符樹宇，黃雄高，胡衛(wèi)文，唐吉森，陳又珍，劉 亮

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病性微血管病變中最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，而DR患者視力障礙最主要的原因則是糖尿病性黃斑水腫(DME)[1]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已被證實(shí)在DME的發(fā)病過程中起著重要作用，玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物治療DME已廣泛應(yīng)用于臨床。有報(bào)道顯示玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物會(huì)引起視網(wǎng)膜動(dòng)脈或靜脈收縮、黃斑中心凹無血管區(qū)擴(kuò)大等情況[2]，提示抗VEGF藥物可能會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血加重。目前對(duì)于抗VEGF藥物是否會(huì)引起視網(wǎng)膜缺血加重仍未有統(tǒng)一的觀點(diǎn)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)使用抗VEGF藥物后視網(wǎng)膜微循環(huán)變化與房水因子的改變相關(guān)[3]。血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)作為缺血性視網(wǎng)膜病變的相關(guān)生物標(biāo)記物，可從細(xì)胞因子層面來預(yù)測(cè)抗VEGF藥物治療DME對(duì)視網(wǎng)膜微循環(huán)的影響[4]。本研究旨在探討康柏西普治療DME對(duì)視網(wǎng)膜微循環(huán)的影響。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象前瞻性對(duì)照研究。收集2019-12/2020-12就診于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科并診斷為DME的患者14例15眼，其中符合篩選條件的10例11眼納入本研究為DME組，其中男2例，女8例，年齡中位數(shù)為56(42～73)歲，右眼7眼，左眼4眼，治療期間所有DME患者糖化血紅蛋白均控制在10%以內(nèi)[治療前,治療后3、5mo平均糖化血紅蛋白分別為(8.23±0.966)%、(8.04±0.769)%、(7.91±0.511)%]。選取無全身系統(tǒng)疾病和眼底疾病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者15例15眼作為白內(nèi)障組，其中男5例，女10例，年齡中位數(shù)為56(53～62)歲，右眼5眼，左眼10眼。選取年齡性別相匹配的正常視力健康人20例20眼作為對(duì)照組，其中年齡中位數(shù)為47(42～49)歲，其中男8例，女12例。DME組與白內(nèi)障組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.667)；DME組與對(duì)照組年齡比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。糖尿病患者發(fā)生DME年齡都偏大，而年齡較大的健康人群，因其伴有年齡相關(guān)性白內(nèi)障或其他眼部疾病以及全身系統(tǒng)疾病，其最佳矯正視力(BCVA)很難達(dá)到1.0，因此我們隨機(jī)選取了年齡相對(duì)匹配且視力正常的健康人群作為對(duì)照組，本研究主要觀測(cè)DME患者注射康柏西普后眼部各項(xiàng)指標(biāo)變化，對(duì)照組一般資料的差異并不影響研究結(jié)果。DME組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)18歲以上的2型糖尿病患者；(2)經(jīng)熒光素眼底血管造影確診為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR)；(3)OCT檢測(cè)黃斑中心凹視網(wǎng)膜厚度(CMT)≥250μm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除DME外引起視力下降的其他視網(wǎng)膜疾病；(2)前6mo內(nèi)的視網(wǎng)膜治療或內(nèi)眼外科手術(shù)史；(3)眼壓≥25mmHg；(4)屈光不正，近視>6.00D或遠(yuǎn)視>3.00D；(5)嚴(yán)重的屈光介質(zhì)不清和其他需要住院的系統(tǒng)性疾??；(6)未完成6次注射而中途終止的患者。白內(nèi)障組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者，且需行手術(shù)治療；(2)無任何其他眼部疾病；(3)無高血壓、糖尿病等全身慢性疾??；(4)無手術(shù)史。需收集房水的患者均于術(shù)前告知患者，并簽署相關(guān)知情同意書后，再于術(shù)中收集房水樣本。本研究通過海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2方法

1.2.1一般檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)照組、DME組術(shù)前和術(shù)后隨訪均由我院同一名具有經(jīng)驗(yàn)的眼科技師行眼科Snellen表視力、非接觸式眼壓、綜合驗(yàn)光、眼底照相檢查。

1.2.2OCT及OCTA檢查應(yīng)用Cirrus HD OCT 5000光學(xué)相干斷層掃描儀選擇520線×128線黃斑掃描模式，對(duì)黃斑中心凹進(jìn)行掃描，選取B掃描成像清晰的圖片，由軟件自動(dòng)計(jì)算出CMT;選取黃斑區(qū)的6mm×6mm毛細(xì)血管掃描模式，獲取黃斑區(qū)6mm×6mm范圍的毛細(xì)血管圖像。選取內(nèi)界膜至視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層外界作為視網(wǎng)膜淺層進(jìn)行測(cè)量，視網(wǎng)膜淺層毛細(xì)血管中心凹無血管灌注區(qū)(FAZ)面積由同一名眼科醫(yī)師應(yīng)用Cirrus HD 5000 V.10.0 Angio Plex Metrix軟件測(cè)量，人工描繪出FAZ邊界，再由軟件自動(dòng)計(jì)算出FAZ面積。視網(wǎng)膜淺層毛細(xì)血管長(zhǎng)度密度(VSCP)和視網(wǎng)膜淺層毛細(xì)血管灌注密度(PSCP)均由同一款軟件自動(dòng)測(cè)量，測(cè)量范圍為以黃斑中心為中點(diǎn)、6mm×6mm的方形區(qū)域。VSCP為通過描繪血管的線性長(zhǎng)度，計(jì)算區(qū)域內(nèi)線性長(zhǎng)度與區(qū)域面積的比值;PSCP為通過描繪血管直徑寬度，計(jì)算血管管徑在區(qū)域內(nèi)的覆蓋面積與區(qū)域面積的比值。

1.2.3房水因子檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞因子的方法：術(shù)中房水收集在無菌管后立即存放在-80℃的實(shí)驗(yàn)用冰箱中，采用Luminex檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒為L(zhǎng)XSAHM-09,經(jīng)過樣品稀釋、混勻、吸附和孵育等步驟，所有步驟均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品送微球懸浮陣列技術(shù)(Luminex200TM)檢測(cè)儀檢測(cè)，自動(dòng)計(jì)算獲得樣品濃度。

1.2.4手術(shù)方法DME組均行每月1次玻璃體腔注射康柏西普眼用注射液共計(jì)6次，術(shù)前使用鹽酸左氧氟沙星滴眼液1d，并于當(dāng)日手術(shù)前沖洗結(jié)膜囊。手術(shù)中用鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉患眼并嚴(yán)格按照內(nèi)眼手術(shù)規(guī)范進(jìn)行消毒鋪巾。在注射康柏西普前,使用1mL注射器針頭于顳側(cè)角膜緣穿刺入前房,抽取房水約0.1mL,撤針后角膜穿刺口自閉。隨后用1mL注射器抽取0.05mL康柏西普于顳上方角膜緣后3.5～4.0mm向玻璃體腔內(nèi)垂直進(jìn)針注藥，完成注射后迅速拔出針頭,用鑷子夾閉穿刺點(diǎn)防止返流。術(shù)后使用抗生素眼膏涂于結(jié)膜囊內(nèi)，并連續(xù)3d使用左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼，每天4次。治療后1mo再次注射,共連續(xù)注射6次。白內(nèi)障組患者均于術(shù)中行透明角膜切口前使用1mL注射器針頭抽取房水約0.1mL。所有操作均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的眼科醫(yī)師完成。

2結(jié)果

2.1術(shù)前DME組與對(duì)照組PSCP、VSCP、FAZ面積的對(duì)比DME組術(shù)前PSCP、VSCP較對(duì)照組小，F(xiàn)AZ面積較對(duì)照組大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1,圖1)。

圖1 DME患者注射康柏西普后黃斑區(qū)視網(wǎng)膜OCTA、OCT圖像 A：術(shù)前；B：注射1mo時(shí)；C：注射2mo時(shí)；D：注射3mo時(shí)；E：注射4mo時(shí)；F：注射5mo時(shí)。

表1 DME組與對(duì)照組術(shù)前BCVA、CMT、VSCP、PSCP、FAZ面積對(duì)比

2.2術(shù)前DME組與對(duì)照組CMT及BCVA的對(duì)比術(shù)前DME組CMT、BCVA值均較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

2.3術(shù)前DME組與白內(nèi)障組相關(guān)房水因子對(duì)比DME組術(shù)前房水中IL-6、IL-8、VEGF、ANGPTL4均較白內(nèi)障組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表2)。

表2 術(shù)前DME組與白內(nèi)障組相關(guān)房水因子濃度對(duì)比 pg/mL

2.4康柏西普治療后DME患者PSCP和VSCP及FAZ面積的變化DME患者注射康柏西普前后不同時(shí)間PSCP比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.562，P<0.05，表3)，注射康柏西普前后不同時(shí)間VSCP、FAZ比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.376、0.084，均P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo時(shí)PSCP與基線，注射康柏西普1mo時(shí)與注射4、5mo時(shí)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035、0.004、0.001、0.001、0.026、0.013)，其余時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3，圖2。DME組患者于注射康柏西普1mo時(shí)PSCP改善最明顯。與基線相比，注射康柏西普5mo時(shí)DME患者黃斑部微循環(huán)缺血改善。

圖2 DME患者注射康柏西普后PSCP、BCVA、CMT的變化 A：PSCP；B:BCVA；C：CMT。

表3 使用康柏西普后DME患者眼部檢查各參數(shù)變化

2.5康柏西普治療后DME患者CMT和BCVA的變化DME患者注射康柏西普前后不同時(shí)間CMT、BCVA比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.935、4.357，均P<0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時(shí)BCVA與基線比較均有改善(P=0.044、0.004、0.001、0.001、0.001)，其余時(shí)間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo時(shí)CMT與基線相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015、0.006、0.003、0.002)，其余時(shí)間點(diǎn)兩兩相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3，圖1、2。注射康柏西普1mo時(shí)BCVA提升以及CMT下降最明顯。與基線相比，注射康柏西普5mo時(shí)視力明顯提高，CMT顯著下降。

2.6康柏西普治療后DME患者房水因子的變化DME患者使用康柏西普后不同時(shí)間房水ANGPTL4、VEGF、IL-6濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，不同時(shí)間房水中IL-8濃度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普3、4、5mo時(shí)房水中ANGPTL4的濃度與基線相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015、0.006、0.003)，其余時(shí)間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時(shí)房水中VEGF的濃度與基線，注射康柏西普3、4、5mo時(shí)與1mo時(shí)相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.047、0.023、0.015)，其余時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時(shí)房水中IL-6濃度與基線相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035、0.001、0.001、0.001、0.001)，其余時(shí)間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DME組患者于注射康柏西普1mo時(shí)房水中ANGPTL4、VEGF及IL-6濃度下降最明顯，見表4。與基線相比，注射康柏西普5mo時(shí) ANGPTL4、VEGF、IL-6下降。

表4 使用康柏西普后DME患者房水因子濃度變化 pg/mL

2.7康柏西普治療后各參數(shù)變化的相關(guān)性分析DME患者每月注射康柏西普1次連續(xù)6mo后VEGF變化的絕對(duì)值與CMT變化的絕對(duì)值呈正相關(guān)(rs=0.716，P=0.013)，表明房水中VEGF濃度越降低，CMT越降低，與其余各參數(shù)的變化絕對(duì)值均無相關(guān)性(P>0.05)。

3討論

本研究結(jié)果顯示，DME組連續(xù)每月1次注射康柏西普6mo后淺層毛細(xì)血管密度逐漸增加，VSCP略有增加及FAZ面積減小的趨勢(shì)，與Zhu等[5]的研究結(jié)果相似，并且DME組患者在第1次注射康柏西普后PSCP改善最明顯，但其改善視網(wǎng)膜缺血的機(jī)制尚未明確。既往研究認(rèn)為持續(xù)高血糖狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，AGEs可引起血管硬化、激活A(yù)GEs內(nèi)皮受體而增加相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，最終導(dǎo)致毛細(xì)血管收縮、視網(wǎng)膜缺血缺氧。視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)下，機(jī)體代償性產(chǎn)生VEGF以恢復(fù)血液供應(yīng)。但玻璃體腔內(nèi)高濃度的VEGF會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞、血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，并在血管內(nèi)募集白細(xì)胞增加其對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致血管堵塞和灌注減少，最終加重視網(wǎng)膜缺血缺氧。有研究顯示使用抗VEGF藥物可以改善DME患者視網(wǎng)膜血管灌注，其機(jī)制可能為抑制VEGF可以減少白細(xì)胞堵塞，使封閉血管再灌注[6-7]。此外，在一項(xiàng)關(guān)于抗VEGF治療腫瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)抑制VEGF可以破壞缺乏外周細(xì)胞的血管，將未成熟的血管重塑為更成熟的血管，并且穩(wěn)定基底膜為新生血管再次生長(zhǎng)提供框架，該機(jī)制可能同樣作用于視網(wǎng)膜內(nèi)[8-9]。

研究顯示ANGPTL4水平與視網(wǎng)膜血流供應(yīng)相關(guān)，其通常表達(dá)于缺血性視網(wǎng)膜病中[10]。ANGPTL4與視網(wǎng)膜血流供應(yīng)相關(guān)的原因在于其不僅促進(jìn)動(dòng)脈硬化，還促進(jìn)血管炎癥并增加其通透性，加重視網(wǎng)膜缺血[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，缺血性視網(wǎng)膜病小鼠模型中，隨著缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在缺氧視網(wǎng)膜Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的積累，ANGPTL4表達(dá)增加，可以作為反映視網(wǎng)膜缺血相關(guān)的生物標(biāo)志物[12]。此外，Kwon等[4]的研究發(fā)現(xiàn)使用抗VEGF藥物可以減少DME患者視網(wǎng)膜血管的丟失，并恢復(fù)無灌注區(qū)血供，通過檢測(cè)房水中ANGPTL4的濃度發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4的濃度與視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積成正相關(guān)，并認(rèn)為ANGPTL4可反映視網(wǎng)膜血液供應(yīng)情況。結(jié)合本研究結(jié)果，注射康柏西普后DME患者房水中ANGPTL4濃度下降，并于注射康柏西普1mo時(shí)下降最顯著，因此本研究結(jié)果從細(xì)胞因子層面證實(shí)注射康柏西普可以改善黃斑部微循環(huán)缺血。

本研究結(jié)果顯示，注射康柏西普后，DME患者BCVA顯著提高，CMT顯著下降，并均于注射康柏西普1mo時(shí)改善最顯著，與Zhou等[13]的研究結(jié)果一致。既往研究已證實(shí)，VEGF是引起DR患者黃斑水腫的重要因子，其作用機(jī)制是高濃度的VEGF破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞及血-視網(wǎng)膜屏障，引起黃斑水腫[1]。康柏西普是我國自主研發(fā)的新型抗VEGF藥物，它是一種重組融合蛋白，含有VEGF受體1(VEGFR1)的第二個(gè)免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域和VEGFR2的第三和第四Ig結(jié)構(gòu)域和人IgG的Fc區(qū)，它可以與VEGF-A、VEGF-B和胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)的所有同工型結(jié)合。理論上它對(duì)VEGF的親和力較單抗類藥物更強(qiáng)[14]。Liu等[15]關(guān)于康柏西普與雷珠單抗治療DME患者療效的研究發(fā)現(xiàn)，兩者對(duì)BCVA都有提升作用，但康柏西普減輕黃斑水腫的效果優(yōu)于雷珠單抗?？赡艿脑蛟谟冢喝诤系鞍最惖目蛋匚髌眨湓诓Ａw腔內(nèi)的半衰期為4.2d，較雷珠單抗的2.88d半衰期更長(zhǎng)，并且其針對(duì)的靶點(diǎn)較單抗類藥物更多。

本研究結(jié)果顯示，隨著注射康柏西普時(shí)間的延長(zhǎng)，DME患者房水中的VEGF、IL-6都顯著下降，與Xia等[16]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)使用康柏西普可以顯著減輕DR患者視網(wǎng)膜病變程度，以及顯著降低IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子水平，證明康柏西普對(duì)這些炎癥因子有抑制作用。其原因可能是DME發(fā)展過程中VEGF和炎癥因子作用途徑大量重疊，VEGF可刺激促炎基因的表達(dá)，并允許白細(xì)胞滲透到視網(wǎng)膜中[17]。值得注意的是注射康柏西普1mo時(shí)，DME患者房水中VEGF、IL-6濃度下降十分顯著，與Zhang等[18]的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)注射康柏西普1wk后患者房水中VEGF濃度開始顯著下降，反映康柏西普對(duì)VEGF有十分強(qiáng)的抑制作用。理論上VEGF作為一種促炎介質(zhì)，抗VEGF治療可以抑制眼內(nèi)炎癥因子水平。

此外，分析本研究中VEGF與CMT變化的絕對(duì)值發(fā)現(xiàn)，VEGF濃度與CMT呈正相關(guān)，與Mastropasqua等[6]的研究結(jié)果一致。側(cè)面證實(shí)了VEGF在DME的發(fā)展過程中至關(guān)重要的作用。

本研究選擇淺層毛細(xì)血管的變化反映黃斑區(qū)視網(wǎng)膜血液供應(yīng)的原因：(1)HD-OCT獲取的淺層毛細(xì)血管密度清晰度最佳；(2)深層毛細(xì)血管的末端會(huì)被腫脹的視網(wǎng)膜遮擋而影響毛細(xì)血管密度的測(cè)算[19]。本研究運(yùn)用PSCP、VSCP進(jìn)行分析，來反映視網(wǎng)膜毛細(xì)血管變化。視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)與毛細(xì)血管的管徑大小、血液的流動(dòng)速度以及血液的氧含量有關(guān)，而在評(píng)價(jià)血液供應(yīng)方面PSCP優(yōu)于VSCP。

本研究從細(xì)胞因子層面證實(shí)了使用康柏西普治療DME可以改善黃斑區(qū)缺血。同時(shí)本研究沒有發(fā)現(xiàn)使用康柏西普治療后加重視網(wǎng)膜缺血等情況,說明使用康柏西普治療從安全角度考慮是可行的。此外，使用康柏西普治療DME能有效提升BCVA及減輕黃斑水腫。但本研究也存在隨訪時(shí)間短、樣本量小，對(duì)遠(yuǎn)期效果未能觀察等不足，在后續(xù)研究中還需進(jìn)行更多關(guān)于康柏西普治療DME相關(guān)的細(xì)胞因子及其作用途徑的研究才能解釋其如何改善視網(wǎng)膜缺血。