吳 威

李 群

宋 笛

孫明哲

(長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

葛花(Puerariaeflos)又名葛條花，具有解酒、降血脂、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[1-3]。葛花異黃酮是葛花的主要生物活性成分之一[4]，近年來葛花異黃酮的提取、純化和結(jié)構(gòu)鑒定方面也取得一些研究成果[5-7]，但分離純化技術(shù)落后、產(chǎn)品純度不高限制了葛花異黃酮在食品、化妝品和醫(yī)藥健康領(lǐng)域的應(yīng)用。

肥胖已成為世界性的健康問題，脂類過量攝入是導(dǎo)致超重的重要因素之一。抑制膳食脂肪吸收進(jìn)入人體消化系統(tǒng)是減肥的重要途徑之一[8]。在脂肪消化吸收過程中胰脂肪酶和膽固醇酯酶發(fā)揮了關(guān)鍵作用，抑制胰脂肪酶和膽固醇酯酶活性，可控制脂肪吸收進(jìn)入人體，因此，胰脂肪酶抑制率、膽固醇酯酶抑制率和膽固醇膠束溶解度成為體外降脂減肥評(píng)價(jià)的通用方法[9-11]。異黃酮類化合物具有一定的降脂活性[12]，但關(guān)于葛花異黃酮降脂活性的研究未見報(bào)道。研究擬優(yōu)化葛花異黃酮精制工藝，并以胰脂肪酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度抑制率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)精制前后葛花異黃酮的體外降脂減肥活性，以期為葛花資源在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葛花：吉林大藥房，經(jīng)干燥、粉碎、過80目篩備用。

1.2 儀器與試劑

酶標(biāo)儀：F50型，瑞士帝肯TECAN集團(tuán)公司；

紫外可見光分光光度計(jì)：UV-1700型，日本島津公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FD-1A-50型，上海豫明儀器有限公司；

氣流式超微粉碎機(jī)：RT-25型，北京錕捷玉誠(chéng)機(jī)械設(shè)備有限公司；

超聲波萃取儀：KS-600N型，上?？缕顑x器設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52C型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；

AB-8、NKA-9、HPD-100、D101、LSA-10型大孔樹脂：天津允開樹脂科技有限公司；

豬胰脂肪酶(100 U/mg)、豬胰膽固醇酯酶(100 U/mg)、對(duì)硝基苯基月桂酸酯、對(duì)硝基苯基丁酸酯：美國(guó)Sigma公司；

奧利司他膠囊(orlistat)：重慶華森制藥有限公司；

總膽固醇檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 葛花異黃酮提取方法

參照孫明哲[13]的方法，以葛花為原料，粉碎過80目，固液比(m葛花∶V乙醇溶液)1∶16 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)74%，超聲功率260 W，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度76 ℃，提取2次，濃縮、凍干(-55 ℃，0～5 Pa)備用。

1.4 葛花異黃酮的精制工藝

1.4.1 葛花異黃酮吸附率和解吸率 吸附率按式(1)計(jì)算，解吸率按式(2)計(jì)算。

(1)

(2)

式中：

A——吸附率，%；

D——解吸率，%；

A0——原液葛花異黃酮的吸光度值(250 nm)；

A1——吸附后溶液的吸光度值(250 nm)；

A2——洗脫溶液的吸光度值(250 nm)。

1.4.2 樹脂優(yōu)選 分別取5 g AB-8、NKA-9、D101、HPD-100和LSA-10型大孔吸附樹脂，預(yù)處理后置于三角瓶中，分別加入 50 mg/mL的葛花異黃酮粗提液20 mL，室溫震蕩2 h，過濾，于250 nm處測(cè)定濾液的吸光度值，計(jì)算吸附率；取吸附飽和的樹脂，分別向其中加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液20 mL，室溫條件下振蕩2 h，過濾，測(cè)定250 nm處吸光度值，計(jì)算解吸率，葛花異黃酮的精制樹脂選擇吸附率和解吸率中的最大值。

1.4.3 葛花異黃酮質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響 取質(zhì)量濃度12.5，25，50，100，200，400，800 mg/mL的葛花異黃酮溶液各50 mL，與20 g預(yù)處理的HPD-100型大孔樹脂混合，室溫振蕩 2 h，過濾，測(cè)定濾液的吸光度值(250 nm)，計(jì)算吸附率。

1.4.4 pH值對(duì)葛花異黃酮吸附率的影響 三角瓶中分別配制50 mL質(zhì)量濃度為50.0 mg/mL的葛花異黃酮，pH值分別調(diào)整為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分別加入預(yù)處理的HPD-100型大孔樹脂20 g，室溫振蕩 2 h，過濾，測(cè)定濾液的吸光度值(250 nm)，計(jì)算吸附率。

1.4.5 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響 分別配制50 mL體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液，加入吸附飽和的HPD-100型大孔樹脂20 g，室溫振蕩 2 h，過濾，測(cè)定濾液的吸光度值(250 nm)，計(jì)算解吸率。

1.4.6 pH值對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響 取吸附飽和的HPD-100型大孔樹脂20 g 于三角瓶中，將50 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液分別加入其中，調(diào)整溶液的pH值分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，置于搖床中振蕩 2 h，過濾取濾液，測(cè)定250 nm處吸光度值，計(jì)算解吸率。

1.4.7 洗脫流速對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響 層析柱中(35 mm×500 mm)填入HPD-100型大孔樹脂(經(jīng)預(yù)處理)，經(jīng)12 h平衡后，上樣，即加入20 mL葛花異黃酮溶液(100 mg/mL)；洗脫，即利用70%(pH 5.0)乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流量分別調(diào)整為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min，收集洗脫液，測(cè)定濾液的吸光度值(250 nm)，計(jì)算解吸率。

1.5 葛花異黃酮對(duì)胰脂肪酶活性的影響

胰脂肪酶活性測(cè)定參照Gondoin等[14]的方法并做適當(dāng)修改。酶液(10 mg/mL)：1 g胰脂肪酶溶解于10 mL去離子水中，渦旋2 min，離心(8 000 r/min，10 min)取上清液備用；緩沖溶液：100 mmol/L pH 8.2 的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris)；底物(對(duì)硝基苯基月桂酸酯0.08%)：以5 mmol/L pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液(內(nèi)含1% 曲拉通，Triton X-100)配制。分別取緩沖溶液350 μL，酶液150 μL，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葛花異黃酮樣品50 μL于離心管中，再加入450 μL底物開始反應(yīng)，37 ℃孵育2 h，離心(8 000 r/min，1 min)，測(cè)上清液吸光度值(400 nm)，對(duì)照組以去離子水替代葛花異黃酮，胰脂肪酶抑制率按式(3)計(jì)算。

(3)

式中：

HP——胰脂肪酶抑制率，%；

AC——對(duì)照組吸光度值；

AS——樣品吸光度值。

1.6 葛花異黃酮對(duì)膽固醇酯酶活性的影響

膽固醇酯酶活性測(cè)定參照Garzón等[15]的方法并適當(dāng)修改。酶液(25 μg/mL)：0.25 mg豬胰膽固醇酯酶溶解于10 mL去離子水中，離心(8 000 r/min，10 min)取上清液備用；底物緩沖液：配制0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.04)(內(nèi)含0.1 mol/L NaCl，0.02 mol/L對(duì)硝基苯基丁酸酯，6 mmol/L?；悄懰徕c)，分別取底物緩沖液925 μL，酶液50 μL和25 μL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葛花異黃酮樣品于離心管中，25 ℃孵育5 min，測(cè)吸光度值(405 nm)，對(duì)照組加入25 μL去離子水，膽固醇酯酶抑制率按式(3)計(jì)算。

1.7 葛花異黃酮對(duì)膽固醇膠束溶解度的影響

膽固醇膠束的制備參照Prados等[16]的方法并適當(dāng)修改。膽固醇膠束制備：以15 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)配制，內(nèi)含?；悄懰徕c(10 mmol/L)、膽固醇(2 mmol/L)、油酸(5 mmol/L)、NaCl(132 mmol/L)，超聲波(400 Hz)處理1 h，37 ℃孵育24 h，取1 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葛花異黃酮樣品與5 mL膽固醇膠束混合，37 ℃孵育2 h，離心(8 000 r/min，10 min)，用總膽固醇試劑盒測(cè)定上清液膽固醇含量，對(duì)照組加1 mL去離子水，抑制率按式(4)計(jì)算。

(4)

式中：

HC——膽固醇膠束溶解度抑制率，%；

CC——對(duì)照組膽固醇含量，mmol/L；

CS——樣品膽固醇含量，mmol/L。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 葛花異黃酮精制工藝的確定

2.1.1 樹脂優(yōu)化 大孔吸附樹脂是廣泛選用的精制異黃酮類化合物的柱填料，因其極性和粒徑大小的不同，對(duì)不同異黃酮類化合物的吸附和解離的難易程度存在差異[17]。由圖1可知，HPD-100型大孔樹脂對(duì)葛花異黃酮表現(xiàn)出較好的吸附和解離性能，吸附率最高為89.61%，解吸率最高為83.86%，優(yōu)于其他類型的大孔樹脂，HPD-100型大孔樹脂的極性和粒徑適合分離葛花異黃酮，可以用于后續(xù)精制過程。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 樹脂篩選Figure 1 Optimization of macroporous adsorption resin

2.1.2 葛花異黃酮質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響 由圖2可知，隨著葛花異黃酮質(zhì)量濃度的增大，吸附率呈先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)葛花異黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/mL時(shí)，吸附率出現(xiàn)最大值88.41%，此后吸附率逐漸減小。可能是高濃度的葛花異黃酮堵塞樹脂孔洞，導(dǎo)致吸附率下降，因此葛花異黃酮吸附液質(zhì)量濃度定為100 mg/mL。

2.1.3 pH值對(duì)葛花異黃酮吸附率的影響 由圖3可知，隨吸附溶液pH的增加，吸附率呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)吸附液pH為6.0時(shí)，吸附率最高為87.49%。葛花異黃酮的弱酸性質(zhì)使其在pH 6.0 時(shí)出現(xiàn)最高的吸附率，與閔玉濤等[18]純化葛根異黃酮的吸附溶液pH(5.0～6.0)相似。因此，調(diào)整吸附溶液pH為6.0。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 葛花異黃酮質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 pH值對(duì)葛花異黃酮吸附率的影響Figure 3 The effect of pH on adsorption rate ofPuerariae flos isoflavones

2.1.4 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響 由圖4可知，隨洗脫液濃度的增加，解吸率呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值82.35%，70%的乙醇溶液，其極性適合從樹脂上解離葛花異黃酮類物質(zhì)。因此，洗脫溶液定為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響

2.1.5 pH值對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響 由圖5可知，隨洗脫溶液pH值的增大，解吸率先增大后減小，在pH值為5.0處，解吸率出現(xiàn)最大值81.52%，因此，洗脫液pH值調(diào)整為5.0。

2.1.6 洗脫流速對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響 由圖6可知，隨洗脫流速的增加，葛花異黃酮解吸率呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)2.0 mL/min速度進(jìn)行洗脫時(shí)，解吸率出現(xiàn)最大值82.35%，洗脫流速過高，葛花異黃酮洗脫不夠完全，導(dǎo)致解吸率減小，洗脫流速參數(shù)與劉瑩等[19]的結(jié)論相同。因此，洗脫流速調(diào)整為2.0 mL/min。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 pH對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 洗脫流速對(duì)葛花異黃酮解吸率的影響

2.1.7 葛花異黃酮精制工藝參數(shù) 層析柱中(35 mm×500 mm)裝入預(yù)處理的HPD-100型大孔樹脂，以去離子水平衡12 h，吸附條件：葛花異黃酮質(zhì)量濃度100 mg/mL，pH 6.0，體積20 mL；解吸條件：70%乙醇溶液(pH 5.0)，流速2.0 mL/min。如圖7所示，經(jīng)HPD-100型大孔樹脂精制后，洗脫曲線中出現(xiàn)單一組分峰，收集管編號(hào)(22～30)，真空濃縮，冷凍干燥后獲得葛花異黃酮精制組分A1(純度81.47%)。

圖7 葛花異黃酮洗脫曲線Figure 7 The elution graph of Puerariae flosisoflavones

2.2 葛花異黃酮對(duì)胰脂肪酶活性的影響

由圖8可知，隨葛花異黃酮濃度的增加，胰脂肪酶抑制率呈線性增加的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.2 mg/mL后，趨于平緩，在1.0 mg/mL處抑制率出現(xiàn)最大值40.73%，略低于奧利司他(44.36%)，但高于未精制葛花異黃酮26.65%，高于相同質(zhì)量濃度的陳年烏龍茶[20]。胰脂肪酶是膳食脂肪分解的關(guān)鍵酶，抑制其活性可減少脂肪吸收，降低脂肪利用率[21]。葛花異黃酮可抑制胰脂肪酶活性，通過減少脂肪消化分解發(fā)揮降脂減肥作用。

圖8 葛花異黃酮對(duì)胰脂肪酶活性的影響

2.3 葛花異黃酮對(duì)膽固醇酯酶活性的影響

由圖9可知，隨葛花異黃酮質(zhì)量濃度的增大，膽固醇酯酶活性表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率呈線性增加趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.6 mg/mL時(shí)，增長(zhǎng)趨勢(shì)趨于平緩，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，抑制率最高為52.32%，略低于奧利司他(54.28%)，但高于未精制葛花異黃酮(47.46%)。抑制膽固醇酯酶活性，可減少膳食中的膽固醇酯分解成膽固醇，進(jìn)而抑制膽固醇的吸收，發(fā)揮降脂減肥的作用[22]。葛花異黃酮可抑制膳食膽固醇酯分解成游離膽固醇進(jìn)入消化系統(tǒng)，具有一定的降脂減肥活性。

圖9 葛花異黃酮對(duì)膽固醇酯酶活性的影響

2.4 葛花異黃酮對(duì)膽固醇膠束溶解度的影響

由圖10可知，隨葛花異黃酮質(zhì)量濃度的增加，膽固醇膠束溶解度抑制率呈線性增加的趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL 處，抑制率出現(xiàn)最大值46.17%，略低于奧利司他(48.41%)，但高于未精制葛花異黃酮(37.53%)，膽固醇膠束溶解度抑制率高于亞麻籽肽[23]。膽固醇需借助膽固醇膠束完成轉(zhuǎn)運(yùn)到消化系統(tǒng)的過程，溶解度越高，吸收利用率就越高[24]。葛花異黃酮可降低膽固醇膠束溶解度，降低膽固醇的生物利用率，發(fā)揮降脂減肥作用。

圖10 葛花異黃酮對(duì)膽固醇膠束溶解度的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)優(yōu)化了葛花異黃酮的精制工藝條件，同時(shí)評(píng)價(jià)其體外降脂減肥活性。葛花異黃酮精制的最優(yōu)樹脂選擇HPD-100型大孔吸附樹，精制工藝條件如下，吸附條件：上樣100 mg/mL葛花異黃酮溶液(pH 6.0) 20 mL；解吸條件：利用70%乙醇溶液(pH 5.0)以2.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，葛花異黃酮經(jīng)精制后純度可達(dá)81.47%。精制后的葛花異黃酮在體外對(duì)胰脂肪酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度都表現(xiàn)出較好的抑制作用，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，但抑制率略低于奧利司他，高于未精制葛花異黃酮。葛花異黃酮可以通過抑制胰脂肪酶，抑制膽固醇酯酶的活性，降低膽固醇膠束溶解度，阻止食物中脂肪消化吸收而發(fā)揮降脂減肥作用，但能否在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)消化后也表現(xiàn)出相同的降脂減肥活性，以及其作用機(jī)制將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。