劉晨星，陳誠，姚凱勇

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，杭州 310021；2. 杭州申浙家禽有限公司，杭州 311402；3.瀾海生態(tài)農(nóng)業(yè)（杭州）有限公司，杭州 311402；4.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

近些年中國畜禽養(yǎng)殖規(guī)模增長十分迅速，動(dòng)物源食品（奶、肉、蛋等）年產(chǎn)量規(guī)模達(dá)到了1.5億t[1]。養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)張?jiān)斐闪藝鴥?nèi)動(dòng)物飼料的嚴(yán)重短缺，其中蛋白質(zhì)是動(dòng)物飼料營養(yǎng)成分中最重要且缺口最大的成分[2]。目前，國內(nèi)動(dòng)物蛋白類飼料缺口近兩千萬t，而且隨著畜產(chǎn)品消費(fèi)需求的持續(xù)增長，這一缺口會(huì)進(jìn)一步增加[3]。國內(nèi)傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)飼料（如大豆和魚粉等）年產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足養(yǎng)殖業(yè)對(duì)蛋白飼料的需求[4]。為了緩解我國蛋白飼料資源嚴(yán)重匱乏的現(xiàn)狀，亟需挖掘可利用的新飼料資源。

黃酒源于商周，是一種歷史悠久、風(fēng)味獨(dú)特的低度釀造酒。其生產(chǎn)副產(chǎn)物黃酒糟的適口性較好，蛋白質(zhì)含量較高，且價(jià)格較低，是一種重要的蛋白質(zhì)飼料資源[5]。中國黃酒產(chǎn)量規(guī)模已超30億L，同時(shí)產(chǎn)生接近百萬t的剩余黃酒糟[6]。黃酒糟水分含量較高，不及時(shí)處理容易腐敗變質(zhì)。目前國內(nèi)許多酒廠將剩余酒糟脫水干燥處理后打包作為飼料出售[7]，或是直接作為垃圾倒掉。而干燥處理成本高且附加值低，將黃酒糟作為垃圾處理掉不但污染環(huán)境且浪費(fèi)資源。如果能實(shí)現(xiàn)對(duì)黃酒糟的科學(xué)利用，不僅可以節(jié)能減排，還能創(chuàng)造社會(huì)效益[8]。另外，由于鮮黃酒糟纖維含量高、氨基酸組成不均衡，直接飼喂牲畜消化率低，甚至?xí)l(fā)腸道疾病，所以要適當(dāng)處理后再飼喂，才能充分發(fā)揮其營養(yǎng)價(jià)值。目前，微生物發(fā)酵在蛋白飼料生產(chǎn)上已得到廣泛應(yīng)用，微生物自身蛋白含量較高，同時(shí)其豐富的賴氨酸、蛋氨酸等限制氨基酸對(duì)于飼料是很好的營養(yǎng)補(bǔ)充。綜上，研究黃酒糟混菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)其蛋白營養(yǎng)組分產(chǎn)生的變化，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有非常重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵前后的黃酒糟進(jìn)行蛋白營養(yǎng)成分、SDS-PAGE以及雙向蛋白電泳分析，以探究發(fā)酵前后蛋白質(zhì)變化情況。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵菌株

研究所用固態(tài)發(fā)酵菌株為一株產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）JZ-1以及一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JZ-2，均從發(fā)酵飼料中分離得到且有較好的發(fā)酵性能[9]。

1.2 黃酒糟混菌固態(tài)發(fā)酵

JZ-1和JZ-2的活化溫度為30℃，120r/min在恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24h，再在培養(yǎng)液中接種培養(yǎng)24h制成混菌發(fā)酵液。將黃酒糟補(bǔ)水至含水量50%后于121℃高壓蒸汽滅菌30min，出鍋冷卻后再接菌，發(fā)酵液接種量為10%（JZ-1:JZ-2=1:1）。將接種好的黃酒糟鋪在托盤上，用紗布進(jìn)行包裹，然后放入30℃的通風(fēng)恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48h，發(fā)酵期間翻料1次。本試驗(yàn)發(fā)酵條件設(shè)置為預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)發(fā)酵組合[9]。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

將發(fā)酵前、后的黃酒糟置于65℃烘干，分裝在自封袋中置于4℃保存。測定前粉碎，再先后通過2mm和1mm的篩子，保存在4℃條件下用于各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.3.1 常規(guī)成分測定

干物質(zhì)(DM)、有機(jī)物（OM）以及粗蛋白（CP）含量的測定參考美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）在1990年頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法。采用雙縮脲法來測定黃酒糟中的多肽含量[9]。采用自動(dòng)氨基酸分析儀測定氨基酸含量，具體操作過程參考GB/T 18246-2019[10]。

1.3.2 SDS-PAGE試驗(yàn)流程

對(duì)黃酒糟中的蛋白進(jìn)行提取，采用氯醋酸-丙酮沉淀法[11]：在液氮中研磨發(fā)酵樣品，加入提取液后于-20℃過夜，再在4℃、12 000r/min（下同）離心30min后棄上清。加入等體積丙酮冰浴30min，搖勻后同樣條件離心30min，然后真空干燥沉淀后置于-20℃保存。在電泳上樣前先加入裂解液在室溫放置至蛋白充分溶解，然后離心至無沉淀，4℃暫存。將上清液定量至50μg/mL，以1:4比例加入SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后放-80℃?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳采用5%濃縮膠以及12%分離膠，在穩(wěn)流40mA下電泳，待蛋白進(jìn)入分離膠后停止，后設(shè)定穩(wěn)流50mA進(jìn)行電泳至溴酚藍(lán)距離膠底1cm為止。電泳結(jié)束后，置凝膠于考馬斯亮藍(lán)G-250染色液中振蕩過夜，雙蒸水漂洗至背景清晰后采集圖像[12]。

1.3.3 雙向蛋白電泳試驗(yàn)流程

取0.3mg樣品與350μL水化上樣緩沖液（8mol/L尿素，4% CHAPS，100mmol/L DTT，0.5% IPG buffer）混合后離心，吸取清液沿槽邊緣均勻加入樣品。將17cm固相化pH非線性膠加入相應(yīng)聚焦槽進(jìn)行等電聚焦，聚焦程序設(shè)為被動(dòng)水化12h，500V線性1h，1 000V快速1h，8 000V線性8h，最后聚焦500V 4h。將膠條在平衡緩沖液中輕微振蕩12min，而后置于12.5%的SDSPAGE凝膠上，待膠條密封后置于垂直板電泳儀電泳。循環(huán)水浴溫度為12℃，在15mA電流下電泳30min后，用30mA電泳至溴酚藍(lán)距離膠下沿約0.5cm處時(shí)停止電泳。再將凝膠置于混合液（50%甲醇:10%醋酸=1:1）中銀染至少1h。凝膠洗滌顯色，再浸于1%醋酸終止反應(yīng)，而后在蒸餾水中漂洗凝膠至背景清晰。

采用UMax Powerlook 2110XL(美國電氣通用公司)對(duì)凝膠進(jìn)行圖像采集。分析差異蛋白位點(diǎn)采用Image Master軟件。差異蛋白位點(diǎn)經(jīng)MALDI-TOF-MS打靶鑒定，質(zhì)譜鑒定成功后采用Protein Pilot Software v.5.0(AB SCIEX, USA)軟件分析，然后比對(duì)到Uniprot數(shù)據(jù)庫[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒糟發(fā)酵前后干物質(zhì)中的營養(yǎng)成分

由表1可知，黃酒糟在發(fā)酵后有機(jī)物的占比有所下降，粗蛋白與多肽占比顯著升高（P<0.01）。對(duì)于反芻動(dòng)物尤其是奶牛而言，氨基酸營養(yǎng)是蛋白飼料的營養(yǎng)核心。黃酒糟干物質(zhì)中含有的7種必需氨基酸的總含量在發(fā)酵48h后顯著升高（P<0.01），占比從7.7%增加到10.1%。黃酒糟中10種非必需氨基酸的總含量在發(fā)酵后同樣顯著升高（P<0.01），占比從12.56%增加到15.21%。就單種氨基酸而言，在檢測的17種氨基酸中，除脯氨酸外的16種氨基酸在發(fā)酵48h后均顯著增加（P<0.01）。蛋氨酸（Met）含量增加倍數(shù)最多，約為發(fā)酵前的1.88倍。賴氨酸（Lys）是發(fā)酵前的1.65倍，增加倍數(shù)僅次于蛋氨酸（圖1、圖2）。

表1 未發(fā)酵和發(fā)酵黃酒糟干物質(zhì)中的常規(guī)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

圖1 未發(fā)酵和發(fā)酵48h黃酒糟干物質(zhì)中必需氨基酸組成對(duì)比

圖2 未發(fā)酵和發(fā)酵48h黃酒糟干物質(zhì)中非必需氨基酸組成對(duì)比

2.2 黃酒糟發(fā)酵前后的SDS-PAGE電泳結(jié)果

SDS-PAGE電泳圖可以直觀展示黃酒糟發(fā)酵前后的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化情況，由此可以推測發(fā)酵前后蛋白營養(yǎng)組分的變化。如SDS-PAGE單向電泳圖所示（圖3），發(fā)酵前后的SDS-PAGE條帶有著明顯的差異，在發(fā)酵48h后的電泳圖上分子質(zhì)量45ku以上的蛋白條帶幾乎消失，25～45ku間的蛋白條帶明顯變淡。14.4ku以及18.8ku部分的蛋白條帶在發(fā)酵前后無明顯變化，可能是因?yàn)榘l(fā)酵前后均含有一定濃度的小分子蛋白，通過觀察無法直接得出結(jié)論。通過對(duì)電泳圖條帶遷移率進(jìn)行分析，可估算出酒糟樣品中不同分子質(zhì)量蛋白含量。結(jié)果如表2所示，酒糟中分子質(zhì)量小于5ku、5（含）～10ku以及10（含）～15ku的小分子蛋白含量在發(fā)酵后均大幅上升，分別上升1.89倍、1.39倍和0.93倍。

圖3 未發(fā)酵和發(fā)酵48h黃酒糟的SDS-PAGE電泳圖

表2 未發(fā)酵和發(fā)酵48h黃酒糟的小分子蛋白含量

2.3 黃酒糟雙向蛋白電泳及質(zhì)譜鑒定分析

通過雙向電泳可以分離蛋白，然后采用質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)一步鑒定。在未發(fā)酵黃酒糟的電泳圖上對(duì)差異蛋白位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)注（圖4），雙向蛋白電泳發(fā)現(xiàn)10個(gè)差異倍數(shù)大于1.5且蛋白得分大于95的差異蛋白。這10個(gè)差異蛋白再經(jīng)MALDI-TOF-MS打靶，成功鑒定了其中3個(gè)差異表達(dá)蛋白，經(jīng)對(duì)其進(jìn)行GO分子功能分析（表3），發(fā)現(xiàn)編號(hào)2930的上調(diào)差異蛋白與抑制絲氨酸型內(nèi)肽酶活性有關(guān)，查得分子途徑為限制作用以及二硫鍵，編號(hào)3014的上調(diào)差異蛋白與GTP連接及GTP酶活性有關(guān)，編號(hào)3162的上調(diào)差異蛋白分子功能未見報(bào)道。

表3 質(zhì)譜鑒定成功的差異表達(dá)蛋白及GO中的分子功能

圖4 分布在未發(fā)酵黃酒糟雙向電泳蛋白圖上的差異蛋白位點(diǎn)

3 討論

本研究顯示黃酒糟中粗蛋白、多肽以及除脯氨酸外大部分氨基酸含量在發(fā)酵后均顯著提高。試驗(yàn)所用芽孢菌及酵母菌自身含有豐富的氨基酸[13]，而發(fā)酵過程中蛋白降解也可能是多肽以及氨基酸含量上升的重要原因。韓坤坤等[14]將一株馴化的芽孢桿菌應(yīng)用于豆粕固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵15h后固態(tài)基質(zhì)中多肽含量提高近1倍，增幅比本研究發(fā)酵48h后增幅還要大，這可能與發(fā)酵基底差異性有關(guān)；發(fā)酵52h粗蛋白含量提高5.90個(gè)百分點(diǎn)，與本研究的結(jié)果比較接近。Hu等[15]研究發(fā)現(xiàn)鮮酒糟與豆粕相比，其中賴氨酸和蛋氨酸這兩種限制氨基酸含量十分有限。而對(duì)于泌乳前中期奶牛如果賴氨酸的攝入缺乏，會(huì)導(dǎo)致牛奶中綜合營養(yǎng)成分尤其是蛋白含量顯著降低，從而影響其商品價(jià)值[16,17]。除了可以提高奶牛生產(chǎn)性能，賴氨酸在調(diào)節(jié)自身代謝、增強(qiáng)免疫力等許多方面發(fā)揮重要的生理作用[18]。同時(shí)，蛋氨酸也與奶牛體內(nèi)的許多生理生化過程密切相關(guān)，如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核酸和蛋白質(zhì)的合成、參與多種轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)等[19]。本研究中黃酒糟在固態(tài)發(fā)酵后氨基酸營養(yǎng)得到全面增強(qiáng)，尤其是蛋氨酸和賴氨酸的含量大幅上升，對(duì)奶牛飼喂效果提升有很重要意義。

SDS-PAGE的結(jié)果表明黃酒糟在發(fā)酵48h后大分子蛋白發(fā)生了大量降解，而小分子蛋白、多肽以及氨基酸含量明顯上升。前人研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能分泌多種蛋白酶，在對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵的試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證[20,21]?？莶菅挎邨U菌可以將大分子蛋白降解為小分子蛋白、多肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，同時(shí)酵母具有合成多肽的能力[13]。因此不同分子量的蛋白占比在發(fā)酵前后發(fā)生了顯著變化。

蛋白質(zhì)降解是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要包括內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶等在內(nèi)的多種蛋白水解酶參與。根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫的查詢結(jié)果，編號(hào)2930的上調(diào)表達(dá)蛋白經(jīng)GO功能注釋后存在抑制絲氨酸型內(nèi)肽酶活性的功能。內(nèi)肽酶是一類對(duì)肽鏈內(nèi)部水解具有催化作用的酶，其作用位點(diǎn)不包括肽鏈末端。在對(duì)內(nèi)肽酶對(duì)黃瓜葉片衰老作用的研究中發(fā)現(xiàn)，在葉片衰老過程中，內(nèi)肽酶對(duì)葉片內(nèi)蛋白質(zhì)降解中起重要作用[22]。由此推測，編號(hào)2930的上調(diào)表達(dá)蛋白在黃酒糟發(fā)酵過程中發(fā)揮的分子作用是通過減緩二硫鍵的分解來限肽鏈降解，從而發(fā)揮限制蛋白降解速率的作用。該蛋白表達(dá)上調(diào)原因有待進(jìn)一步探究確認(rèn)?？莶菅挎邨U菌中超過95%分泌蛋白均通過Sec途徑分泌至胞外，不同蛋白分泌途徑可能處于“競爭”狀態(tài)[23]。因此，同為蛋白質(zhì)的不同酶之間可能存在互相限制的作用。

編號(hào)3014的上調(diào)蛋白GO功能注釋后與GTP酶活性以及GTP連接相關(guān)，可是在Uniprot數(shù)據(jù)庫中未查得其分子途徑。GTP是DNA復(fù)制時(shí)引物RNA和轉(zhuǎn)錄mRNA中GMP（鳥嘌呤核苷酸）的提供者。GTP酶能催化GTP分解，GTP在蛋白質(zhì)合成中起著關(guān)鍵的作用。本試驗(yàn)中有7個(gè)差異蛋白無法通過質(zhì)譜鑒定，不成功因素主要如下：①目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量過低；②現(xiàn)有蛋白數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量有限，不包含足以解釋該蛋白質(zhì)功能的數(shù)據(jù)；③發(fā)酵樣品中所含蛋白質(zhì)構(gòu)成較為復(fù)雜，選取凝膠點(diǎn)包含多種未分離開的蛋白。當(dāng)前，有關(guān)蛋白降解關(guān)鍵酶以及主要代謝通路仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)蛋白飼料更高效降解利用需要繼續(xù)深入探究。