趙程禹，鄧清華，劉婷

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，通遼 028001）

1 圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝發(fā)病機(jī)制

奶牛脂肪肝又稱肥胖母牛綜合征，最常見于圍產(chǎn)期（妊娠前、后3周）母牛。該病為營養(yǎng)代謝紊亂障礙性疾病，可出現(xiàn)肝功能下降、子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下、生產(chǎn)癱瘓等癥狀，嚴(yán)重的可造成死亡；病癥較輕者通常表現(xiàn)為產(chǎn)奶量下降、產(chǎn)犢間隔延長、產(chǎn)弱犢等狀況。雖然目前采取科學(xué)的集約化養(yǎng)殖全方面提升了圍產(chǎn)期奶牛的營養(yǎng)狀況，大大緩解了發(fā)病癥狀，但其發(fā)病率依舊未能得到控制，治療效果也不理想，其發(fā)病機(jī)制尚未明確[1]。

1.1 發(fā)病機(jī)理

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，奶牛脂肪肝是一種由多種因素引起的綜合性脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，其中肝臟的脂質(zhì)過量蓄積是其主要的導(dǎo)火索。處于圍產(chǎn)期的奶牛，由于泌乳與自身營養(yǎng)的需求，促進(jìn)體脂動員，使能量以非酯化脂肪酸（NEFA）的形式大量釋放，一部分進(jìn)入肝臟被氧化供能，另一部分重新合成甘油三酯通過極低密度脂蛋白排出體外[2]。但是對于哺乳動物來說，由于受到普遍存在的產(chǎn)后胰島素抵抗和能量負(fù)平衡等諸多因素影響，釋放的NEFA往往遠(yuǎn)超肝臟承受的最大值，造成脂肪沉積，引發(fā)肝功能障礙，降低三羧酸循環(huán)和脂蛋白的合成與分解，使機(jī)體進(jìn)入惡性循環(huán)，引發(fā)脂肪肝。

1.2 發(fā)病因素

1.2.1 能量負(fù)平衡

能量負(fù)平衡是引發(fā)圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝疾病高發(fā)的主要因素，由于其經(jīng)歷妊娠-分娩-泌乳啟動等生理應(yīng)激環(huán)節(jié)及腹腔內(nèi)胎兒占據(jù)的腹內(nèi)空間逐漸增大，致使奶牛食欲稍有下降，降低了干物質(zhì)采食量。能量需求量升高，導(dǎo)致營養(yǎng)達(dá)到負(fù)平衡狀態(tài)，此時機(jī)體為了供給能量，NEFA從脂肪組織中釋放出來，轉(zhuǎn)移到肝臟。當(dāng)達(dá)到肝臟存儲一定限度時，就會形成酮體，繼而出現(xiàn)酮體過度堆積，引發(fā)脂肪肝[3]。雖然這些是高產(chǎn)奶牛正常的適應(yīng)性過程，但由于其對泌乳量的過度需求，臨床上往往造成補(bǔ)給不足或短時間補(bǔ)給過量激發(fā)多種代謝和傳染性疾病，影響奶牛的生產(chǎn)性能[4]。

1.2.2 脂肪組織動員

在能量負(fù)平衡的狀態(tài)下，生命機(jī)體必然會啟動相關(guān)的代謝機(jī)制維持機(jī)體正常運行，這些分娩期發(fā)生的代謝變化稱為“衡態(tài)調(diào)節(jié)”，其意義在于使內(nèi)源性（組織動員的）和外源性（氧化吸收的）營養(yǎng)物質(zhì)重新分配滿足機(jī)體需求。

“衡態(tài)調(diào)節(jié)”中通過體脂代謝彌補(bǔ)因糖異生作用而造成的能量虧損是機(jī)體重要的調(diào)節(jié)途徑，但過多的體脂代謝使得肝臟攝取NEFA過量。NEFA的代謝主要是通過肝臟內(nèi)的三羧酸循環(huán)代謝和以極低密度脂蛋白（VLDL）形式運出肝臟[5]。肝內(nèi)三羧酸循環(huán)代謝消耗的過程是：NEFA進(jìn)入肝臟后首先在乙酰輔酶A合成酶作用下經(jīng)過β-氧化活化為乙酰輔酶A，一部分被徹底氧化釋放能量和二氧化碳，二氧化碳隨呼吸排出體外；另一部分被部分氧化形成酮體，被周圍肝外組織所消耗一部分；還有一部分NEFA在肝臟則以甘油三酯（TG）、磷脂和膽固醇脂的形式合成脂蛋白被肝外組織利用。由于反芻動物肝臟內(nèi)缺乏足量的脂蛋白脂酶和肝脂酶，NEFA主要靠肝臟內(nèi)線粒體的β-氧化作用代謝，因此TG在肝臟中大量蓄積形成脂肪肝。但因為奶牛處于特殊的圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡生理階段，這一途徑往往并不能滿足生理所需，進(jìn)而導(dǎo)致NEFA沉積，形成脂肪肝。

1.2.3 激素調(diào)節(jié)

處于產(chǎn)犢和泌乳高峰的奶牛對葡萄糖的需求量增加，但此時奶牛能量攝入減少，通常葡萄糖攝入量并不能滿足機(jī)體需求。相反此期間由于催乳素的分泌克服了能量供應(yīng)不足的影響，使產(chǎn)乳量持續(xù)增加，長此以往，會導(dǎo)致機(jī)體胰島素和胰高血糖素水平較低，影響肝臟中脂肪組織的分解[6]。近些年又有研究發(fā)現(xiàn)，激素中雌激素、皮質(zhì)醇、生長激素等也會影響脂肪肝的形成，甚至奶牛分娩期間激素的變化也對其有一定的影響作用[7]。

1.2.4 管理因素

奶牛圍產(chǎn)期的飼養(yǎng)管理直接影響奶牛營養(yǎng)和健康狀況，管理不當(dāng)則存在脂肪肝發(fā)生的潛在風(fēng)險。圍產(chǎn)期日糧的突然改變或過量飼喂高精料會引起瘤胃酸中毒，從而促進(jìn)生酮作用，使促炎性細(xì)胞因子和內(nèi)毒素增高進(jìn)而導(dǎo)致脂肪肝疾病的發(fā)生[8]。

另外，圍產(chǎn)期奶牛的飼喂舍空間狹小、空氣不流通、高溫高濕、衛(wèi)生條件差以及戶外活動空間不足、運動量少會引起動物機(jī)體釋放兒茶酚胺，導(dǎo)致過多脂肪組織的釋放而沉積形成脂肪肝[9]。

1.2.5 遺傳因素

影響脂肪肝發(fā)生的主要遺傳因素為調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織中糖類或脂類代謝以及采食量這三方面基因的突變，尤其是那些參與肝脂形成的基因，增加脂肪分解作用的基因以及減少肝脂中β-氧化、脂質(zhì)包裝和分泌的基因突變性更大[10]。到目前為止，關(guān)于肝臟甘油三酯（TG）和脂質(zhì)含量的遺傳力估計值尚未得出有效數(shù)據(jù)，但對于相關(guān)的酮病和真胃變位的遺傳力估計值分別為0.32[11]和0.24[12]，這或許表明奶牛脂肪肝也同樣存在遺傳基礎(chǔ)[13]。有研究者在用1,3-丁二醇結(jié)合限飼誘導(dǎo)的脂肪肝模型中，發(fā)現(xiàn)處于圍產(chǎn)期的肥胖奶牛發(fā)病率更高，這主要是源于圍產(chǎn)期處于特殊的能量負(fù)平衡階段[14]，而能量負(fù)平衡主要是由于營養(yǎng)代謝失衡所導(dǎo)致，其中高產(chǎn)奶牛最為顯著。關(guān)于其發(fā)病因素是否由自身遺傳差異所決定仍有待研究。

2 奶牛圍產(chǎn)期脂肪肝的診治

2.1 診斷方法

脂肪肝根據(jù)其病程長短可分為輕度、中度、重度三類（表1）。肝臟穿刺組織活檢可作出確切診斷，但該法對奶牛損害極大，近年來已被血清學(xué)檢測和超聲方法等新興技術(shù)所取代[15]。

表1 奶牛脂肪肝分類

2.1.1 肝組織取樣鏡檢

選取奶牛第11～12肋間部位采用超聲波診斷檢測確定肝臟位置、大小、形態(tài)及重要血管。穿刺途徑的選擇原則為距離病灶路徑最短，無重要血管、神經(jīng)及內(nèi)臟的部位。穿刺前應(yīng)進(jìn)行常規(guī)的消毒和麻醉處理，如果穿刺次數(shù)較多，可以肌注凝血酶原[16]。具體步驟為：將穿刺組織從穿刺針緩慢轉(zhuǎn)移到固定液，保證細(xì)胞間未受到擠壓，在HE染色中鏡檢觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列是否整齊，肝小葉輪廓是否清晰，如肝小葉可見大量脂滴（LD）可作為判斷奶牛脂肪肝的重要依據(jù)[17]。在組織學(xué)檢查中，脂肪肝的特征為肝小葉中央?yún)^(qū)域存在大的LD，周邊區(qū)域有較小的LD。輕度脂肪肝奶牛TG的累積僅限于肝靜脈附近的肝小葉中央部分，中度和重度脂肪肝TG浸潤延伸至肝小葉中段及門靜脈[3]。

2.1.2 血液生化指標(biāo)及肝功能檢測

為避免肝組織活檢帶來的不利影響，國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)患牛血液生化指標(biāo)及肝功能檢驗來診斷奶牛脂肪肝[18]。通過檢測病牛血糖、血液NEFA、血液β-羥丁酸 (BHBA)濃度及肝損傷特異性酶活性等指標(biāo)變化來預(yù)測脂肪肝的發(fā)生[19]。目前已報道的診斷指標(biāo)有很多，包括谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（Ornithine carbamoyl transferase，OCT）、總膽紅素（Total bilirubin，TBIL）、NEFA、總膽固醇（TC）、谷氨酸（Glu）、胰高血糖素、甘油三酯（T A G）、游離脂肪酸（FFA）、胰島素（Insulin，INS）及載脂蛋白等[18]。也有學(xué)者認(rèn)為監(jiān)測奶牛泌乳早期甲狀腺機(jī)能的狀態(tài)可輔助診斷奶牛脂肪肝[18]。Reid等人研究提出奶牛血清中游離脂肪酸、血糖和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的濃度按照一定的公式可用于診斷奶牛脂肪肝，即Y=0.510.003N EFA+2.84Glu0.0528AST，當(dāng)Y<0時為重度脂肪肝，當(dāng)0

2.1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)診斷

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是以蛋白質(zhì)為研究對象的科學(xué)，可以通過比較健康個體與患病個體血漿中蛋白質(zhì)成分的差異，篩選差異蛋白質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)疾病的潛在標(biāo)志物。目前，通過該方法篩選脂肪肝的潛在標(biāo)志物已成為一個研究熱點。其中定量蛋白質(zhì)組學(xué)是將一個基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，或復(fù)雜的混合樣品中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量，可采用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行定量。該技術(shù)可以同時定量比較4種不同樣本中的蛋白質(zhì)，可用于研究疾病發(fā)展過程，或者細(xì)胞培養(yǎng)等不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，目前在比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中應(yīng)用較廣泛[20]。有學(xué)者通過比較脂肪肝奶牛與健康奶牛的血漿蛋白質(zhì)譜，也發(fā)現(xiàn)了幾十種潛在的蛋白標(biāo)志物，并認(rèn)為丙酰輔酶A羧化酶和乳酸脫氫酶與奶牛肝脂沉積密切相關(guān)[18]。

2.2 防治措施

“圍產(chǎn)期”奶牛要經(jīng)歷從妊娠、分娩到泌乳的體內(nèi)營養(yǎng)代謝和生理應(yīng)激的最大刺激階段。在此期間，由于胎兒的生長發(fā)育和產(chǎn)后泌乳量的大量需求，奶牛往往會出現(xiàn)能量負(fù)平衡狀況，影響其自身健康。此時過多飼喂或限飼都會造成機(jī)體的亞健康，目前尚未找到特效治療藥物。所以奶牛圍產(chǎn)期合理科學(xué)的飼養(yǎng)調(diào)控是減少脂肪肝疾病損失的最有效措施。

2.2.1 營養(yǎng)調(diào)控

通過上述脂肪肝發(fā)病因素可以知道，圍產(chǎn)期奶牛采食量下降使得機(jī)體能量缺乏，但是盲目提高精飼料占比會加劇機(jī)體內(nèi)脂肪組織動員遲緩而造成脂質(zhì)淤積引發(fā)脂肪肝疾病。鑒于圍產(chǎn)期奶牛干物質(zhì)攝入量高峰晚于血糖需求高峰，可以在圍產(chǎn)期給予奶?？茖W(xué)合理的飼喂方式與飼料配比，進(jìn)而降低發(fā)病率。

目前養(yǎng)殖業(yè)存在的主要飼喂誤區(qū)有以下幾方面：一是日糧組分不平衡，長期營養(yǎng)攝入不平衡會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)丙氨酸生成量減少影響糖異生途徑；二是日糧品質(zhì)不佳，低質(zhì)飼料中往往存在大量β-羥丁酸，會降低奶牛采食量，影響機(jī)體能量攝入。而為了增加奶牛的營養(yǎng)改用高精飼料，則會嚴(yán)重減弱瘤胃機(jī)能，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)微生物死亡，可造成瘤胃內(nèi)酸中毒和細(xì)菌性毒血癥，進(jìn)而誘發(fā)脂肪肝[13]。這種由低能飼料向高能飼料的轉(zhuǎn)變就是導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛營養(yǎng)應(yīng)激的主要因素[21]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加生物素有利于改善泌乳初期奶牛的生產(chǎn)性能。生物素可改善奶牛肢蹄健康，提高泌乳性能，但生物素對圍產(chǎn)期奶牛能量和代謝蛋白平衡狀況影響的研究尚少。根據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼生物素可顯著提高奶牛產(chǎn)后第14天血糖濃度及產(chǎn)后第5周產(chǎn)奶量[21]。這一研究仍需后期大量試驗加以驗證。

2.2.2 基因調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因兔過表達(dá)載脂蛋白E后，肝臟中極低密度脂蛋白（VLDL）的合成量顯著增加。隨著載脂蛋白E表達(dá)量的提升，VLDL的分泌量也隨之增加[22]。Tsukamoto等人通過將人的載脂蛋白E基因轉(zhuǎn)入apoE缺乏的小鼠體內(nèi)后，肝臟VLDL的合成量增加了4～5倍[23]。Chen指出，載脂蛋白B、載脂蛋白E、可溶性低密度脂蛋白受體、微粒體脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白等均具有調(diào)節(jié)肝臟脂肪轉(zhuǎn)運的功能。將這些蛋白質(zhì)的外源基因引入實驗動物后都能夠促進(jìn)肝臟內(nèi)VLDL的合成和分泌，降低肝臟脂肪含量，相比之下，apoE基因?qū)Ω闻K脂肪轉(zhuǎn)運的促進(jìn)效果最顯著[24]。微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白MTP在脂肪肝形成過程中是生脂及脂肪沉積中的重要影響蛋白，對MTP的生物學(xué)特性、神經(jīng)內(nèi)分泌因子和代謝產(chǎn)物對MTP調(diào)節(jié)的研究，可以通過分子機(jī)制上的差異，改良品種及篩選優(yōu)良性狀，預(yù)防脂類代謝疾病[25]。

2.2.3 遺傳育種

隨著分子遺傳育種技術(shù)的發(fā)展，針對類似脂肪肝疾病這種低遺傳力的性狀，可以通過分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)提升奶牛群體的脂肪肝抗病性，培育優(yōu)質(zhì)抗病品種，減少奶牛脂肪肝的發(fā)生。首先要做的就是對奶牛脂肪肝抗病性狀的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，找到影響脂肪肝抗病性狀的分子標(biāo)記和候選基因，之后應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種。因此在分子生物學(xué)層面研究奶牛脂肪肝的發(fā)病機(jī)理，并進(jìn)一步確定有效的治療策略至關(guān)重要[26]。