彭瑞 張磊 王鵬 趙麗 王曄 牟曉峰

[摘要] 目的 ?通過TCGA數(shù)據(jù)庫對肺腺癌（LUAD）病人相關(guān)測序資料進(jìn)行分析，探討與LUAD預(yù)后相關(guān)的長鏈非編碼RNA（LncRNAs）。方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載LUAD的基因表達(dá)資料及臨床信息，使用edge R包進(jìn)行差異分析，Survival包行預(yù)后分析，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）包構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，尋找與生存顯著相關(guān)的基因模塊，ClusterProfiler包對目標(biāo)模塊的mRNA進(jìn)行基因本體論（GO）注釋和KEGG富集分析。結(jié)果 共篩選得到15 473個差異表達(dá)基因（DEGs），進(jìn)一步篩選得到187個差異表達(dá)的LncRNAs（DELncRNAs），其中80個DELncRNAs表達(dá)上調(diào)，107個DELncRNAs表達(dá)下調(diào)。將DELncRNAs納入Cox危險比例回歸模型進(jìn)行分析，得到影響LUAD病人預(yù)后的15個LncRNAs。Kaplan Meier分析驗(yàn)證顯示，Cox分析結(jié)果中低風(fēng)險的LUAD病人較高風(fēng)險者擁有更長的生存期。通過WGCNA生成40個模塊，其中violet模塊與生存相關(guān)性最高（r=0.680，P<0.05）;violet模塊中的LncRNAs與預(yù)后相關(guān)的DELncRNAs取交集，通過篩選得到LINC00982。對violet模塊的mRNA進(jìn)行富集分析后顯示，LINC00982在血管生成、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、淋巴免疫等有關(guān)的生物學(xué)過程（BP）中顯著富集，在核染色體等有關(guān)的細(xì)胞成分（CC）中占比增加，與嘧菌酯域結(jié)合等有關(guān)的分子功能（MF）有關(guān)，主要參與IL-17、PD-L1等相關(guān)的信號通路。Pearson分析顯示，PRDM16表達(dá)水平隨LINC00982表達(dá)上調(diào)而升高（r=0.897，P<0.001），可能為LINC00982的靶基因。結(jié)論 LINC00982可能為預(yù)測LUAD病人預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，通過靶控PRDM16參與LUAD的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌;長鏈非編碼RNA;癌癥基因組圖譜;預(yù)后

[中圖分類號] R730.261

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）01-0079-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.016

肺癌為死亡率最高的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升[1]。其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌病例的80%左右，錯過早期診治的病人普遍生存時間不超過18個月。尋找一種新型分子診斷靶點(diǎn)對于改善非小細(xì)胞肺癌病人的整體生存至關(guān)重要[2]。非小細(xì)胞肺癌常見亞型肺腺癌（LUAD）與肺鱗癌（LUSC）基因表達(dá)并不一致，探尋LUAD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵基因，對抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有重要意義[3]。長鏈非編碼RNA（LncRNAs）是指超過200個核苷酸的非編碼RNA，其可以調(diào)節(jié)許多生理和病理相關(guān)的細(xì)胞功能[4]。越來越多的研究結(jié)果顯示，LncRNAs異常表達(dá)與癌癥類型相關(guān)，這些異常表達(dá)的LncRNAs通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、存活來影響細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5]。許多研究都將LncRNAs與非小細(xì)胞肺癌的病理特征聯(lián)系起來，認(rèn)為其可作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌病人整體生存的生物學(xué)標(biāo)志物[4]。癌癥基因組圖譜（TCGA）包含人類33種不同癌癥的臨床病理數(shù)據(jù)和多平臺的分子圖譜，為癌癥病理機(jī)制的研究和分子靶點(diǎn)的開發(fā)提供了有力支持[6]。本文研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD的LncRNAs表達(dá)譜構(gòu)建Cox危險比例回歸模型，并行生存分析，使用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，識別與病人預(yù)后相關(guān)的模塊，富集分析注釋模塊基因的功能，探尋LUAD中的關(guān)鍵基因，為揭示LUAD的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)集和差異表達(dá)基因（DEGs）分析

從TCGA下載LUAD的基因表達(dá)資料，時間截止到2020年6月。該數(shù)據(jù)集包括585例測序資料，篩選出其中臨床資料完整的59例正常樣本和513例腫瘤樣本。使用 edge R包對腫瘤樣本與正常樣本中的基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，篩選條件為log2 Fold Change絕對值>1，P<0.05。

1.2 生存分析

整合LUAD病人的臨床信息，通過Survival包使用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行Kaplan Meier分析。另構(gòu)建Cox風(fēng)險比例回歸模型，并行PH檢驗(yàn)，報告風(fēng)險比（HR）和95%置信區(qū)間（95%CI），比較差異表達(dá)的LncRNAs（DELncRNAs）與LUAD病人生存之間的聯(lián)系。使用ggplot2包對風(fēng)險回歸模型和生存分析進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.3 WGCNA構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

對TCGA中LUAD樣本基因表達(dá)量的平均值進(jìn)行大小排序，挑選513例腫瘤樣本中基因表達(dá)量最高的15例樣本，使用WGCNA包構(gòu)建共表達(dá)模塊，軟閾值功率設(shè)置為30，對樣本進(jìn)行聚類分析，分析模塊與性狀之間的關(guān)系，尋找與生存顯著相關(guān)的基因模塊，分析基因顯著性。提取該模塊中的基因，將其與預(yù)后模型中得到的LncRNAs取交集，篩選出與預(yù)后相關(guān)的模塊基因。

1.4 富集分析

使用ClusterProfiler包對目標(biāo)模塊的mRNA進(jìn)行富集以了解模塊對應(yīng)的生物學(xué)功能，進(jìn)行基因本體論（GO）注釋和KEGG富集分析，使用ggplot2包繪制GO二級分類氣泡圖及KEGG氣泡圖，使用GDCRNAtools包計算mRNA與目標(biāo)LncRNAs之間的Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC），以PCC>0.8、P<0.05作為LncRNAs靶基因的篩選條件。

2 結(jié) 果

2.1 LUAD和正常樣本中的DEGs

本文59例正常樣本和513例LUAD樣本共篩選得到15 473個DEGs，進(jìn)一步篩選得到80個上調(diào)的DELncRNAs，107個表達(dá)下調(diào)的DELncRNAs（圖1A），對相應(yīng)DELncRNAs進(jìn)行聚類分析，繪制熱圖（圖1B）。其中最顯著的前10個表達(dá)上調(diào)及下調(diào)DELncRNAs見表1、2。

2.2 與生存及預(yù)后相關(guān)的基因

基于DELncRNAs表達(dá)矩陣構(gòu)建預(yù)后相關(guān)的預(yù)測模型，并進(jìn)行多因素Cox風(fēng)險比例回歸模型分析，根據(jù)P<0.05篩選得到影響LUAD病人預(yù)后的15個LncRNAs（圖2），多因素Cox風(fēng)險比例回歸模型PH檢驗(yàn)結(jié)果見表3。對高表達(dá)及低表達(dá)的LncRNAs分別進(jìn)行Kaplan Meier分析并繪制生存曲線，其中與預(yù)后最相關(guān)的6個LncRNAs的生存曲線見圖3。由圖3可見，高表達(dá)LINC00982、COLCA1、LINC01852、PWAR6、AL365361.1的LUAD病人較其低表達(dá)病人生存期長，TMPO-AS1高表達(dá)的LUAD病人預(yù)后較差。

2.3 共表達(dá)模塊及與預(yù)后相關(guān)的模塊基因

對15個表達(dá)量最高的腫瘤樣本進(jìn)行全基因分析，通過動態(tài)剪切樹算法對樣本的全基因組初步識別并分割，將具有相似表達(dá)譜的基因聚集于同一模塊中，得到40個模塊，每個顏色代表1個模塊（圖4A），對樣本再次進(jìn)行層次聚類分析以明確是否有離群異常值（圖4B）。通過對樣本臨床信息和模塊進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)2個模塊與生存狀態(tài)顯著相關(guān)（圖4C），其中violet模塊相關(guān)程度最高（r=0.680，P<0.01），其生存相關(guān)基因與violet模塊核心基因之間具有較高的相關(guān)性（圖4D）。violet模塊中僅有兩個LncRNAs（LINC00982和AL161785.1）與圖2中重疊，其中LINC00982生存分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此將LINC00982作為目標(biāo)基因進(jìn)行后續(xù)分析。

2.4 關(guān)鍵模塊基因的功能分析

結(jié)果表明，violet模塊中66個mRNA在血管生成、藥物反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、淋巴免疫等有關(guān)的生物學(xué)過程（BP）中顯著富集，在核染色體、高爾基體等有關(guān)的細(xì)胞成分（CC）中占比增加，與嘧菌酯域結(jié)合、二氧酶活性等有關(guān)的分子功能（MF）有關(guān)，見表4和圖5。KEGG通路分析結(jié)果顯示，這些基因主要參與IL-17、PD-L1、小細(xì)胞肺癌、HIF-1等相關(guān)的信號通路。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，PRDM16表達(dá)與LINC00982表達(dá)之間相關(guān)性最高，兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.897，P<0.001）。因此，將PRDM16作為LINC00982的靶基因。見圖6。

3 討 論

本文研究首先對TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD病人572例的測序資料進(jìn)行差異分析，共篩選出187個DELncRNAs，并根據(jù)病人的臨床信息構(gòu)建出15個LncRNAs的預(yù)測模型，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，這些模型DELncRNAs風(fēng)險評分較高時往往伴隨著較短的生存時間。LINC00982、COLCA1、LINC01852、PWAR6、AL365361.1低表達(dá)以及TMPO-AS1高表達(dá)是LUAD病人的獨(dú)立預(yù)后因素，有望成為評估病人預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

在差異表達(dá)分析之外，WGCNA已經(jīng)被確立為一種獨(dú)立有效的數(shù)據(jù)挖掘方法，可以用來尋找高度相關(guān)的分子集群和模塊，并識別模塊中的樞紐基因，目前已經(jīng)被應(yīng)用于多項肺癌的研究中[7-8]。本文通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD病人中15個表達(dá)量最高的腫瘤樣本進(jìn)行WGCNA，共獲得40個共表達(dá)模塊，其中violet模塊與生存狀態(tài)相關(guān)程度最高;進(jìn)一步將violet模塊中的基因與影響病人預(yù)后的LncRNAs取交集，通過篩選得到了LINC009822和AL161785.1，其中LINC009822具有更好的預(yù)后預(yù)測價值，因此本文研究主要探討了LINC00982在LUAD中的預(yù)后意義。

本文研究篩選出violet模塊mRNA并進(jìn)行富集分析，GO注釋結(jié)果顯示這些mRNA與血管生成的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)有關(guān)，也在IL-6以及淋巴系統(tǒng)免疫等炎癥相關(guān)的BP中富集。OGAWA等[9]研究顯示，IL-6可能成為肺癌新的治療靶點(diǎn)，聯(lián)合應(yīng)用抗IL-6抗體能夠增強(qiáng)順鉑靶向作用肺癌組織的敏感性，提高肺癌病人的生存率。此外，本文KEGG通路分析顯示，violet模塊mRNA主要參與IL-17、PD-L1、小細(xì)胞肺癌、HIF-1等相關(guān)的信號通路。另有研究結(jié)果顯示，PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，PD-L1介導(dǎo)T細(xì)胞對靶細(xì)胞的生物效應(yīng)[10]。阻斷PD-L1信號通路能增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而識別腫瘤特異性抗原，對多種腫瘤均有效;并且其毒副作用明顯低于其他免疫療法。目前，美國食品和藥物管理局（FDA）已經(jīng)批準(zhǔn)將抗PD-L1藥物用于非小細(xì)胞肺癌以及黑色素瘤的治療中[11-12]。而IL-17作為腫瘤免疫中雙向調(diào)節(jié)因子，一方面能夠促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤消退;另一方面，IL-17可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管生成和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散。有研究表明，肺癌病人肺泡灌洗液中的IL-17表達(dá)與調(diào)節(jié)T細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[13]。推測LINC00982在LUAD病人中可能通過調(diào)控IL-6、IL-17或PD-L1的表達(dá)，為腫瘤的抗免疫治療提供新的分子靶點(diǎn)。

本文最后應(yīng)用Pearson相關(guān)分析LINC009822與violet模塊中mRNA表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PRDM16的表達(dá)與LINC00982的表達(dá)呈正相關(guān)，PRDM16可能為LINC00982的靶基因。L等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，LUAD病人LINC00982和PRDM16表達(dá)和拷貝數(shù)的變異較低，而甲基化程度則較高，LINC00982和PRDM16基因低表達(dá)的LUAD病人預(yù)后不良，并且該研究在LUAD細(xì)胞株中進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示LINC00982和PRDM16表達(dá)下調(diào)。本文研究結(jié)果與其一致。另有研究指出，PRDM16在LUAD中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與LUAD的主要臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān);體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRDM16可以通過抑制LUAD上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）的調(diào)節(jié)因子MUC4的轉(zhuǎn)錄，從而抑制癌細(xì)胞的EMT。因此，PRDM16可能成為LUAD的一個轉(zhuǎn)移抑制因子和潛在的治療靶點(diǎn)[15]。

綜上所述，LINC00982低表達(dá)是LUAD病人的預(yù)后相關(guān)危險因素，LINC00982可能通過調(diào)控PRDM16參與LUAD的發(fā)生發(fā)展。LINC00982可能成為LUAD預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)志物。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

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