 Hz），5. 12（2H，s，Ar-CH2），4. 62（1H，d，J= 7. 2 Hz），4. 60（1H，d，J= 4. 1 Hz），4. 47（1H，d，J= 8. 0 Hz），4. 35（1H，dd，J= 13. 9，6. 4 Hz），4. 21（1H，t，J= 9. 9 Hz），4. 03（2H，s），3. 81（3H，s，OCH3），3. 77（1H，s），3. 74（6H，s，OCH3× 2），3. 56（1H，t，J= 7. 7 Hz），3. 42（1H，dd，J= 16. 6，9. 1 Hz），2. 92（1H，dt，J= 13. 2，6. 6 Hz），2. 84 ~ 2. 74（1H，m），2. 46 ~2. 37（1H，m），2. 33 ~ 1. 99（2H，m），1. 93 ~ 1. 82（1H，m），1. 76 ~ 1. 53（2H，m），0. 90（6H，m，CH3×2）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 5（C==O），172. 2（C==O），170. 8（C==O），168. 6（C==O），156. 3（C==O），152. 7（C × 2），148. 3，147. 7，137. 2，136. 3，134. 9，132. 2，128. 6（C × 2），128. 2，128. 1（C × 2），127. 9，109. 6，108. 1（C × 2），107. 4，101. 6（OCH2O），74. 5，71. 4，67. 1，60. 8（OCH3），60. 0，57. 3，56. 1（OCH3× 2），46. 5，45. 6，43. 7，43. 5，38. 7，37. 3，27. 0，25. 6，25. 0，15. 6（CH3），11. 6（CH3）；ESI-MS（m/z）：838. 1［M + Na］+。

化合物Ⅲe 白色固體，總收率24. 2%；mp 100 ~ 101 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 46（1H，d，J= 7. 3 Hz，NH），7. 38 ~ 7. 30（5H，m，Ar-H），6. 88（1H，s，Ar-H），6. 52（1H，s，Ar-H），6. 38（2H，s，OCH2O），5. 97（2H，d，J= 8. 8 Hz，Ar-H），5. 92（1H，d，J= 9. 2 Hz），5. 11（2H，d，J= 8. 6 Hz，Ar-CH2），4. 63（1H，d，J= 7. 6 Hz），4. 60（1H，d，J=4. 6 Hz），4. 43 ~ 4. 31（2H，m），4. 20（1H，dd，J=16. 7，7. 0 Hz），4. 09 ~ 3. 98（2H，m），3. 81（3H，s，OCH3），3. 74（6H，s，OCH3× 2），3. 62 ~ 3. 51（1H，m），3. 42（1H，dd，J= 16. 8，9. 3 Hz），2. 92（1H，dt，J= 14. 1，7. 1 Hz），2. 86 ~ 2. 73（1H，m），2. 48 ~2. 39（1H，m），2. 22 ~ 2. 01（3H，m），1. 94 ~ 1. 82（1H，m），0. 94（3H，d，J= 4. 6 Hz，CH3），0. 92（3H，d，J= 4. 5 Hz，CH3）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 6（C==O），172. 4（C==O），171. 0（C==O），168. 7（C==O），156. 4（C==O），152. 8（C × 2），148. 4，147. 8，137. 3，136. 4，134. 9，132. 3，128. 7（C × 2），128. 4，128. 2（C × 2），127. 9，109. 7，108. 2（C × 2），107. 5，101. 8（OCH2O），74. 6，71. 5，67. 2，60. 9（OCH3），60. 1，58. 2，56. 3（OCH3× 2），46. 6，45. 7，43. 8，43. 6，38. 8，30. 8，27. 1，25. 1，19. 2（CH3），18. 3（CH3）；ESI-MS（m/z）：824. 2［M + Na］+。

化合物Ⅲf 白色固體，總收率21. 7%；mp 96 ~97 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 43 1H，（d，J= 7. 7 Hz，NH），7. 36 ~ 7. 29（6H，m，Ar-H，NH），6. 89（1H，s，Ar-H），6. 51（1H，s，Ar-H），6. 38（2H，s，OCH2O），5. 96（2H，d，J= 7. 2 Hz），5. 92（1H，d，J=5. 0 Hz），5. 11（2H，s，Ar-CH2），4. 61（1H，d，J= 4. 5 Hz），4. 58（1H，d，J= 6. 4 Hz），4. 39（1H，dd，J=9. 2，7. 1 Hz），4. 24 ~ 4. 14（2H，m），3. 82 ~ 3. 78（2H，m），3. 79（3H，s，OCH3），3. 75（6H，s，OCH3×2），3. 64 ~ 3. 52（3H，m），3. 46 ~ 3. 37（1H，m），2. 97 ~ 2. 88（1H，m），2. 85 ~ 2. 72（1H，m），2. 44 ~2. 24（1H，m），2. 03（1H，m），1. 98 ~ 1. 88（2H，m），1. 08（s，9H，CH3）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 7（C==O），171. 0（C==O），170. 8（C==O），168. 0（C==O），156. 2（C==O），152. 6（C × 2），148. 2，147. 6，137. 1，136. 2，134. 9，132. 1，128. 5（C × 2），128. 2，128. 0（C × 2），127. 7，109. 6，108. 0（C × 2），107. 3，101. 6（OCH2O），74. 6，73. 7，71. 3，67. 0，62. 2，60. 7（OCH3），60. 0，56. 1（OCH3× 2），49. 8，46. 3，45. 4，43. 6，43. 4，38. 8，28. 1，27. 2（CH3× 3），24. 8；ESI-MS（m/z）：868. 3［M + Na］+。

化合物Ⅲg 白色固體，總收率35. 9%；mp 134 ~ 135 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 63（1H，d，J= 6. 1 Hz，NH），7. 43（1H，d，J= 7. 5 Hz，NH），7. 40 ~ 7. 30（5H，m），6. 90（1H，s，Ar-H），6. 53（1H，s，Ar-H），6. 39（2H，s，OCH2O），5. 97（2H，d，J= 5. 0 Hz，Ar-H），5. 93（1H，d，J= 9. 3 Hz），5. 12（2H，s，Ar-CH2），4. 66（1H，d，J= 4. 7 Hz），4. 44（1H，d，J= 6. 6 Hz），4. 39 ~ 4. 32（1H，m），4. 23 ~ 4. 12（2H，m），4. 10 ~ 3. 92（2H，m），3. 81（3H，s，OCH3），3. 75（6H，s，OCH3× 2），3. 68 ~3. 36（3H，m），2. 97 ~ 2. 76（1H，m），2. 44 ~ 2. 23（1H，m），2. 15 ~ 1. 81（5H，m），1. 42 ~ 1. 25（1H，m），1. 00 ~ 0. 85（6H，m，CH3× 2）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 6（C==O），171. 0（C==O），168. 5（C==O），167. 3（C==O），156. 1（C==O），152. 6（C × 2），148. 2，147. 7，137. 1，136. 3，134. 9，132. 1，128. 5（C × 2），128. 2，128. 1（C × 2），127. 9，109. 5，108. 0（C × 2），107. 3，101. 6，74. 3，71. 2，67. 0，60. 7（OCH3），59. 2，56. 1（OCH3× 2），51. 7，46. 8，45. 5，43. 7，43. 4，40. 6，33. 9，27. 2，25. 3，24. 9，22. 6，21. 9；ESI-MS（m/z）：838. 3［M + Na］+。

化合物Ⅲh 白色固體，收率25. 8%；mp 206 ~207 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 54（1H，d，J= 7. 0 Hz，NH），7. 43（1H，d，J= 8. 6 Hz，NH）），7. 41 ~ 7. 31（5H，m，Ar-H），7. 24 ~ 7. 17（3H，m，Ar-H），7. 11（1H，s），7. 09（1H，s），6. 54（1H，s，Ar-H），6. 49（1H，s，Ar-H），6. 36（2H，s，OCH2O），5. 94（1H，s），5. 89（1H，s），5. 81（1H，d，J= 9. 4 Hz），5. 14（2H，d，J= 4. 0 Hz，Ar-CH2），4. 58（1H，d，J= 4. 5 Hz），4. 55（1H，d，J= 7. 2 Hz），4. 16 ~ 4. 07（2H，m），3. 99（1H，d，J= 4. 8 Hz），3. 86（1H，d，J= 3. 9 Hz），3. 81（3H，s，OCH3），3. 74（6H，s，OCH3× 2），3. 58（1H，dd，J= 8. 3，5. 8 Hz），3. 53 ~ 3. 39（3H，m），3. 20 ~ 3. 15（1H，m），2. 89（1H，dd，J= 14. 5，4. 6 Hz），2. 71 ~ 2. 61（1H，m），2. 47 ~ 2. 33（1H，m），2. 07 ~ 1. 89（3H，m）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 6（C==O），171. 9（C==O），170. 4（C==O），168. 4（C==O），156. 2（C==O），152. 6（C × 2），148. 2，147. 5，136. 2，135. 5，134. 9，132. 1，129. 1（C × 2），128. 7，128. 6（C × 2），128. 5（C × 2），128. 4，128. 2，128. 1，127. 5（C × 2），109. 5，108. 0（C × 2），107. 3，101. 6（OCH2O），74. 8，71. 3，67. 1，60. 7（OCH3），59. 8，56. 2（OCH3× 2），53. 8，46. 3，45. 5，43. 6，43. 4，38. 4，33. 9，28. 1，24. 9；ESI-MS（m/z）：872. 1［M + Na］+。

化合物Ⅲi 白色固體，總收率26. 3%；mp 124 ~ 125 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 52（1H，t，J= 6. 1 Hz，NH），7. 47（1H，d，J= 5. 7 Hz，NH），7. 45-7. 41（1H，m），7. 40 ~ 7. 31（9H，m，Ar-H），7. 11（1H，t，J= 7. 6 Hz），6. 93（1H，t，J= 7. 5 Hz），6. 55（1H，s），6. 49（1H，s），6. 38（2H，s，OCH2O），5. 78（1H，d，J= 9. 4 Hz），5. 14（1H，d，J=7. 2 Hz，Ar-CH），5. 11（1H，d，J= 4. 8 Hz，Ar-CH），4. 56（1H，d，J= 4. 3 Hz），4. 52（1H，d，J= 7. 6 Hz），4. 43 ~ 4. 28（1H，m），4. 22 ~ 4. 15（1H，m），4. 02（2H，t，J= 7. 9 Hz），3. 89（1H，d，J= 7. 5 Hz），3. 81（3H，s，OCH3），3. 75（6H，s，OCH3× 2），3. 60 ~ 3. 53（1H，m），3. 51 ~ 3. 39（1H，m），3. 37 ~ 3. 32（1H，m），3. 25（2H，dd，J= 14. 4，6. 5 Hz），2. 94 ~ 2. 81（1H，m），2. 31 ~ 2. 24（1H，m），2. 18 ~ 1. 87（3H，m）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 7（C==O），172. 4（C==O），170. 9（C==O），168. 4（C==O），156. 8（C==O），152. 6（C × 2），148. 3，147. 5，136. 3，136. 2，135. 0，134. 8，132. 1，128. 7（C × 2），128. 5，128. 1，128. 0（C × 2），127. 9，123. 2，122. 4，119. 5，118. 2，111. 5，109. 5，109. 1，108. 2，108. 0，107. 3，101. 6（OCH2O），74. 6，71. 2，67. 6，60. 8（OCH3），59. 9，56. 3（OCH3× 2），53. 5，46. 2，45. 5，43. 6，43. 4，38. 4，30. 7，29. 7，24. 8；ESI-MS（m/z）：889. 4［M + H］+。

化合物Ⅳ白色固體，收率56. 2%；mp 176 ~177 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7. 41 ~ 7. 29（5H，m，Ar-H），6. 97（1H，s，Ar-H），6. 52（1H，s，Ar-H），6. 39（2H，s，OCH2O），5. 98（1H，s，Ar-H），5. 97（1H，d，J= 1. 0 Hz，Ar-H），5. 11（2H，s，Ar-CH2），4. 60（1H，d，J= 4. 3 Hz），4. 54（1H，d，J= 8. 3 Hz），4. 34（1H，t，J= 8. 0 Hz），4. 17（1H，dd，J= 12. 8，6. 7 Hz），4. 13 ~ 4. 05（1H，m），3. 97（2H，dd，J=17. 1，4. 2 Hz），3. 80（3H，s，OCH3），3. 75（6H，s，OCH3× 2），3. 65 ~ 3. 50（3H，m），2. 96 ~ 2. 74（1H，m），2. 71 ~ 2. 62（1H，m），2. 54 ~ 2. 44（1H，m），2. 33 ~ 2. 21（1H，m），2. 18 ~ 1. 91（1H，m）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：173. 6（C==O），172. 6（C==O），167. 2（C==O），156. 3（C==O），152. 6（C ×2），148. 2，147. 8，137. 3，136. 3，134. 9，132. 1，128. 5（C × 2），128. 1（C × 3），128. 0，109. 6，108. 3（C × 2），107. 2，101. 6（OCH2O），74. 4，71. 1，67. 0，60. 8（OCH3），59. 2，56. 3（OCH3× 2），46. 1，45. 4，43. 7，43. 4，38. 5，29. 2，25. 0；ESI-MS（m/z）：702. 3［M］+。

2. 3 抗腫瘤活性測試

以鬼臼毒素（podophyllotoxin）和臨床使用的抗腫瘤藥物依托泊苷為陽性對照，目標化合物設(shè)置3. 125，6. 25，12. 5，25，50，100 μmol/L 6 個濃度，按文獻［12］的MTT 法測試對人肝癌細胞HepG2、人髓系白血病單核細胞THP-1、人宮頸癌細胞HeLa、人乳腺癌細胞MCF-7的體外抗細胞增殖活性。

2. 4 分子對接模擬分析

采用ChemBio3D Ultra 14. 0繪制目標化合物結(jié)構(gòu)并進行能量最小化，設(shè)置Minimum RMS Gradient為0. 001，保存為mol2 格式。將優(yōu)化的目標化合物導(dǎo)入AutodockTools1. 5. 6 進行加氫、計算并分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫下載FAPα 蛋白（PDB ID：1Z68），使用PyMoL（2. 3. 0）去除水分子，將蛋白導(dǎo)入AutoDock?tools1. 5. 6 進行加氫、計算并分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。 采用Autodock Vina1. 1. 2 進行對接，參數(shù)設(shè)置為：中心坐標（cen?ter_x=38. 033，center_y=0. 39，center_z=69. 392）；格點盒子大小設(shè)定為126 × 126 × 126（格點間距為0. 375 ?），其余參數(shù)為默認。利用PyMOL 2. 3. 0對結(jié)果進行相互作用分析。

3 結(jié)果與討論

3. 1 化合物的合成

在合成中間體Ⅰ時，嘗試了N-叔丁氧羰基（Boc）、N-芴甲氧羰基（Fmoc）保護的氨基酸與鬼臼毒素反應(yīng)，但所得產(chǎn)物在進行脫Boc 或脫Fmoc 時，無法將Boc 或Fmoc 徹底脫除，產(chǎn)物經(jīng)MS 確認也不是所需中間體Ⅱ，最終選擇芐氧羰基（Cbz）保護的氨基酸作為原料，通過兩步反應(yīng)成功制備了中間體Ⅱ。同時，在TLC 跟蹤第一步反應(yīng)進度時，發(fā)現(xiàn)除原料與縮合劑外有2 個新的斑點生成，且這2 個新斑點在后續(xù)進行第二步和第三步反應(yīng)時分別轉(zhuǎn)為新產(chǎn)物而消失，由此我們斷定這2個斑點為目標中間體Ⅰ的α和β兩種異構(gòu)體。在進行脫Boc或脫Fmoc制備中間體Ⅱ時，采用三乙基硅烷作為氫源、氯化鈀催化的條件下，在20 ~ 40 min 的時間內(nèi)得到中間體Ⅱ，且該條件所需試劑相比鈀碳-氫氣的條件更便捷、更安全。在合成目標產(chǎn)物Ⅲ時，用TLC 檢測目標產(chǎn)物存在α和β兩種異構(gòu)化產(chǎn)物，但由于β構(gòu)型產(chǎn)物的量較少，在通過硅膠柱色譜分離時只獲得以正纈氨酸為連接臂的Ⅲb和Ⅲc兩種異構(gòu)體，以其他氨基酸為連接臂的β構(gòu)型產(chǎn)物很遺憾都未通過分離獲得，僅獲得了它們的α構(gòu)型產(chǎn)物。

3. 2 化合物的表征

在目標化合物Ⅲa ~ Ⅲi 和Ⅳ的1H NMR 中，δH7. 63 ~ 7. 29 處的多重峰為苯環(huán)上的H 和兩個CONH 上的H 信號，δH6. 38 附近的單峰為鬼臼毒素亞甲二氧基（-OCH2O-）信號，δH5. 12附近的單峰為Z-Gly-Pro-OH 中芐基結(jié)構(gòu)的-CH2-信號，δH3. 81和δH3. 75 為鬼臼毒素結(jié)構(gòu)中的3 個-OCH3信號。在目標化合物Ⅲa ~ Ⅲi 和Ⅳ的13C NMR 中，δC173. 6，173. 3，170. 8，168. 5，156. 3等附近的C信號為目標化合物的多個C==O 信號，δC101. 6 附近的C 信號為亞甲二氧基，δC60. 8、56. 2 附近的C 信號為3個-OCH3。

為進一步確定目標化合物的C4位置的構(gòu)型，本研究使用400 MHz 核磁共振儀采集了鬼臼毒素的1H NMR 數(shù)據(jù)，再通過對比文獻［13］的鬼臼毒素數(shù)據(jù)，確定鬼臼毒素δH4. 63 具有7. 1 Hz 的H 信號為鬼臼毒素C4-H 信號。隨后，對比鬼臼毒素與化合物Ⅲb、Ⅲc 的核磁數(shù)據(jù)可確認化合物Ⅲb 在δH4. 61 的H 信號與化合物Ⅲc 在δH4. 55 的H 信號為C4-H 的信號，再對比它們的耦合常數(shù)大小，化合物Ⅲb 在δH4. 61 信號的耦合常數(shù)為4. 4 Hz，化合物Ⅲc 在δH4. 55 信號的耦合常數(shù)為6. 9 Hz。由此可見，化合物Ⅲc的耦合常數(shù)與鬼臼毒素C4-H信號的耦合常數(shù)更接近。因此，確認化合物Ⅲc為C-4β構(gòu)型產(chǎn)物，而化合物Ⅲb為C-4α構(gòu)型產(chǎn)物。并且根據(jù)化合物Ⅲb、Ⅲc在經(jīng)過硅膠柱色譜分離后的質(zhì)量，二者的比例約為5∶1。采用相同方式，化合物Ⅲa、Ⅲd ~ Ⅲi、Ⅳ在δH4. 60 附近H 信號的耦合常數(shù)均在4. 5 Hz 左右，故判斷化合物Ⅲa、Ⅲd ~ Ⅲi、Ⅳ為C-4α構(gòu)型產(chǎn)物。

3. 3 抗腫瘤活性及構(gòu)效關(guān)系

由表1結(jié)果可知，目標化合物Ⅲa ~ Ⅲi和Ⅳ對HepG2、THP-1、HeLa、MCF-7 腫瘤細胞株都有不同程度的抑制作用，且大部分目標化合物對4 種腫瘤細胞的抑制作用優(yōu)于依托泊苷。其中，化合物Ⅲa ~ Ⅲc、Ⅲe ~ Ⅲi、Ⅳ對HepG2 細胞的抑制作用強于依托泊苷，并且化合物Ⅲa和Ⅳ對HepG2細胞的抑制作用還強于鬼臼毒素。所有目標化合物對THP-1 細胞的抑制作用均強于依托泊苷，并且化合物Ⅲa、Ⅲd、Ⅲe、Ⅲi、Ⅳ對THP-1 細胞的抑制作用還強于鬼臼毒素?；衔铫骯 ~ Ⅲe、Ⅲi、Ⅳ對HeLa 細胞的抑制作用強于依托泊苷和鬼臼毒素?；衔铫骯、Ⅲb、Ⅲi、Ⅳ對MCF-7 細胞的抑制作用強于依托泊苷和鬼臼毒素?；衔铫骽 對HepG2、THP-1、HeLa 細胞的作用優(yōu)于依托泊苷，但不及鬼臼毒素。在這些目標化合物中，化合物Ⅲa 對HepG2 細胞的抑制作用最強，IC50為0. 58 nmol/L，對THP-1、HeLa、MCF-7 細胞的作用強度也約為依托泊苷的167、206和23倍。

Table 1 Anti-tumor activity of compounds Ⅲa-Ⅲi and Ⅳ(±s,n = 3 )

Table 1 Anti-tumor activity of compounds Ⅲa-Ⅲi and Ⅳ(±s,n = 3 )

Compd.ⅢaⅢbⅢcⅢdⅢeⅢfⅢgⅢhⅢiⅣPodophyllotoxin Etoposide IC50/(μmol/L)HepG2 0.58 × 10-3 ± 0.46 1.14 ± 0.37 2.43 ± 0.94＞40 1.69 ± 0.76 6.84 ± 0.72 2.22 ± 0.86 12.89 ± 1.59 1.29 ± 0.89 0.11 ± 0.62 0.79 ± 1.39 17.75 ± 0.68 THP-1 0.10 ± 1.82 2.69 ± 0.43 2.34 ± 1.03 0.41 ± 0.78 0.41 ± 2.28 12.12 ± 1.32 1.36 ± 1.19 4.56 ± 0.48 0.56 ± 1.60 0.25 ± 0.79 0.95 ± 0.95 16.76 ± 1.33 HeLa 0.57 ± 0.57 3.89 ± 0.47 3.17 ± 1.02＞40 3.02 ± 0.44＞40＞40＞40 3.68 ± 1.32 6.08 ± 0.53＞40＞40 MCF-7 1.42 ± 1.03 3.79 ± 0.29 8.38 ± 0.89 13.32 ± 1.17 7.15 ± 0.92＞40 28.15 ± 1.21＞40 5.38 ± 0.85 2.57 ± 1.05 6.26 ± 1.13 32.88 ± 1.05

初步構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)作為連接臂的氨基酸具有更小空間體積時，目標產(chǎn)物對HepG2、THP-1、HeLa、MCF-7 細胞具有更好的抑制作用。隨著氨基酸空間結(jié)構(gòu)增大，形成的目標產(chǎn)物對4種細胞的抑制作用多有減弱趨勢，如化合物Ⅲd、Ⅲf、Ⅲg、Ⅲh 等，尤其是化合物Ⅲf 和Ⅲg，對HeLa細胞的抑制作用相比化合物Ⅲa 大大降低。鬼臼毒素與Z-Gly-Pro-OH 通過酯化反應(yīng)直接得到的化合物Ⅳ，對HepG2、THP-1、HeLa、MCF-7 細胞顯示出良好的活性，也進一步體現(xiàn)了連接臂所占空間較小時有利于發(fā)揮抗腫瘤作用。

鑒于Z-Gly-Pro-OH 能激活FAPα 酶，為進一步探索合成衍生物與FAPα 酶是否具有相互作用，采用分子對接模擬分析了化合物Ⅲa與FAPα酶的結(jié)合作用（路線2），發(fā)現(xiàn)化合物Ⅲa 與FAPα 酶的Tyr458（A）、Ala459（A）、Arg402（A）、Thr297（A）、Leu296（A）、Trp298（A）殘基能形成氫鍵，其氫鍵長度分別為3. 22、3. 74 ?、3. 52 ?、2. 88 ?、3. 20 ?、3. 72 ?、3. 33 ?、3. 77 ?、3. 09 ?；化合物Ⅲa 與FAPα 酶的與Asp457（A）、Pro216（A）、Trp214（A）、Trp213（A）、Phe357（A）、Pro355（A）、Val403（A）、Val356（A）、Val299（A）具有疏水作用。從這些結(jié)合位點可看出，鬼臼毒素和Z-Gly-Pro-OH 結(jié)構(gòu)均可與FAPα 酶產(chǎn)生結(jié)合位點，偶聯(lián)的氨基酸結(jié)構(gòu)幾乎沒有產(chǎn)生結(jié)合位點，這也揭示鬼臼毒素和Z-Gly-Pro-OH 進行拼接合成時，連接臂結(jié)構(gòu)過大可能不利于目標分子作用于FAPα 酶發(fā)揮抗腫瘤作用。而本研究合成的新型衍生物是否通過作用于FAPα 酶從而發(fā)揮抗腫瘤作用，F(xiàn)APα 酶在本文研究的細胞株中是否也具有高表達，均將通過后期研究進行驗證。如合成化合物對FAPα 低表達細胞都具有顯著抑制作用，則可為研究人員提供新的研究出發(fā)點。

Scheme 2 Molecular docking of compound Ⅲa and FAPα enzyme

4 結(jié) 論

以天然來源化合物鬼臼毒素為原料，結(jié)合前期虛擬篩選結(jié)果，首次合成了10 個新型的鬼臼毒素衍生物，體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明，大部分目標化合物對HepG2、THP-1、HeLa、MCF-7 腫瘤細胞的抑制作用優(yōu)于依托泊苷和鬼臼毒素，尤以化合物Ⅲa對HepG2細胞的抑制作用最為顯著，值得進一步深入研究。