劉麗娟，姜向陽，劉慧慧，黃會，宮向紅，何金霞，劉小靜，王瑋云，張秀珍

山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室，煙臺 264006

撲草凈(prometryn)化學名稱為4,6-雙異丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，分子式為C10H19N5S，是一種高效低毒的內(nèi)吸型除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要用于防除一年生禾本科及闊葉草[1]。美國、巴西和加拿大等分別將撲草凈作為除草劑或殺蟲劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；不過為避免撲草凈對環(huán)境、人類和動物造成潛在的健康風險，歐盟自2004年起禁止其作為農(nóng)藥銷售和使用[2]；在我國，撲草凈不僅在農(nóng)業(yè)中廣泛應用于防除雜草，還在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于清除大型藻類[3]，但由于其在魚體內(nèi)代謝情況不明，無法對食品安全性進行評價，2010年水產(chǎn)用撲草凈粉被列入中華人民共和國農(nóng)業(yè)部《獸藥試行標準廢止目錄》(公告第1435號)[4]。

撲草凈在20 ℃水中溶解度為33 mg·L-1，屬于低水溶性，不易滲入土層下面，并且其化學性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期長，難降解，容易隨著降水、淋溶和徑流的作用由土壤遷移入水體[5]，撲草凈殘留在國內(nèi)外海洋環(huán)境中常有檢出[6-10]。2012年以來，日本在從中國進口的海水貝類中多次檢出撲草凈殘留超過基準值(0.01 mg·kg-1)[11-12]。我國7個省份多種養(yǎng)殖水產(chǎn)品中檢出撲草凈[13]，水環(huán)境中撲草凈殘留對水生生物的影響受到廣泛關(guān)注。謝劍等[14]和王田田等[15]先后研究了撲草凈對不同海洋生物的急性毒性；田秀慧等[16]、劉麗娟等[17]和張望等[18]研究發(fā)現(xiàn)，刺參、菲律賓蛤仔和文蛤均對養(yǎng)殖海水中的撲草凈有一定富集效應；Stará等[19-20]和黃會等[21]研究發(fā)現(xiàn)，水體中的撲草凈對鯉魚、克氏原螯蝦和四角蛤蜊抗氧化酶活性產(chǎn)生影響。但在mRNA水平上的研究不足，迄今為止尚未見撲草凈對水生生物的基因表達影響研究。

本文以我國沿海重要海水灘涂養(yǎng)殖貝類四角蛤蜊(Mactraveneriformis)為實驗對象，根據(jù)項目組2018年對黃河口海域除草劑污染調(diào)查結(jié)果，海水中撲草凈平均檢出濃度為0.24 μg·L-1，最高檢出濃度1.09 μg·L-1，設(shè)計3個實驗濃度0.2、1.0和10.0 μg·L-1并開展脅迫試驗，經(jīng)篩選以肌動蛋白β-Actin基因作為參比基因[22-23]，研究了不同濃度撲草凈脅迫下，四角蛤蜊6個解毒相關(guān)基因：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)、細胞色素P450第四亞族(cytochrome P450, CYP4)和金屬硫蛋白(metallothionein, MT)基因表達隨時間變化的規(guī)律，首次從mRNA水平揭示了撲草凈對水生生物的生理影響，探討了其致毒機理，以期為海洋生態(tài)環(huán)境保護提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

四角蛤蜊取自東營市黃河口灘涂貝類養(yǎng)殖區(qū)，體質(zhì)量(8.38±0.51) g，殼長(4.10±0.38) cm。小新月菱形藻藻種來自山東省海洋資源與環(huán)境研究院藻種室。養(yǎng)殖用海水取自煙臺近海，鹽度30±1，pH 7.9～8.1，經(jīng)砂濾后使用。

撲草凈標準品(純度>98.0%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) (Takara)；dNTP Mix (Takara)；RNase Inhibitor (BBI)；TRIzol (Invitrogen)；實驗用引物均由華大基因合成；實驗用水均為滅菌一級水。

1.2 方法1.2.1 撲草凈脅迫實驗

撲草凈脅迫實驗參考劉麗娟等[17]的方法。選擇健康、完整的四角蛤蜊，經(jīng)新鮮海水清洗干凈后，在實驗條件下暫養(yǎng)7 d，連續(xù)充氣，每天定時換海水1次、投喂實驗室培養(yǎng)的小新月菱形藻藻液4次，及時清除死亡及狀態(tài)不佳個體。

依據(jù)本項目組2018年4月、7月和10月開展的黃河口貝類增養(yǎng)殖區(qū)海水中除草劑污染特征調(diào)查結(jié)果，海水中撲草凈平均檢出濃度為0.24 μg·L-1，最高檢出濃度1.09 μg·L-1，設(shè)計撲草凈脅迫濃度為0.2、1.0和10.0 μg·L-1。實驗設(shè)置3個實驗組和1個對照組，每組3個平行水箱，每個實驗水箱內(nèi)注入新鮮海水100 L，實驗組加入撲草凈儲備液至質(zhì)量濃度為0.2、1.0和10.0 μg·L-1，對照組僅加相同體積的助溶劑乙醇，各放入經(jīng)暫養(yǎng)的健康四角蛤蜊100 只，實驗水溫(15±1) ℃。采用半靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法，每24 h換一半相同撲草凈質(zhì)量濃度的海水。

1.2.2 取樣與cDNA制備

分別在脅迫實驗開始6、24、48、96、144、240、360和504 h取樣，每次從每個實驗平行水箱內(nèi)隨機取四角蛤蜊3只，放于冰盤上解剖，從每只貝取等量消化腺、鰓絲組織，按組織分別放入標記清楚的2.0 mL凍存管中混勻密封，液氮冷凍，-80 ℃保存。

保存的樣品用冷凍研磨儀液氮研磨成粉末，取適量用Trizol法提取總RNA，核酸測定儀測定總RNA濃度，選擇A260/A280>1.8且A260/A230>1.8的樣品，按照M-MLV Reverse Transcriptase使用說明進行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10倍，保存于-20 ℃作為qPCR模板備用。

1.2.3 引物設(shè)計與篩選

實驗所用引物均為自行設(shè)計，由華大基因合成。參考鮑相渤等[23]和曹滕飛等[24]對海洋貝類內(nèi)參基因研究方法，選擇β-肌動蛋白(beta-Actin,β-Actin)、甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、β-微管蛋白(beta-tublin,β-Tub)、轉(zhuǎn)錄延伸因子1α(elongation factor 1α, EF1α)、親環(huán)素A(cyclophilin A, CPA)、泛素蛋白(ubiquitin protein, UQP)和18S核糖體RNA(18S rRNA) 7種基因作為備選管家基因。按照本項目組對四角蛤蜊消化腺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，用Primer Premier 6.0軟件分別設(shè)計7種基因的特異性引物。以對照組、1.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1撲草凈脅迫48 h的四角蛤蜊消化腺、鰓樣品cDNA稀釋50倍，分別作為模板進行qPCR檢測，用geNorm軟件進行參比基因篩選[23]。選擇20≤Ct值≤30的基因進行穩(wěn)定性排序，消化腺中各基因穩(wěn)定性β-Tub=β-Actin>GAPDH>UQP>18SrRNA，鰓中各基因穩(wěn)定性β-Actin=18SrRNA>GAPDH>β-Tub，因此選擇β-Actin作為本實驗的參比基因。

CAT基因克隆參考常悅[25]的方法，從NCBI蛋白庫中搜索CAT的雙殼軟體動物的蛋白核苷酸序列，用j-CODEHOP設(shè)計兼并引物，用兼并引物對四角蛤蜊cDNA進行PCR擴增、產(chǎn)物純化、克隆、測序、產(chǎn)物測序、BLAST比對，獲得四角蛤蜊CAT基因序列。從NCBI Genbank中搜索獲得四角蛤蜊β-Actin、SOD、CYP4、GSH-Px、MT和GST等6個基因mRNA的cDNA序列，用Primer Premier 6.0軟件分別設(shè)計特異性引物。

選擇qPCR熔解曲線峰值單一、Ct值≤30的引物，進行擴增效率測定。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)4倍梯度稀釋，共設(shè)5個系列濃度，測定每種基因的引物擴增效率，篩選R2≥0.99、擴增效率為90%～110%的引物，用于后續(xù)qPCR研究。相關(guān)引物如表1所示。

表1 四角蛤蜊解毒相關(guān)基因的熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for qPCR analysis of genes related to detoxification

1.2.4 指標測定

以β-Actin為參比基因，采用2-△△ct法進行qPCR相對定量。每個樣品設(shè)3個重復，20 μL反應體系包括：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA模板2 μL、ddH2O 7.2 μL。qPCR反應條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性15 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s(采集熒光信號)，共計40個循環(huán)。擴增完成后根據(jù)擴增曲線情況人工調(diào)節(jié)基線閾值，分析每個樣品、基因的相對表達量(relative quantity, RQ)值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均以3個平行組數(shù)據(jù)的平均值表示。用SPSS 20.0軟件進行單因素方差(ANOWA)分析和Duncan’s多重比較，分析數(shù)值的差異顯著性。以脅迫時間為橫坐標，參考欒偉[26]的方法稍加改動，以目的基因相對表達量的對數(shù)值log2(RQ)為縱坐標，用WPS office軟件分析作圖。其中0.2 μg·L-1撲草凈脅迫504 h和1.0 μg·L-1撲草凈脅迫240 h的四角蛤蜊消化腺樣品總RNA質(zhì)量不符合要求，未進行后續(xù)qPCR測定分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 撲草凈對四角蛤蜊SOD基因表達的影響

由圖1可知，四角蛤蜊消化腺中，撲草凈脅迫6 h、24 h時3個實驗組SOD表達量均顯著上調(diào)(P<0.01)，且1.0 μg·L-1組表達量高于其他2組；48 h及以后各實驗組均以下調(diào)為主，總體呈波動變化趨勢并逐漸接近對照組。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組均在6 h時上調(diào)量最高，表達量分別達對照組的7.4倍、24.6倍和14.1倍；最大下調(diào)量分別為對照組的0.160倍(48 h)、0.340倍(96 h)和0.019倍(48 h)。

圖1 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織SOD mRNA相對含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達量下調(diào)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 1 Relative quantity of SOD mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Data (0 μg·L-1)=0, data>0 indicates increased expression level, and data<0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), and **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，脅迫6 h時3個實驗組四角蛤蜊SOD表達量均有所上調(diào)，但僅有10.0 μg·L-1組上調(diào)顯著(P<0.01)，表達量為對照組的4.9倍；24 h時1.0 μg·L-1組上調(diào)顯著，表達量為對照組的3.3倍，其他2組下調(diào)；48 h及以后各實驗組均以下調(diào)為主，總體呈波動變化趨勢并逐漸接近對照組。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值分別為對照組的0.150倍(24 h)、0.043倍(96 h)、0.10倍(48 h)。

2.2 撲草凈對四角蛤蜊CAT基因表達的影響

由圖2可知，撲草凈脅迫下，四角蛤蜊消化腺CAT表達量總體呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的變化規(guī)律，其中，6 h、24 h時3個實驗組CAT基因表達量均顯著上調(diào)(P<0.01)，且1.0 μg·L-1組表達量高于其他2組；48 h及以后各實驗組均以下調(diào)為主且呈波動變化。撲草凈脅迫6 h時，0.2、1.0和10.0 μg·L-1組CAT基因表達量均上調(diào)至最大值，分別達對照組的29.1倍、48.0倍和20.2倍；下調(diào)最大值分別為對照組的0.13倍(48 h)、0.12倍(504 h)和0.004倍(48 h)。

圖2 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織CAT mRNA相對含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達量下調(diào)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 2 Relative quantity of CAT mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，0.2 μg·L-1組CAT基因表達量顯著上調(diào)(P<0.01)，1.0 μg·L-1組有所下調(diào)但與對照組差異不明顯、10.0 μg·L-1組顯著上調(diào)；24 h時，0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組CAT基因表達量有所下調(diào)但與對照組差異不明顯，1.0 μg·L-1組顯著上調(diào)(P<0.01)；隨著脅迫時間的延長，各實驗組CAT基因表達量不斷上下波動，0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值均出現(xiàn)在504 h，分別為對照組的112.1倍、151.9倍和112.2倍，下調(diào)最大值分別為對照組的0.091倍(48 h)、0.074倍(144 h)和0.061倍(48 h)。

2.3 撲草凈對四角蛤蜊GSH-Px基因表達的影響

由圖3可知，撲草凈脅迫下，四角蛤蜊消化腺GSH-Px表達量總體呈現(xiàn)先上調(diào)后上調(diào)的變化規(guī)律，其中，6 h、24 h時3個實驗組GSH-Px基因表達量均顯著上調(diào)(P<0.01)，之后以下調(diào)為主。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對照組的4.0倍(6 h)、5.0倍(24 h)和4.3倍(24 h)；下調(diào)最大值均低于對照組的0.001倍(144、360和504 h)。

圖3 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織GSH-Px mRNA相對含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達量下調(diào)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 3 Relative quantity of GSH-Px mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，0.2 μg·L-1組GSH-Px基因表達量顯著上調(diào)(P<0.01)，1.0 μg·L-1和10.0 μg·L-1組有所上調(diào)但與對照組差異不明顯；24 h時，0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組均顯著上調(diào)，1.0 μg·L-1組GSH-Px基因表達量不明顯下調(diào)；隨著脅迫時間的延長，各實驗組GSH-Px基因表達量不斷上下波動，0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對照組的22.4倍(360 h)、6.4倍(240 h)和207.3倍(504 h)；下調(diào)最大值分別為對照組的0.008倍(504 h)、0.02倍(504 h)和0.01倍(48 h)。

2.4 撲草凈對四角蛤蜊GST基因表達的影響

由圖4可知，消化腺中，撲草凈脅迫6 h，3個實驗組GST基因表達均上調(diào)，且上調(diào)量隨著撲草凈濃度的升高而下降，GST基因相對表達量(RQ)與脅迫濃度(ρ)呈顯著相關(guān)關(guān)系：ρ=86.688RQ5.445(R2=0.9616)。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對照組的3.155倍(6 h)、2.241倍(360 h)和2.143倍(240 h)；下調(diào)最大值分別為對照組的0.053倍(48 h)、0.461倍(48 h)和0.036倍(360 h)。

圖4 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織GST mRNA相對含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達量下調(diào)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 4 Relative quantity of GST mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，3個實驗組GST基因表達均上調(diào)，且上調(diào)量隨著撲草凈濃度的升高而下降，GST基因RQ值與脅迫濃度(ρ)呈顯著相關(guān)關(guān)系：ρ=146.53RQ4.262(R2=0.9963)。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對照組的4.605倍(6 h)、3.459倍(24 h)和1.856倍(6 h)；下調(diào)最大值分別為對照組的0.463倍(96 h)、0.195倍(144 h)和0.308倍(96 h)。

四角蛤蜊GST基因表達調(diào)控與撲草凈脅迫濃度相關(guān)：脅迫6 h消化腺和鰓的GST相對表達量與脅迫濃度呈顯著相關(guān)關(guān)系；且在撲草凈脅迫24、96和360 h，消化腺GST基因表達均表現(xiàn)為0.2 μg·L-1促進、10.0 μg·L-1抑制；撲草凈脅迫24、360和504 h，鰓的GST基因表達均表現(xiàn)為1.0 μg·L-1促進，10.0 μg·L-1抑制，有低濃度促進、高濃度抑制現(xiàn)象。因此認為四角蛤蜊GST基因有作為撲草凈污染分子標記的潛質(zhì)。

2.5 撲草凈對四角蛤蜊CYP4基因表達的影響

由圖5可知，3個實驗組中，四角蛤蜊消化腺和鰓組織CYP4基因表達量均顯著下調(diào)至一個低值(P<0.01)，然后逐步上升，升高到一定程度后逐漸下降，然后又上升，總體呈現(xiàn)反復波動變化趨勢。

圖5 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織CYP4 mRNA相對含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達量下調(diào)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 5 Relative quantity of CYP4 mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

消化腺中，撲草凈脅迫6 h時3個實驗組CYP4基因表達量均顯著下調(diào)(P<0.01)，且1.0 μg·L-1組表達量低于其他2組；0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值分別為0.303倍(6 h)、0.042倍(504 h)和0.034倍(504 h)；上調(diào)最大值分別為對照組的3.078倍(240 h)、2.102倍(96 h)和4.896倍(48 h)。

鰓中，脅迫6 h時3個實驗組CYP4基因表達量均顯著下調(diào)(P<0.01)，其中1.0 μg·L-1組表達量高于其他2組；0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值均出現(xiàn)在504 h，分別為0.038倍、0.164倍和0.017倍；上調(diào)最大值分別為對照組的7.282倍(24 h)、3.720倍(144 h)和7.220倍(24 h)。

2.6 撲草凈對四角蛤蜊MT基因表達的影響

由圖6可知，撲草凈脅迫6 h，3個實驗組四角蛤蜊消化腺中MT基因表達量均上調(diào)，其中1.0 μg·L-1組表達量顯著上調(diào)且達到最大值(P<0.01)，為對照組的3.292倍。0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組在整個實驗過程中上調(diào)均不顯著。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值分別為對照組的0.267倍(144 h)、0.413倍(504 h)和0.084倍(48 h)。

圖6 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織MT mRNA相對含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達量下調(diào)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 6 Relative quantity of MT mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，MT基因表達均無顯著變化；24 h，1.0 μg·L-1組表達量顯著上調(diào)(P<0.01)，而0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組顯著下調(diào)(P<0.01)。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值均出現(xiàn)在504 h，分別為對照組的12.764倍、9.569倍和6.104倍；下調(diào)最大值分別為對照組的0.430倍(24 h)、0.436倍(144 h)和0.322倍(24 h)。

3 討論(Discussion)

3.1 四角蛤蜊應對撲草凈脅迫解毒代謝相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)分析

細胞色素P450(cytochrome P450, CYP)酶系是一個超基因家族，參與多種親脂外源物和內(nèi)源物質(zhì)在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化與代謝過程，在解毒和激活食物鏈中的鹵代、非鹵代烴中起著重要的作用[27]。CYP4是CYP家族中的一個重要亞族。有研究表明，持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)進入生物體細胞內(nèi)后，其中一部分與受體蛋白結(jié)合進入細胞核內(nèi)，介導Ⅰ相代謝酶基因如CYP4基因的表達，將污染物轉(zhuǎn)化為更具極性的代謝中間產(chǎn)物，誘導Ⅱ相代謝酶基因如GST-pi的表達，加速代謝物排出體外[28]。GST催化外源化合物分子或經(jīng)第Ⅰ相反應的代謝產(chǎn)物以及氧化應激引起親脂性過氧化損傷化合物與還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)的巰基(—SH)結(jié)合，保護生物大分子免受侵襲[29]。與多

氯聯(lián)苯(PCB)對翡翠貽貝CYP4基因表達具有顯著的誘導作用不同[30]，在撲草凈脅迫實驗過程中，最初四角蛤蜊消化腺和鰓組織中CYP4基因相對表達量呈現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.01)，而后其表達量反復上下波動變化?？赡苁怯捎谖廴疚锊煌瑢λ慕歉蝌跜YP基因家族中不同亞族的基因表達影響不同所致，具體規(guī)律需開展進一步研究。脅迫實驗開始后，四角蛤蜊消化腺和鰓組織GST基因表達均先上調(diào)，而后呈現(xiàn)以下調(diào)為主的波動變化趨勢，相同實驗組不同組織中表達量變化不完全同步，但均顯示GST有作為撲草凈對四角蛤蜊污染的生物標志物的潛力。

許多外源性化學物質(zhì)是通過誘導機體產(chǎn)生大量活性氧，從而誘發(fā)其多種損傷。生物體的抗氧化防御系統(tǒng)在消除活性氧、降低機體損傷方面發(fā)揮著重要作用。撲草凈脅迫24 h，四角蛤蜊消化腺中3種重要的抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px基因表達均被顯著誘導(P<0.01)，而同時檢測的SOD、CAT酶活性無顯著變化，GSH-Px酶活性被顯著誘導[20]，顯示生物體中的基因表達調(diào)控與酶活性調(diào)控不同步，二者沒有明確的對應關(guān)系。0.2 μg·L-1和1.0 μg·L-1撲草凈脅迫下，四角蛤蜊的消化腺組織中SOD基因表達量最高分別達對照組的7.4倍和24.6倍，而SOD酶活性誘導率最高為29.0%和34.9%[20]，基因表達水平的變化程度比酶活性變化顯著，可見與蛋白水平相比，基因的表達水平是更為靈敏的污染物暴露作用的生物標記物[31]。SOD、CAT、GSH-Px和MT是抗氧化防御系統(tǒng)的重要成員，其中SOD可催化超氧陰離子與氫離子反應生成過氧化氫，從而解除活性氧對機體的損傷[32]；CAT催化H2O2分解為H2O與O2，在減輕活性氧自由基對機體細胞的氧化損傷方面起著重要作用[33]；GSH-Px可清除機體內(nèi)的H2O2及脂類氫過氧化物，防止細胞膜和其他生物組織免受過氧化損傷[34]；MT是一類分子量較小的富含巰基和半胱氨酸的蛋白質(zhì)，對多種重金屬具高親和性，在體內(nèi)具有顯著和廣譜的抗氧化作用效果。撲草凈脅迫實驗中，四角蛤蜊消化腺呈現(xiàn)SOD、CAT、GSH-Px和MT基因表達均先上調(diào)，而后呈現(xiàn)以下調(diào)為主的波動變化趨勢；鰓中，SOD、GSH-Px基因表達均先上調(diào)，1.0 μg·L-1組的CAT基因表達先下調(diào)其他組先上調(diào)，MT基因表達先上調(diào)其他組先下調(diào)，而后反復波動變化。因此推斷撲草凈脅迫使四角蛤蜊體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，誘導了抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)基因表達，這是生物體適應環(huán)境變化的一種應急性解毒措施。隨著撲草凈脅迫時間的延長，四角蛤蜊不同組織中抗氧化防御系統(tǒng)的部分基因表達受到不同程度的抑制，可能導致機體抗氧化能力下降，引起機體對環(huán)境中其他威脅的防御能力下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，相同實驗時間不同濃度撲草凈脅迫下，四角蛤蜊相同組織的同一基因表達調(diào)節(jié)趨勢不盡相同，分析認為由于生物體解毒代謝是一個動態(tài)調(diào)節(jié)的過程，基因表達調(diào)節(jié)與底物種類、濃度、脅迫時間和代謝產(chǎn)物濃度等因素密切相關(guān)，該結(jié)果與菲律賓蛤仔對撲草凈的生物富集規(guī)律研究結(jié)果一致[17]。撲草凈脅迫504 h，3個實驗組四角蛤蜊鰓組織的CAT、GSH-Px、CYP4和MT基因，和消化腺組織的CAT、GSH-Px和CYP4基因相對表達量與對照組相比均出現(xiàn)顯著變化(P<0.01)。黃會等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在0.2、1.0和10.0 μg·L-1撲草凈脅迫下15 d和21 d時，四角蛤蜊鰓組織形態(tài)與對照組相比均發(fā)生不同程度變化，且時間-效應和濃度-效應明顯。因此認為，長時間撲草凈脅迫超出四角蛤蜊抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)能力，導致其組織結(jié)構(gòu)損傷，從而引起部分組織的基因表達調(diào)控異常。

3.2 以貝類解毒基因作為撲草凈污染生物標記物在近岸海域研究中應用的可行性

研究發(fā)現(xiàn)，四角蛤蜊的基因表達調(diào)控對撲草凈脅迫十分敏感，即使在最低脅迫濃度0.2 μg·L-1，所測6種解毒有關(guān)基因表達量均在短時間內(nèi)發(fā)生變化。徐雄等[35]調(diào)查了我國8個重點流域水體農(nóng)藥污染情況，撲草凈的檢出率達59.3%，濃度范圍ND～104.2 ng·L-1；張望等[36]對海州灣沿岸水體調(diào)查結(jié)果顯示，撲草凈檢出率80%，濃度最大值31.9 ng·L-1；喬丹[37]調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳山灣、東營河口區(qū)和東營廣饒縣海域海水中撲草凈最高值分別為342、538和196 ng·L-1；鄭磊等[38]調(diào)查南四湖流域撲草凈在地表水中廣泛存在，濃度介于0～667.7 ng·L-1之間，且推導撲草凈水環(huán)境基準值為82.4 ng·L-1。本項目組在黃河口貝類增養(yǎng)殖區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，海水中撲草凈檢出率為100%，平均檢出濃度0.24 μg·L-1，最高檢出濃度1.09 μg·L-1?？梢娢覈逗Ｓ驌洳輧魵埩魪V泛存在，山東近岸多個監(jiān)測點撲草凈質(zhì)量濃度遠高于水環(huán)境基準值，且足以對四角蛤蜊基因表達產(chǎn)生影響，證明以雙殼貝類解毒代謝相關(guān)基因作為撲草凈污染生物標記物，在近岸海域研究中的應用具有可行性。本研究填補了在mRNA水平上撲草凈對海洋生物影響研究的空白，為評價撲草凈殘留對海洋生態(tài)環(huán)境安全風險提供了參考依據(jù)。