韋嘉璐 艾思潔 張 芯 王 磊 吳國芳 王海英#

(1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

微藻是一類光合自養(yǎng)生物，具有生長周期短、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特性[1]，可以去除養(yǎng)殖廢水中的氮、磷及金屬離子等[2]，但純藻系統(tǒng)在處理養(yǎng)殖廢水時存在明顯缺陷，如穩(wěn)定性差、易被外來物種污染、對設(shè)備要求高、對污水中COD去除效果不佳等[3]。近年來，建立藻菌共生系統(tǒng)進(jìn)行廢水處理的研究引起了廣泛關(guān)注。DE BASHAN等[4]采用巴西固氮螺菌與小球藻組成藻菌共生系統(tǒng)，其對城市污水中的氨氮、硝酸鹽氮和磷的去除效率分別達(dá)到100%、15%和36%，顯著高于純藻系統(tǒng)。有研究發(fā)現(xiàn)小球藻和大腸桿菌共生系統(tǒng)中，大腸桿菌促進(jìn)了小球藻的生物量增長，在處理模擬城市廢水時大大縮短了消耗營養(yǎng)物質(zhì)的時間[5]。AMIN等[6]、張晶等[7]認(rèn)為植物促生菌可以分解有機(jī)物、固定無機(jī)氮和提供CO2促進(jìn)微藻的生長，而微藻又可提供O2促進(jìn)菌的生長。

芽孢桿菌可以在養(yǎng)殖廢水中生長，并降解水體中氨氮和殘餌等[8]。JI等[9]發(fā)現(xiàn)小球藻和地衣芽孢桿菌共生系統(tǒng)對合成污水處理效果較好，COD、總?cè)芙饬?TDP)和總?cè)芙獾?TDN)的去除率分別為86.55%、80.28%和88.95%，而銅綠微囊藻和地衣芽孢桿菌共生系統(tǒng)處理效果明顯劣于小球藻和地衣芽孢桿菌共生系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建多組藻菌共生系統(tǒng)，許多藻菌共生系統(tǒng)較純藻系統(tǒng)在凈化養(yǎng)殖廢水中并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[10]，說明藻種和菌種的篩選是構(gòu)建藻菌共生系統(tǒng)的關(guān)鍵因素。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充少量葡萄糖與微量L-丙氨酸可提升藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的處理效率[11]，說明藻菌共生系統(tǒng)對廢水的處理效果與廢水營養(yǎng)特性相關(guān)。

本研究以前期篩選的對養(yǎng)殖廢水污染物具有較好去除效率的萊茵衣藻(ChlamydomonasreinhardtiiCC-125)與凝結(jié)芽孢桿菌(BacilluscoagulansBS32)共生系統(tǒng)為研究對象，考察藻菌共生系統(tǒng)處理養(yǎng)殖廢水的過程中，微藻和細(xì)菌的生長以及污染物去除的變化，進(jìn)一步篩選了共代謝碳源，考察少量葡萄糖和微量L-丙氨酸對萊茵衣藻-凝結(jié)芽孢桿菌共生系統(tǒng)處理養(yǎng)殖廢水的促進(jìn)機(jī)制，為高效的藻菌共生系統(tǒng)在養(yǎng)殖廢水處理的規(guī)?；瘧?yīng)用提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌

萊茵衣藻獲自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，于三醋酸磷酸酯(TAP)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為恒溫25 ℃，光暗周期12 h∶12 h，光照強(qiáng)度40 μmol/(m2·s)。

凝結(jié)芽孢桿菌獲自中南民族大學(xué)食品與生物工程研究所，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為恒溫37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2 廢水水質(zhì)特征

實(shí)驗(yàn)所用廢水為豬場養(yǎng)殖廢水，從武漢市郊區(qū)某養(yǎng)豬場獲得。使用殼聚糖為絮凝劑，海藻酸鈉為補(bǔ)充劑對豬場養(yǎng)殖廢水原液進(jìn)行絮凝處理，沉淀3 h后取上清液用去離子水稀釋10倍，121 ℃高壓滅菌20 min后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此時，養(yǎng)殖廢水中氨氮、TN、TP、COD分別為(20.0±0.5)、(80.0±1.3)、(22.0±1.3)、(1 000.0±18.6) mg/L。

1.3 藻菌共生系統(tǒng)構(gòu)建

取對數(shù)生長期的萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌，5 000 r/min離心5 min，去離子水洗滌3次，使用預(yù)處理后的養(yǎng)殖廢水重懸，制得初始細(xì)胞密度分別為7.6×108、1.0×108cfu/mL的萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌懸液，將重懸的萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌分別以10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)和1%的接種量接種到養(yǎng)殖廢水中，構(gòu)建純藻系統(tǒng)與純菌系統(tǒng)，將10%萊茵衣藻和1%凝結(jié)芽孢桿菌同時接種到養(yǎng)殖廢水中，構(gòu)建藻菌共生系統(tǒng)。將各培養(yǎng)系統(tǒng)放置于光照培養(yǎng)箱中，25 ℃下連續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度40 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h∶12 h。培養(yǎng)過程中定時采集培養(yǎng)液樣品，5 000 r/min離心10 min，取上清液測定COD、氨氮、TN、TP。為考察添加營養(yǎng)物質(zhì)后藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水凈化效能及藻菌生長的影響，分別向藻菌共生系統(tǒng)添加0.5 g/L葡萄糖以及0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸,相同條件下培養(yǎng)，定期采集培養(yǎng)液樣品測定水質(zhì)指標(biāo)及藻菌生長變化。

1.4 分析方法

1.4.1 水質(zhì)指標(biāo)的測定

COD采用COD試劑盒法測定；TN使用《水質(zhì) 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》(HJ 636—2012)測定；氨氮使用《水中氨態(tài)氮的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法》(ASTMD 1426-15)測定；TP使用《水質(zhì) 總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》(GB 11893—89)測定。

1.4.2 碳源利用的測定

Biolog EcoPlateTM微孔板可以通過微生物對碳源利用時所反映的顏色變化來檢測碳利用率，微孔板包含31種碳源，每種碳源有3個重復(fù)樣本。將Biolog EcoPlateTM微孔板預(yù)熱至25 ℃，分別取萊茵衣藻、凝結(jié)芽孢桿菌和藻菌共培養(yǎng)物，用微量移液器取125 μL移至微孔板中，加樣完畢蓋上板蓋，恒溫25 ℃下光照靜置培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)120 h，每隔24 h用酶標(biāo)儀讀取590 nm處吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3 萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌的生長測定

以每10倍為一個梯度將培養(yǎng)液稀釋104～106倍，涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃下孵育48 h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算凝結(jié)芽孢桿菌的菌落數(shù)目。

取1 mL培養(yǎng)液與5 mL 90%(體積分?jǐn)?shù))丙酮溶液混合，4 ℃暗處理24 h。6 000 r/min下離心5 min，取上清液分別在630、647、664、750 nm處測量吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算葉綠素總質(zhì)量濃度[12]：

Fx=[4.75(OD664-OD750)+11.89(OD647-OD750)+20.98(OD630-OD750)]VE/VS

(1)

式中：Fx為萊茵衣藻葉綠素總質(zhì)量濃度，mg/L；OD664、OD750、OD647、OD630分別為上清液在664、750、647、630 nm處的吸光度；VE為混合溶液的體積，mL；VS為測量樣品的體積，mL。

1.4.4 葡萄糖含量測定

用3,5-二硝基水楊酸(DNS)通過比色法對樣品中的葡萄糖進(jìn)行定量測定，具體操作方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.4.5 葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度測定

使用FMS-2便攜脈沖調(diào)制式熒光儀測量葉綠素?zé)晒狻Ｈ? mL培養(yǎng)液在20 ℃室溫下暗適應(yīng)15 min，通過測量光束確定葉綠素的固定熒光產(chǎn)量，并用飽和光脈沖測量最大熒光產(chǎn)量，根據(jù)式(2)計(jì)算葉綠素?zé)晒鈪?shù)：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

(2)

式中：Fv為可變熒光產(chǎn)量；Fm為最大熒光產(chǎn)量；F0為固定熒光產(chǎn)量；Fv/Fm為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 各培養(yǎng)系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的處理效果

純藻系統(tǒng)、純菌系統(tǒng)以及藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的處理效果見圖1。

由圖1(a)可見，在連續(xù)5 d的培養(yǎng)過程中，藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水COD的去除率均高于純藻和純菌系統(tǒng)，培養(yǎng)初期純藻系統(tǒng)與藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水COD的去除效果接近，培養(yǎng)第2天純藻系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水COD去除率達(dá)到最大值63.26%，隨后開始逐漸降低。藻菌共生系統(tǒng)在培養(yǎng)第3天對養(yǎng)殖廢水COD去除率達(dá)到最高值65.28%，之后略微下降并總體趨于穩(wěn)定。純菌培養(yǎng)系統(tǒng)對COD去除率基本保持上升趨勢，在培養(yǎng)第5天COD去除率與純藻系統(tǒng)接近。

由圖1(b)可見，純藻系統(tǒng)和藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水氨氮去除效果良好，且去除趨勢相似。純藻系統(tǒng)和藻菌共生系統(tǒng)在培養(yǎng)第5天對氨氮去除率均在60%以上，而純菌系統(tǒng)氨氮去除率僅在30%左右，遠(yuǎn)低于純藻系統(tǒng)和藻菌共生系統(tǒng)。

由圖1(c)可見，純藻系統(tǒng)和藻菌共生系統(tǒng)在培養(yǎng)前4天TN去除率變化趨勢一致，培養(yǎng)第4天時TN的去除率分別為62.52%、64.88%。培養(yǎng)第5天純藻系統(tǒng)對TN的去除效率仍在上升，而藻菌共生系統(tǒng)對TN的去除有所下降。在純菌系統(tǒng)中，培養(yǎng)前4天養(yǎng)殖廢水TN去除率總體處于平穩(wěn)狀態(tài)，第5天TN去除率大幅增加。

由圖1(d)可見，純菌系統(tǒng)培養(yǎng)初期TP濃度有所上升，TP去除率呈現(xiàn)負(fù)值，這可能是因?yàn)檠挎邨U菌去除TP需要周期性循環(huán)，芽孢桿菌中積聚的磷存在釋放[14]，第3天后TP去除率逐漸上升。而純藻系統(tǒng)和藻菌共生系統(tǒng)對TP的去除效果接近，培養(yǎng)第5天時兩系統(tǒng)TP去除效率基本一致。

綜上可知，相較于純藻系統(tǒng)，藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的凈化效果并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，可能是養(yǎng)殖廢水的營養(yǎng)限制不利于藻菌共生系統(tǒng)中萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌的生長。

2.2 碳源的選擇

以Biolog EcoPlateTM微孔板檢測藻菌的碳源利用情況，以期通過共代謝促進(jìn)養(yǎng)殖廢水中有機(jī)物的降解。根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)，將Biolog EcoPlateTM微孔板上的31種碳源分為6個類別：酯類、羧酸、氨基酸、碳水化合物、胺類、醇類[15]。萊茵衣藻、凝結(jié)芽孢桿菌以及萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌的藻菌混合對碳源的利用情況見圖2。

圖2 碳源的利用情況

由圖2可見，藻菌混合對6種碳源的利用情況由強(qiáng)到弱依次為酯類、碳水化合物、胺類、氨基酸、羧酸、醇類。相較單獨(dú)的萊茵衣藻而言，藻菌混合在保持對酯類高利用率的同時，大幅度提升了對碳水化合物的利用程度；而與單獨(dú)的凝結(jié)芽孢桿菌相比，藻菌混合后保持了對碳水化合物的高利用率，同時酯類利用率也得到了提高?？傮w看來，酯類和碳水化合物具備作為藻菌共代謝體系營養(yǎng)物的潛力。

在對31種碳源利用能力的分析中，藻菌混合對丙酮酸甲酯、D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷和N-乙?；?D-葡萄糖胺的利用效率最高，其中兩種碳源為葡萄糖衍生物，說明萊茵衣藻-芽孢桿菌的藻菌共生系統(tǒng)可能對葡萄糖衍生物類碳源具有偏好性。SHI等[16]研究表明，通過添加葡萄糖、乳糖等生長基質(zhì)可以加快微生物對難降解物質(zhì)的降解速率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為藻菌共生系統(tǒng)處理養(yǎng)殖廢水的共代謝碳源的選擇提供了方向。

2.3 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統(tǒng)的影響

葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統(tǒng)處理養(yǎng)殖廢水的影響見圖3。

從圖3可以看出，添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸可以顯著提高藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的處理效果，連續(xù)培養(yǎng)5 d后養(yǎng)殖廢水中COD、氨氮、TN、TP去除率分別從63.21%、60.68%、58.58%、80.49%提高到72.47%、91.07%、96.65%和89.29%。

圖3 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統(tǒng)處理養(yǎng)殖廢水的影響

與無添加的藻菌共生系統(tǒng)相比，葡萄糖共代謝作用提升了藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的處理效果。添加葡萄糖的藻菌共生系統(tǒng)COD去除率在培養(yǎng)第3天達(dá)到最高值(77.26%)，比無添加的藻菌共生系統(tǒng)提高11.98百分點(diǎn)；氨氮去除率也在培養(yǎng)第3天達(dá)到最大值68.65%，而無添加的藻菌共生系統(tǒng)氨氮去除率最大只有60.68%；無添加藻菌共生系統(tǒng)對TN的最大去除率僅為58.58%，而添加葡萄糖后TN最大去除率提高到67.16%；添加葡萄糖的藻菌共生系統(tǒng)在培養(yǎng)第1天TP去除率就快速升高并趨于平穩(wěn)，在第4天高達(dá)95.91%，而無添加的藻菌共生系統(tǒng)TP的去除率最高為80.49%。進(jìn)一步對同時添加葡萄糖和L-丙氨酸的藻菌共生系統(tǒng)進(jìn)行分析，該培養(yǎng)系統(tǒng)對COD、TP的最大去除率分別為72.47%、89.29%，比僅添加葡萄糖的藻菌共生系統(tǒng)分別低4.79百分點(diǎn)、6.62百分點(diǎn)；但該系統(tǒng)對TN和氨氮去除效果提升明顯，TN和氨氮的最大去除率分別為96.65%、91.07%，與添加葡萄糖的藻菌共生系統(tǒng)相比，分別提高了29.49百分點(diǎn)、22.42百分點(diǎn)?？梢姡琇-丙氨酸的添加未能提高菌藻共生系統(tǒng)對TP和COD的去除效果，但TN和氨氮的去除率明顯上升。凝結(jié)芽孢桿菌具備降解養(yǎng)殖水體中氨氮的潛能，說明L-丙氨酸可能對藻菌共生系統(tǒng)中微藻生長無明顯作用，但對凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生了促進(jìn)作用。

2.4 葡萄糖和L-丙氨酸對萊茵衣藻的影響

葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統(tǒng)中萊茵衣藻的影響見圖4。

微藻生物量可以通過葉綠素含量的變化反映[17]。由圖4可見，藻菌共生系統(tǒng)中添加葡萄糖后，萊茵衣藻葉綠素含量明顯增加，即微藻生物量增加，葡萄糖作為輔助碳源促進(jìn)了微藻生物量的積累，從而提高系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)的去除能力。L-丙氨酸等游離氨基酸也可以被微藻直接利用[18]，但同時添加葡萄糖和L-丙氨酸后萊茵衣藻的生物量要低于僅添加葡萄糖的藻菌共生系統(tǒng)。

圖4 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統(tǒng)中萊茵衣藻生長的影響

葉綠素?zé)晒饪稍诓黄茐幕铙w微藻的情況下反映其光合活性，呈現(xiàn)光合作用中微藻光合生理狀況與環(huán)境脅迫關(guān)系[19-20]。根據(jù)測試結(jié)果，萊茵衣藻細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm初始值為0.83，處理養(yǎng)殖廢水后Fv/Fm逐漸下降，但培養(yǎng)第5天時Fv/Fm仍穩(wěn)定在0.6～0.8，添加葡萄糖以及添加葡萄糖和L-丙氨酸對萊茵衣藻光合活性無明顯影響，培養(yǎng)第5天時Fv/Fm分別為0.65、0.71，說明添加葡萄糖和L-丙氨酸后微藻仍可以保持良好的光合生理狀態(tài)，微藻自身光合活性并未受到影響。

2.5 葡萄糖和L-丙氨酸對凝結(jié)芽孢桿菌的影響

由圖5(a)可見，相比于無添加的藻菌共生系統(tǒng)，添加葡萄糖的藻菌共生系統(tǒng)凝結(jié)芽孢桿菌的細(xì)胞數(shù)量在培養(yǎng)第1天顯著增加，從1.21×105cfu/mL增加到2.97×105cfu/mL，而同時加入葡萄糖和L-丙氨酸的藻菌共生系統(tǒng)在培養(yǎng)第1天凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步提高到7.17×105cfu/mL，但在培養(yǎng)第2天，3個系統(tǒng)中凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞數(shù)量均大幅下降。由圖5(b)可見，藻菌共生系統(tǒng)對葡萄糖利用速率很快，單獨(dú)或與L-丙氨酸同時添加葡萄糖后，藻菌共生系統(tǒng)中的葡萄糖在培養(yǎng)第2天分別降至0.092、0.116 g/L，此時藻菌共生系統(tǒng)中凝結(jié)芽孢桿菌幾乎不能生長，說明養(yǎng)殖廢水中的營養(yǎng)體系不利于凝結(jié)芽孢桿菌的生長，葡萄糖可以作為藻菌共生系統(tǒng)的輔助碳源但很快被消耗殆盡。在添加L-丙氨酸后，與僅添加葡萄糖的藻菌共生系統(tǒng)相比，萊茵衣藻生物量略微下降(見圖4)，可能因?yàn)槲⒘縇-丙氨酸作為凝結(jié)芽孢桿菌萌發(fā)劑促進(jìn)了凝結(jié)芽孢桿菌萌發(fā)，消耗了部分葡萄糖，從而與萊茵衣藻形成了營養(yǎng)競爭關(guān)系。

圖5 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統(tǒng)中凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

葡萄糖能夠充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌的生長，而L-丙氨酸作為凝結(jié)芽孢桿菌的萌發(fā)劑，可與共萌發(fā)物如糖、核苷和其他氨基酸等加速凝結(jié)芽孢桿菌的萌發(fā)[21]， YASUDA等[22]研究表明，葡萄糖可以通過協(xié)同作用增強(qiáng)L-丙氨酸結(jié)合親和力，提升凝結(jié)芽孢桿菌萌發(fā)率。在本研究中，葡萄糖和L-丙氨酸添加顯著提高了藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的處理效果，說明葡萄糖能促進(jìn)藻菌的共代謝作用，微量L-丙氨酸極大程度地刺激了藻菌共生系統(tǒng)中凝結(jié)芽孢桿菌的生長，與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果一致，并且適量的葡萄糖和L-丙氨酸不會對藻菌共生系統(tǒng)處理養(yǎng)殖廢水產(chǎn)生二次污染。

3 結(jié) 論

(1) 相較于萊茵衣藻的純藻系統(tǒng)，萊茵衣藻-凝結(jié)芽孢桿菌的藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水的凈化效果并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。酯類和碳水化合物具備作為藻菌共代謝體系營養(yǎng)物的潛力，萊茵衣藻-凝結(jié)芽孢桿菌的藻菌共生系統(tǒng)可能對葡萄糖衍生物類碳源具有偏好性。

(2) 向藻菌共生系統(tǒng)中添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸可以顯著提高養(yǎng)殖廢水凈化效果，連續(xù)培養(yǎng)5 d后養(yǎng)殖廢水COD、氨氮、TN和TP去除率可分別從63.21%、60.68%、58.58%、80.49%提高到72.47%、91.07%、96.65%和89.29%。

(3) 在萊茵衣藻-凝結(jié)芽孢桿菌共生系統(tǒng)中，添加葡萄糖和L-丙氨酸后微藻仍可以保持良好的光合生理狀態(tài)，微藻自身光合活性并未受到影響。葡萄糖可以促進(jìn)萊茵衣藻和凝結(jié)芽孢桿菌營養(yǎng)體生物量的增加，微量的L-丙氨酸可作為凝結(jié)芽孢桿菌的萌發(fā)劑，刺激凝結(jié)芽孢桿菌的萌發(fā)，加速藻菌共生系統(tǒng)對養(yǎng)殖廢水中有機(jī)物的利用。