王發(fā)英，吳查青，劉 敏，陳張金，余華麗，王偉影

(麗水市質(zhì)量檢驗檢測研究院，浙江 麗水 323000)

麝香壯骨膏是由白芷、蒼術(shù)、當歸等藥材提取而制成浸膏、再取薄荷腦、水楊酸甲酯、冰片、鹽酸苯海拉明與樟腦等八味藥物組成的一種外用橡膠膏劑，具有鎮(zhèn)痛、消炎的功效，臨床上用于風濕痛、關(guān)節(jié)痛、腰痛、神經(jīng)痛、肌肉酸痛、扭傷和挫傷?，F(xiàn)行標準有《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十一冊[1]和國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準WS3-B-2268-96-2[2](僅河南某藥企生產(chǎn)的樣品執(zhí)行此標準)，前者僅有基本的性狀鑒別和貼膏劑相關(guān)檢查項；后者增加了樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯氣相色譜鑒別，鹽酸苯海拉明薄層鑒別，樟腦、水楊酸甲酯、鹽酸苯海拉明的含量測定和烏頭堿限量的薄層檢查。項目組采用TLC對方中白芷、當歸和蒼術(shù)進行定性鑒別；采用GC對樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯的含量進行測定；采用HPLC對鹽酸苯海拉明的含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent7890B氣相色譜儀；H-Class Waters超高效液相色譜儀；XS105DU、XS104電子天平，瑞士梅特勒公司；Memmert UNE400自然對流烘箱，德國Memmert公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀。

1.2 試 劑

當歸對照藥材(批號：120927-201516)，中國食品藥品檢定研究院；蒼術(shù)素對照品(批號：120932-201407)，中國食品藥品檢定研究院；白芷對照藥材(批號：120945-201510)，中國食品藥品檢定研究院；歐前胡素對照品(批號：110826-200712)，中國食品藥品檢定研究院；樟腦對照品(批號：110747-201409)，中國食品藥品檢定研究院；薄荷腦對照品(批號：110728-200506)，中國食品藥品檢定研究院；冰片對照品(批號：110743 -200905)，中國食品藥品檢定研究院；水楊酸甲酯對照品(批號：110707-201112)，中國食品藥品檢定研究院；萘對照品(批號：111673-200803)，中國食品藥品檢定研究院；鹽酸苯海拉明對照品(批號：100066-200807)，中國食品藥品檢定研究院；乙酸乙酯(色譜純)，上海展云化工有限公司；甲醇(色譜純)，默克；其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

麝香壯骨膏，市場隨機購入20批次，涉及20家生產(chǎn)企業(yè)，生產(chǎn)單位所在省市包括浙江、安徽、江西、海南、吉林、桂林、江蘇、重慶、河南、湖北、湖南、山東等地，具有一定的地域差異性，樣品具有良好代表性。樣品信息見表1。

表1 麝香壯骨膏基本信息Table 1 Information of Shexiang Zhuanggu Plaster

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC色譜鑒別

2.1.1 當歸

取本品2片，除去蓋襯，剪成小塊，加甲醇50 mL水浴回流提取1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取當歸對照藥材1 g，加甲醇20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按處方比例制備缺當歸藥材的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備作為陰性對照溶液。依據(jù)薄層色譜法試驗[3]，分別吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，以石油醚(30～60 ℃)-乙醚-甲酸(5:1:0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點、陰性對照無干擾，典型色譜圖見圖1。

圖1 麝香壯骨膏中當歸的TLC鑒別Fig.1 TLC of Angelica sinensis radix in Shexiang Zhuanggu Plaster

2.1.2 蒼術(shù)

取“2.1.1”項下的供試品溶液作為供試品溶液。取蒼術(shù)素對照品適量，用甲醇制備成每1mL含對照品1 mg的溶液作為對照品溶液。按處方比例制備缺蒼術(shù)藥材的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備作為陰性對照溶液。依據(jù)薄層色譜法試驗[3]，分別吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點、陰性對照無干擾，典型色譜圖見圖2。

圖2 麝香壯骨膏中蒼術(shù)的TLC鑒別Fig.2 TLC of Atractylodes rhizoma in Shexiang Zhuanggu Plaster

2.1.3 白芷

取“2.1.1”項下的供試品溶液作為供試品溶液。取歐前胡素對照品適量，用甲醇制備成每1mL含對照品0.5 mg的溶液作為對照品溶液。另取白芷對照藥材1 g，加甲醇20 mL超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按處方比例制備缺白芷藥材的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備作為陰性對照溶液。依據(jù)薄層色譜法試驗[3]，分別吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯(3:1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點、陰性對照無干擾，典型色譜圖見圖3。

圖3 麝香壯骨膏中白芷的TLC鑒別Fig.3 TLC of Angelica dahuricae radixin Shexiang Zhuanggu Plaster

2.2 含量測定

2.2.1 鹽酸苯海拉明

按現(xiàn)行法定標準檢驗[2]，結(jié)果見表2。

2.2.2 樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯[2,4-6]

2.2.2.1 色譜條件

色譜柱：phenomen ZB-WAX毛細管柱，0～250 ℃(250 ℃):60 m×320 μm×0.5 μm；檢測器：FID；進樣口溫度：220 ℃；檢測器溫度：250 ℃；柱溫：150 ℃，維持23 min；流速： 1.5 mL·min-1；進樣量：2 μL；分流比：15:1。

2.2.2.2 內(nèi)標溶液的制備

取萘適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1 mL含5.000 mg的溶液。作為內(nèi)標溶液。

2.2.2.3 混合對照品貯備液的配制

精密稱取樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯對照品適量,加乙酸乙酯溶解，配制成每1 mL含各對照品分別為5.2850 mg，5.4750 mg，5.2750 mg， 6.2000 mg的混合液，搖勻，作為混合對照品貯備液。

2.2.2.4 供試品溶液的配制

取本品175 cm2，除去蓋襯，剪成條狀，置250 mL燒瓶中，加水100 mL，照揮發(fā)油測定法，自測定器上端加水充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加甲苯2 mL，加熱回流3小時，放冷，將揮發(fā)油測定器中的液體轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取有機溶劑層，置預先精密加入5 mL內(nèi)標溶液的25 mL量瓶中，以適量乙酸乙酯分次洗滌冷凝管、揮發(fā)油測定器及分液漏斗，洗滌液并入上述量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2.5 系統(tǒng)適用性實驗

精密量取混合對照品貯備液與內(nèi)標溶液適量，加乙酸乙酯稀釋至一定的濃度，分別精密吸取上述溶液與供試品溶液，按“2.3.2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖 4。由圖4可見，在該色譜條件下，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯、萘與其他成分可達到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均在50000以上，具有良好的分離效果。

圖4 麝香壯骨膏GC色譜圖Fig.4 GC of Shexiang Zhuanggu Plaster

1 樟腦；2 薄荷腦；3 冰片(異龍腦)；4 冰片(龍腦)；5 萘；6 水楊酸甲酯

2.2.2.6 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，各精密加入內(nèi)標溶液2 mL，乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，按“2.3.2.1”項下色譜條件進樣，以各峰面積與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標(Y)，待測物濃度為橫坐標(X，mg/mL)進行線性回歸，得樟腦回歸方程為Y=0.729 7X+0.0199，r=0.9999，薄荷腦回歸方程為Y=0.7005X+0.0459， r=0.9998，冰片回歸方程為Y=0.7516X+0.0041，r=0.9999，水楊酸甲酯回歸方程為Y=0.4627X-0.0021，r=0.9998。結(jié)果表明：在樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯分別在0.261～4.172 mg/mL、0.274～4.380 mg/mL、0.258～4.136 mg/mL、0.309～4.944 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.7 精密度試驗

取同一份對照品溶液，按“2.3.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算各峰面積與內(nèi)標峰面積之比，結(jié)果其平均值依次為樟腦0.7934(RSD=0.12%，n=6)、薄荷腦0.8173(RSD=0.09%，n=6)、冰片0.7854(RSD=0.13%，n=6)、水楊酸甲酯0.5777(RSD=0.13%，n=6)，結(jié)果顯示精密度良好。

2.2.2.8 重復性試驗

取同一廠家同一批號的麝香壯骨膏6份，按“2.3.2.4”項下供試品溶液制備方法制備并進樣測定，計算各峰面積與內(nèi)標峰面積之比，結(jié)果其平均值依次為樟腦1.0619(RSD=0.97%，n=6)、薄荷腦1.7216(RSD=0.67%，n=6)、冰片1.2838(RSD=0.74%，n=6)、水楊酸甲酯0.5686(RSD=1.10%，n=6)。

2.2.2.9 穩(wěn)定性試驗

取同一麝香壯骨膏供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，進樣6次，記錄峰面積，計算各峰面積與內(nèi)標峰面積之比，結(jié)果其平均值依次為樟腦1.0572(RSD=1.14%，n=6)、薄荷腦1.7148(RSD=0.60%，n=6)、冰片1.2829(RSD=0.86%，n=6)、水楊酸甲酯0.5746(RSD=0.63%，n=6)，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.10 回收率試驗

取已知含量的麝香壯骨膏(編號14)，共6份，各取本品90 cm2，除去蓋襯，剪成條狀，置250 mL燒瓶中，濃度為樟腦8.943 mg/mL、薄荷腦12.98 mg/mL、冰片10.85 mg/mL、水楊酸甲酯9.168 mg/mL的混合對照品溶液1 mL，按“2.3.2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.2.1”項下色譜條件測定，計算樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的含量，計算回收率，結(jié)果其回收率平均值依次為樟腦97.12%(RSD=1.37%，n=6)、薄荷腦97.02%(RSD=1.35%，n=6)、冰片96.89%(RSD=1.24%，n=6)、水楊酸甲酯96.45%(RSD=1.46%，n=6)。

2.2.2.11 樣品含量測定

取不同編號的麝香壯骨膏，平行2份，按“2.3.2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.2.1”項下色譜條件測定，計算樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的含量，結(jié)果見表2。

表2 麝香壯骨膏中鹽酸苯海拉明、樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的測定結(jié)果(n=2)Table 2 Results of diphenhydramine hydrochloride, camphor, menthol, borneol and methyl salicylate(n=2)

續(xù)表2

3 討 論

3.1 TLC定性鑒別

中國藥典收載的蒼術(shù)品種為茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)，現(xiàn)市場上存在關(guān)蒼術(shù)冒充蒼術(shù)的情況，蒼術(shù)中都含蒼術(shù)素和蒼術(shù)酮，關(guān)蒼術(shù)中蒼術(shù)素含量極少甚至有的樣品未檢出，蒼術(shù)酮含量明顯高于蒼術(shù)[7-9]。在蒼術(shù)的薄層色譜中，20批樣品有14批蒼術(shù)素斑點明顯，6批樣品色譜圖中在與蒼術(shù)素對照品色譜相應的位置上，未見相同顏色的斑點。針對上述情況，項目組做了加大點樣量(10 μL)，并和關(guān)蒼術(shù)樣品進行了比對，在加大點樣量后4批樣品色譜圖中在與蒼術(shù)素對照品色譜相應的位置上任未見相同顏色的斑點，其中2批樣品出現(xiàn)與關(guān)蒼術(shù)一致的斑點，這兩家生產(chǎn)廠家可能投料的蒼術(shù)為偽品蒼術(shù)(關(guān)蒼術(shù))。4批斑點顏色較淺則與投料的蒼術(shù)飲片質(zhì)量、投料的量及生產(chǎn)工藝有一定的關(guān)系。

在白芷的薄層鑒別中，1批樣品在與歐前胡素對照品相應的位置上未見相同的黃色斑點，其余19批樣品均符合要求。在19批樣品，其中2批樣品斑點較淺，并且有1批樣品斑點與其他廠家有明顯的不同。說明各廠家在投料的規(guī)范性、原料藥質(zhì)量、生產(chǎn)工藝上有明顯的差別。

3.2 揮發(fā)性成分(樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯)的含量測定

麝香壯骨膏中的揮發(fā)油類成分為其主要有效成分，其主要鎮(zhèn)痛消炎成分為樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯，本試驗建立了同時測定麝香壯骨膏中該4種有效成分含量的方法。20批樣品每100 cm2含樟腦為7.44～30.71 mg，平均值為16.58 mg，最大值與最小值相差4倍多；含薄荷腦為4.33～49.28 mg，平均值為26.34 mg，最大值與最小值相差11倍多；含冰片為9.09～33.34 mg，平均值為19.31 mg，最大值與最小值相差3倍多；含水楊酸甲酯為6.22～25.60 mg，平均值為15.25 mg，最大值與最小值相差4倍多。

從樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯這4種揮發(fā)性成分含量測定結(jié)果可以看出，不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品差別甚大，質(zhì)量參差不齊。企業(yè)如果采用溶劑法生產(chǎn)橡膠膏劑，工藝中由于要加熱，許多揮發(fā)性藥物就會隨溶媒一起蒸發(fā)而損失掉。因此其成分含量較低的企業(yè)要控制好投料的量，重點要改善其生產(chǎn)工藝，減少揮發(fā)性成分在生產(chǎn)過程中的損失[10,11]。項目組認為有必要對麝香壯骨膏種該4種揮發(fā)性成分進行質(zhì)控，以提高該產(chǎn)品的質(zhì)量，確保不同生產(chǎn)企業(yè)之間產(chǎn)品的均一性、穩(wěn)定性。建議樟腦和水楊酸甲酯的含量限度采用現(xiàn)行法定標準中的規(guī)定(每100 cm2含樟腦限度為不少于12.0 mg、含水楊酸甲酯限度為不少于9.0 mg)[2]；從標準中可以看出，樟腦和水楊酸甲酯的含量限度值約為投料的40%，參照此標準，建議每100 cm2含冰片限度為不少于12.0 mg和含薄荷腦限度為不少于 16.0 mg。按照此標準，20批樣品中樟腦含量低于12.0 mg的有5批，水楊酸甲酯含量低于9.0 mg的有2批，冰片含量低于12.0 mg的有2批，薄荷腦含量低于16.0 mg的有4批。

3.3 鹽酸苯海拉明的含量測定

麝香壯骨膏處方中含有的鹽酸苯海拉明可緩解患者在使用過程中出現(xiàn)的過敏癥狀。20批樣品每100 cm2含鹽酸苯海拉明為0.13～10.11 mg，平均值為5.11 mg，最大值與最小值相差77倍。

鹽酸苯海拉明含量測定結(jié)果表明不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品中鹽酸苯海拉明含量差別極大，質(zhì)量情況堪憂；個別生產(chǎn)企業(yè)鹽酸苯海拉明的含量與處方量極不匹配，鹽酸苯海拉明在光、濕、熱和酸堿條件下，容易氧化降解生成二苯酮等物質(zhì)，所以企業(yè)在控制其投入的量，也要防止鹽酸苯海拉明在生產(chǎn)過程中被破壞[12]。建議鹽酸苯海拉明的含量限度采用現(xiàn)行標準中的規(guī)定(每100 cm2含鹽酸苯海拉明限度為4.8～7.4 mg)[2]。按照此標準，20批樣品中有3批超出限度上限7.4 mg、8批低于限度下限4.8 mg。

4 結(jié) 論

麝香壯骨膏現(xiàn)行主要執(zhí)行的檢驗標準過于簡單，無法滿足日常檢驗的要求，更不能控制麝香壯骨膏的質(zhì)量。項目組對麝香壯骨膏中的當歸、白芷、蒼術(shù)進行定性鑒別，對鹽酸苯海拉明、樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯進行含量測定，可以更加科學、合理的控制麝香壯骨膏的整體質(zhì)量。