孟志尚，吳文一，羅 靜

0引言

內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)是在特定的病理或生理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化或分化，并伴隨表型和功能改變的過(guò)程。具體表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞由鵝卵石樣外形轉(zhuǎn)為長(zhǎng)梭形，失去特異標(biāo)志物如VE-鈣黏蛋白(VE-cadherin)、Tie受體1/2(tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains 1/2, Tie-1/2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1/2(vascular endothelial growth factor receptor 1/2, VEGFR 1/2)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1/CD31(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1/cluster of differentiation 31, PECAM-1/CD31)等，轉(zhuǎn)而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)和成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(fibroblast specific protein-1, FSP-1)等，并獲得較強(qiáng)的增殖和遷移能力[1](圖1)。作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)的特殊形式，該現(xiàn)象最早在心血管系統(tǒng)胚胎發(fā)育中被發(fā)現(xiàn)[2]，亦是機(jī)體損傷修復(fù)的重要機(jī)制[3]。與EMT類(lèi)似，EndoMT廣泛參與腫瘤侵襲及心、肺、腎、眼等器官纖維化疾病等病理過(guò)程[4-5]。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)了EndoMT在眼部疾病中的重要作用，包括角膜病[6]、青光眼[7]、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管性疾病[8-9]等。本文針對(duì)EndoMT的基本生物學(xué)特征、發(fā)生機(jī)制及其在眼部疾病中的相關(guān)研究展開(kāi)綜述。

圖1 EndoMT參與眼病模式圖 眼球插圖基于Servier Medical Art(http://smart.servier.com/)修改，并根據(jù)Creative Common Attribution 3.0許可使用(https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)。

1 EndoMT的基本生物學(xué)特征

胚胎發(fā)育過(guò)程中,EndoMT介導(dǎo)了視網(wǎng)膜血管的發(fā)育[10]。成體中正常表型的內(nèi)皮細(xì)胞是維持機(jī)體正常功能的重要保障。包括腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成的血-腦屏障，眼中虹膜血管內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成的血-房水屏障、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成的血-視網(wǎng)膜屏障等[11]。機(jī)體在創(chuàng)傷、藥物、感染等損傷因素作用下，抗損傷修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)，包括成纖維細(xì)胞激活、大量增殖，細(xì)胞外基質(zhì)合成增多、沉積等[12]。但慢性炎癥等刺激因素可誘發(fā)病理性新生血管形成及成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，造成瘢痕、組織纖維化等不良后果，EndoMT在其中扮演了重要的角色[13]，且其在一定時(shí)間及條件范圍內(nèi)具備可逆性[14]。所以，研究EndoMT的發(fā)生機(jī)制，探究其中的關(guān)鍵分子和涉及的信號(hào)通路，尋求潛在的治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。

2 EndoMT的發(fā)生機(jī)制

EndoMT發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多種分子和通路的交互作用，目前研究多聚焦于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)家族關(guān)鍵分子和通路的作用及相應(yīng)抑制劑的運(yùn)用方面。

TGF-β是誘導(dǎo)EndoMT發(fā)生的關(guān)鍵因子，TGF-β的3種亞型TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均參與EndoMT[15]。其中，TGF-β2被認(rèn)為是最有效的激活劑，TGF-β1和TGF-β3誘導(dǎo)的EndoMT亦需TGF-β2介導(dǎo)，且運(yùn)用siRNA沉默TGF-β2基因表達(dá)可減弱經(jīng)TGF-β1和TGF-β3處理的細(xì)胞中EndoMT標(biāo)志物的表達(dá)[16]。TGF-β/Smad以及非Smad依賴(lài)的非經(jīng)典型途徑均參與EndoMT過(guò)程(圖2)，經(jīng)典Smad途徑中，TGF-β與膜受體結(jié)合活化后，Smad2/Smad3磷酸化，繼而結(jié)合Smad4，在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮調(diào)控EndoMT相關(guān)基因表達(dá)的作用，Smad7是其中重要的負(fù)性調(diào)控因子[17]。多條非Smad依賴(lài)性通路也參與EndoMT的發(fā)生，TGF-β可通過(guò)MAPK家族(包括ERK、JNK、p38 MAPK)、PI3K/Akt/mTOR、Rho/ROCK、Rac、c-Abl、PKC和NF-κB等下游通路參與EndoMT[18]。另外，TGF-β途徑與Wnt、Notch等通路可能存在交互作用，如Notch配體Jagged-1是Wnt/TCF的靶基因[19]。通過(guò)上述途徑，內(nèi)皮特異性基因轉(zhuǎn)錄減少或由EndMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(如Snail、Slug、Twist、Zeb等)介導(dǎo)的間質(zhì)特異性基因轉(zhuǎn)錄增加，作為靶蛋白的內(nèi)皮特異標(biāo)志物表達(dá)相應(yīng)減少,內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，也即產(chǎn)生EndoMT[20]。細(xì)胞因子在EndoMT中也發(fā)揮了直接或間接作用，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-13等可通過(guò)IRAK的介導(dǎo)激活NF-κB而參與EndoMT，IL-13誘導(dǎo)的EndoMT中還涉及了STAT6、AKT分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)等過(guò)程[3]。隨著表觀遺傳學(xué)、多組學(xué)研究等領(lǐng)域的發(fā)展，有關(guān)非編碼RNA在EndoMT中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也逐步被揭開(kāi)[18,21]。

圖2 TGF-β通路參與EndoMT示意圖。

3 EndoMT與眼部疾病

3.1角膜病正常數(shù)量和質(zhì)量的角膜內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)泵機(jī)制，維持角膜透明性。角膜內(nèi)皮損傷較小時(shí)可由附近的正常細(xì)胞遷移修復(fù)，而在內(nèi)眼手術(shù)損傷、角膜基質(zhì)和前房持續(xù)炎癥等因素刺激作用下，EndoMT參與的纖維化及細(xì)胞外基質(zhì)可沉積于角膜內(nèi)皮層與后彈力層之間，形成角膜后膜[22]。在Fuchs角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良、后部多型性角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良、梅毒性角膜基質(zhì)炎患者中均發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表現(xiàn)，如細(xì)胞梭形改變，α-SMA、波形蛋白、FSP-1、I型和Ⅲ型膠原表達(dá)陽(yáng)性等[23-24]，且Zeb1突變與遲發(fā)型Fuchs角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良、后部多型性角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)[25]。人離體角膜細(xì)胞模型中，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可上調(diào)Snail1/2、Zeb1/2而誘導(dǎo)EndoMT，且隨傳代培養(yǎng)程度加重[26]。核p120連環(huán)蛋白可調(diào)節(jié)Rho/ROCK，控制接觸抑制狀態(tài)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)入p120 siRNA可激活p-120連環(huán)蛋白-kaiso信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制EndoMT而不影響正常細(xì)胞增生[6]，運(yùn)用ROCK抑制劑也可有效改善角膜內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間連接及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)[27]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)家族激活Wnt信號(hào)通路，由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體介導(dǎo)，使離體角膜內(nèi)皮表現(xiàn)出間質(zhì)特征，MMP抑制劑可逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程[28]。在轉(zhuǎn)入Smad7基因的大鼠角膜堿燒傷模型中，Smad2被阻斷從而抑制EndoMT，而正常的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程不受影響[22]。上述多維度的研究結(jié)果展現(xiàn)出EndoMT相關(guān)分子作為角膜纖維化疾病治療靶點(diǎn)的廣泛前景，揭示其中精密復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制可能是未來(lái)研究的方向。

嚴(yán)重角膜內(nèi)皮失代償者需角膜移植，Naranjo等[23]研究發(fā)現(xiàn)在一部分后彈力層剝離角膜內(nèi)皮移植(DSAKE)術(shù)后病例中，組織病理切片可見(jiàn)后彈力層與內(nèi)皮層間存在纖維膜樣組織，其中可發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)梭形細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，可能是由角膜內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)EndoMT機(jī)制轉(zhuǎn)化形成成纖維樣細(xì)胞，分泌非正常的細(xì)胞外基質(zhì)形成角膜后膜，造成角膜混濁，嚴(yán)重者最終導(dǎo)致移植失敗。角膜供體不足也是困擾角膜移植領(lǐng)域的難題，研究再生醫(yī)學(xué)工程EndoMT作用的重要性不言而喻，探索EndoMT在離體角膜細(xì)胞培養(yǎng)中的相關(guān)機(jī)制可能是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的潛在突破點(diǎn)。

3.2青光眼小梁網(wǎng)和Schlemm管的病理性纖維化會(huì)使房水流出通道受阻，參與青光眼的病理生理過(guò)程。Ashok等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小梁細(xì)胞的EndoMT參與原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)，正常構(gòu)象的朊病毒蛋白(prion protein, PrPC)是正?；蚓幋a的產(chǎn)物，小梁細(xì)胞和Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的PrPC具有抗氧化及維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡的重要生理功能，其缺失或功能障礙會(huì)激活Rho/ROCK通路，致使小梁細(xì)胞EndoMT,發(fā)生病理性纖維化而增加房水流出阻力。此外，TGF-β2處理體外培養(yǎng)的Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞可出現(xiàn)失去CD31、VE-鈣黏蛋白等標(biāo)志，轉(zhuǎn)而表達(dá)α-SMA、Ⅰ型和Ⅳ型膠原等一系列EndoMT的特征性轉(zhuǎn)變[29]。除EndoMT外，EMT參與了青光眼中濾過(guò)手術(shù)后瘢痕化、視神經(jīng)受損纖維化等病理過(guò)程[3]，展現(xiàn)出其在青光眼發(fā)生及術(shù)后纖維化全過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，為青光眼全程管理提供了新見(jiàn)解。

3.3視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病正常血管的生長(zhǎng)和成熟是一個(gè)多種生長(zhǎng)因子及抑制因子平衡控制，既涉及組織的自然發(fā)育，也涉及新生血管性疾病病理過(guò)程[30-31]。血管新生與纖維增殖是視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病重要的研究方向，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移是其中的重要環(huán)節(jié)，探究其涉及的調(diào)控機(jī)制及潛在治療策略有重要的臨床意義。

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者終末器官損害的眼部表現(xiàn)[32]?？筕EGF治療糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)中可能出現(xiàn)的纖維化加重，增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)中纖維增殖膜等造成牽拉性視網(wǎng)膜脫離，加大手術(shù)難度等都是臨床亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。多項(xiàng)研究表明，EndoMT不但參與了上述纖維化過(guò)程，更貫穿了DR發(fā)生發(fā)展的始終[9,33]。高糖可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndoMT,血管緊張素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ)是參與的介質(zhì)之一[34]。晚期糖基化終末產(chǎn)物也被證實(shí)可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndoMT,AKT2信號(hào)通路是此過(guò)程的關(guān)鍵要素[35]。神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中，血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)自噬-溶酶體途徑吞噬清除受損的髓鞘，誘導(dǎo)炎癥、血管生成和以EndoMT為基礎(chǔ)的纖維修復(fù)等序貫事件，揭示了EndoMT在DR神經(jīng)病變中發(fā)揮的重要作用[36]。在PDR患者的纖維增殖膜中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)EndoMT機(jī)制轉(zhuǎn)化為活化的成纖維細(xì)胞，表達(dá)α-SMA、FSP-1等EndoMT的特異標(biāo)志物[37]，并且已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以發(fā)揮抑制新生血管生成的作用[33]，這一發(fā)現(xiàn)可能為DR的血管新生與纖維化之間的“蹺板”平衡理論提供了新的證據(jù)[38]?，F(xiàn)有一些處于臨床試驗(yàn)中抗DME新生血管的“雙抗”藥物已取得較為滿(mǎn)意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[39]，提示針對(duì)EndoMT相關(guān)的纖維化和抗新生血管形成的聯(lián)合療法，可能是未來(lái)治療DR的合理趨勢(shì)。

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)是致嬰幼兒失明的常見(jiàn)視網(wǎng)膜血管性疾病，其致盲的主要原因是新生血管增生牽拉形成的牽拉性視網(wǎng)膜脫離和(或)異常血管滲漏導(dǎo)致的滲出性視網(wǎng)膜脫離[40]。ROP患兒的抗血管內(nèi)皮生成因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治療目前仍不在該藥常見(jiàn)治療疾病范圍內(nèi)，其安全性、對(duì)正常發(fā)育的影響、加重纖維增殖等仍然是臨床難題。研究發(fā)現(xiàn)，在ROP小鼠模型中，缺血缺氧條件可能促使內(nèi)皮細(xì)胞從現(xiàn)有血管床分離，經(jīng)EndoMT機(jī)制增殖，進(jìn)一步克隆擴(kuò)增，參與病理性新生血管的形成[41]。雖然其具體過(guò)程仍需進(jìn)一步研究，但也為ROP治療提供了切入點(diǎn)。

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是中老年人視力喪失的主要病因[42]。根據(jù)病理特征可分干性和濕性，后者以脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)為主要特征。病患人群中濕性ARMD更多且視力危害更嚴(yán)重[43]。盡管抗VEGF藥物已經(jīng)成為濕性ARMD的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，但存在長(zhǎng)期使用療效降低導(dǎo)致視網(wǎng)膜下纖維化和瘢痕形成及地圖樣萎縮使病情加重等問(wèn)題。脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的EndoMT機(jī)制參與了視網(wǎng)膜下新生血管改建、損傷愈合及纖維病灶的形成[8]。轉(zhuǎn)錄因子Snail1在促進(jìn)包括CNV在內(nèi)的眼部新生血管性疾病早期階段起著重要的作用。RNA-seq結(jié)果分析表明，敲除Snail1基因減少了控制細(xì)胞骨架排列和細(xì)胞外基質(zhì)重塑的基因表達(dá)，行玻璃體腔內(nèi)注射Snail1 siRNA抑制了CNV小鼠模型中新生血管的形成[44]。Rossato等[45]研究發(fā)現(xiàn)，EndoMT還可能是CNV抗VEGF治療耐藥的原因，抗VEGF藥物可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retina endothelial cell, HRECs)發(fā)生EndoMT病理改變，抑制EndoMT后可明顯提高HRECs對(duì)抗VEGF藥物的反應(yīng)，在CNV的小鼠模型中聯(lián)合使用抗VEGF及抗EndoMT藥物可明顯抑制新生血管的形成，為眼科新生血管疾病的研究及聯(lián)合治療提供了新思路。

4結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，EndoMT在人體生理功能和疾病進(jìn)程中都發(fā)揮了重要的作用，相關(guān)靶向治療藥物已在心、肺、腎等器官或系統(tǒng)性纖維化疾病中作為臨床治療選擇。眼部疾病自身承載的視覺(jué)器官具有精準(zhǔn)細(xì)微等特點(diǎn)，需要更科學(xué)更完善的理論和實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)尋找早期可靠的EndoMT相關(guān)生物標(biāo)志物，針對(duì)下游病理性靶標(biāo)精準(zhǔn)治療的同時(shí)，又不影響正常損傷修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路，為基礎(chǔ)研究及臨床工作提供依據(jù)。