沈 潔，陳俊良，趙田琦，謝冰清，呂冬梅，何 蕓

1.西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室（瀘州 646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科（瀘州 646000）

種植修復(fù)是目前被廣泛認(rèn)可和最為流行的口腔修復(fù)體之一。即刻加載種植是指種植體植入后，一周內(nèi)即行上部修復(fù)并加載行使功能。與傳統(tǒng)延遲加載種植（需等待3～6個月的骨整合完成后才能加載）相比，即刻加載種植大大縮短了療程，減少了就診次數(shù)，即時解決了患者的美觀、咀嚼和語音等問題[1-3]。臨床和動物研究表明：即刻加載種植與傳統(tǒng)延遲加載種植具有相似的種植體穩(wěn)定性和成功率，其種植體邊緣骨組織和軟組織變化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[4-6]。但是，即刻加載作用下的骨改建對骨整合是促進(jìn)還是妨礙卻存在爭議，其中重要的原因可能是，現(xiàn)有的人群/動物研究模型干擾因素多，載荷不可控。

動物模型操作性和可控性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究，代替人體模型探討人類疾病的發(fā)病和防治。就口腔種植而言，國內(nèi)外大量學(xué)者，以狗、兔、老鼠等動物為模型進(jìn)行相關(guān)研究，將種植體植入其頜骨或其他長骨[7-9]。但是，這些動物模型結(jié)果不一，問題較多：①種植體植入、取出和加力等，持續(xù)給動物帶來傷害，還會產(chǎn)生額外的應(yīng)力，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；②這些研究往往在動物的頜骨或長骨等部位植入種植體，采用的加力方式難以準(zhǔn)確控制，且動物的進(jìn)食和日常生活可能影響加力；③實(shí)驗(yàn)完成后，動物往往需要處死。

鹿角是哺乳動物中唯一可完全再生的器官，研究表明在快速生長期其組織結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成成分和物理特性與骨組織相同[10-12]。這提示，鹿角可以作為植入床用于種植體相關(guān)研究。本研究擬利用專用可控加載設(shè)備對植入鹿角的種植體進(jìn)行即刻加載，建立新型即刻加載種植研究動物模型，對比分析即刻加載和不加載對種植體及其周圍骨組織改建的作用，旨在探索新型的、可再生的、可控的、易操作的動物模型用于即刻加載種植體及其周圍骨改建研究，為進(jìn)一步揭示即刻加載種植體周圍骨改建的動態(tài)過程及其機(jī)制和指導(dǎo)臨床種植修復(fù)體加載策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

在夏季鹿角處于快速生長期時，選取四川省宜賓市欣榮梅花鹿養(yǎng)殖場的健康成年雄性梅花鹿6 只，體重：100～130 kg；年齡：約4歲。動物實(shí)驗(yàn)程序按照赫爾辛基倫理標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，并獲得西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：2019002）。

1.2 儀器設(shè)備

正置相差顯微鏡BX43 和SZX7（Olympus，日本）；Micro-CT（平生醫(yī)療Venus，中國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

所有動物按照標(biāo)準(zhǔn)程序采用二氧化碳式氣槍近距離發(fā)射含1.2～1.5 mL Hellabrunn’s 混合麻醉劑（每毫升包含100 mg氯胺酮和125 mg甲苯噻嗪）的飛鏢對動物進(jìn)行麻醉[13]。麻醉顯效后，將動物搬運(yùn)到手術(shù)室置于手術(shù)臺上，手術(shù)區(qū)域（左側(cè)鹿角）使用75%酒精和1%碘酊消毒后，2%利多卡因3.0～5.0 mL 行局部浸潤麻醉。在鹿角鄰近根部約5.0 cm的位置做切口，切開鹿茸并翻瓣，按照種植體備洞要求逐級備洞，隨后植入3.5×10.0 mm 的種植體（Dentium Co.Ltd.，Seoul，Korea）。每只梅花鹿均僅在其左側(cè)的鹿角植入2枚種植體，2枚種植體相距3.0 cm 左右，其中一枚種植體用專用的加載設(shè)備進(jìn)行即刻加載[14]，該加力設(shè)備通過三枚距離為120°的螺釘穩(wěn)定地固定于鹿角上，通過配置一個12 V的鋰電源，其工作頭可以對種植體基樁進(jìn)行加載。本研究中調(diào)整其加載方向?yàn)榇怪庇诜N植體長軸，力值大小為10 N；而另一枚種植體不加載作為對照，見圖1。然后用可吸收線縫合鹿茸。術(shù)后4周、8周，分別按照隨機(jī)數(shù)字表選取3只動物，用環(huán)鉆取標(biāo)本，每只動物取種植體及其周圍鹿角組織的標(biāo)本2個。將標(biāo)本置于4%福爾馬林中固定。鹿角的創(chuàng)口，用骨蠟封閉。

圖1 種植體植入鹿角和即刻加載Figure 1 Implants were inserted into the antlers and immediate loading

術(shù)后每天觀察動物傷口及其活動情況，如傷口有無感染等并發(fā)癥、動物全身身體情況、有無異常行為、進(jìn)食情況、鹿角生長情況以及種植體有無松動脫落等。

1.4 影像學(xué)檢查

Micro-CT（Venus VNC-102，蘇州平生醫(yī)療，中國）掃描標(biāo)本，掃描參數(shù)為電壓90 KVp，電流0.06 mA，分辨率20.0 μm，保持種植體與掃描平面垂直，掃描完成后行三維重建。

選取各時間點(diǎn)各組種植體周圍1.0 mm 鹿角組織，進(jìn)行骨計(jì)量學(xué)分析，見圖2。主要分析指標(biāo)：種植體-骨結(jié)合率（bone-implant contact，BIC）、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp等。

圖2 Micro-CT選取種植體周圍1.0 mm的鹿角組織行骨計(jì)量學(xué)分析Figure 2 Micro-CT was used to select 1.0 mm antler tissue around the implant for bone metrology analysis

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 進(jìn)行分析，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 以（x±s）表示。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較同時間點(diǎn)加載和未加載組上述參數(shù)的差異，并比較兩組組內(nèi)不同時間點(diǎn)上述參數(shù)的差異。P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

術(shù)后傷口無感染、腫脹等并發(fā)癥，動物進(jìn)食正常，全身身體情況和活動無異常，植入種植體體側(cè)鹿角的生長與對側(cè)無變化，鹿角可以在冬天自行脫落，在第二年的春天又開始生長。整個觀察過程中，種植體和加載設(shè)備無松動脫落等。

2.1 影像學(xué)觀察結(jié)果

種植體周圍鹿角組織的影像學(xué)觀察，見圖3。隨著術(shù)后時間的延長，種植體周圍的鹿角組織逐漸長入種植體螺紋，種植體周圍鹿角組織的新生骨數(shù)量逐漸增加，加載組種植體周圍鹿角組織較未加載組致密，特別是8周加載組可見種植頸部大量高密度的鹿角組織

圖3 種植體周圍1.0 mm鹿角組織的Micro-CT分析結(jié)果Figure 3 Micro-CTanalysisresultsof1.0mmantlertissuearoundimplant

2.1.1 BV/TV 值結(jié)果 隨著術(shù)后時間的延長，未加載和加載組的BV/TV 值均逐漸增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。同一時間點(diǎn)，加載組的BV/TV 值均大于未加載組，但是其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表1。

表1 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織的BV/TV（%）值Table 1 BV/TV(%)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

表1 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織的BV/TV（%）值Table 1 BV/TV(%)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

2.1.2 Tb.Th值結(jié)果 隨著術(shù)后時間的延長，未加載和加載組的Tb.Th值均逐漸增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。同一時間點(diǎn)，加載組的BV/TV 值均大于未加載組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表2。

表2 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織的Tb.Th（mm）值Table 2 TB.Th(mm)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

表2 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織的Tb.Th（mm）值Table 2 TB.Th(mm)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

2.1.3 Tb.Sp 值結(jié)果 隨著術(shù)后時間的延長，未加載和加載組的Tb.Sp值均逐漸減小，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。同一時間點(diǎn)，加載組的Tb.Sp值均小于未加載組，其中4周時未加載和加載組的Tb.Sp值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表3。

表3 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織Tb.Sp（mm）值Table 3 TB.Sp(mm)values of antler tissue around implant at different time points in each group（，n=3）

表3 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織Tb.Sp（mm）值Table 3 TB.Sp(mm)values of antler tissue around implant at different time points in each group（，n=3）

2.1.4 Tb.N值結(jié)果 隨著術(shù)后時間的延長，未加載和加載組的Tb.N 值均逐漸增加，其中未加載組4 周和8周的Tb.N值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。同一時間點(diǎn)，加載組的Tb.N值均大于未加載組，其中4周時加載組和未加載組的Tb.N 值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表4。

表4 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織的Tb.N（mm-1）值Table 4 Tb.N(mm-1)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

表4 各組不同時間點(diǎn)種植體周圍鹿角組織的Tb.N（mm-1）值Table 4 Tb.N(mm-1)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

3 討論

鹿角是顱骨的突起，其再生周期為一年，周期通常開始于春季，在夏季迎來快速增長期和側(cè)枝形成期，并在夏末秋初的時候從鹿角根部逐漸向尖端開始鈣化；鈣化完成后，隨著血供和神經(jīng)組織的丟失，鹿茸逐漸萎縮、脫落。最后，失去了鹿茸覆蓋的鹿角在春季脫落，又開始下一個周期[15]。鹿角的快速生長期為3～4個月[16]，這一時期與種植體的骨整合時間較為吻合，因此可用于觀察種植體周圍動態(tài)骨改建。鹿角在快速生長期其長度逐漸變長，適合種植體植入和觀察的時間大約為2～3 個月。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹿角的骨改建比人類牙槽骨改建活躍，即刻加載種植體植入6 周后可形成骨整合[17]，因此本文選取了4周、8周作為觀察時間點(diǎn)。本研究以鹿角為植入床，探討即刻加載對種植體周圍骨改建的作用，成功的建立了這一新型可再生動物模型，研究表明該動物模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：①整個實(shí)驗(yàn)不涉及對動物的處死，鹿角可以再生以供循環(huán)使用，這對動物的傷害可以降到最低；②鹿性格溫和，飼養(yǎng)容易，鹿角在快速生長期其血運(yùn)循環(huán)豐富，鹿角的尺寸允許植入臨床常用的牙種植體；③鹿角暴露在外，行種植體植入術(shù)以及取材等都比其他部位，如頜骨、顱骨、脛骨等，更加簡單方便；④鹿角沒有肌肉的附著，對種植體即刻加載時可以排除肌肉等其他力學(xué)因素的影響。

Micro-CT 技術(shù)是非破壞性的微米級顯微3D 成像技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于骨微觀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)和臨床研究相關(guān)研究[18-19]。相對于傳統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)測量方法，Micro-CT 技術(shù)具有無破壞性、成像迅速、高精度的特點(diǎn)，獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行3D 重建和分析時，可以根據(jù)需要選定合適的目標(biāo)區(qū)域，并根據(jù)灰度閾值對不同密度的結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確地分析和計(jì)算，還可以用于后期的數(shù)字化模擬研究，這可以更為全面立體觀察組織結(jié)構(gòu)的三維形態(tài)學(xué)特征和變化，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供可靠的理論參考[20-22]。本研究采用Micro-CT 觀察比較植入鹿角的即刻加載和未加載種植體周圍鹿角組織的微觀結(jié)構(gòu)變化，以揭示即刻加載對種植體周圍骨改建的作用。研究表明：種植體周圍1.0 mm左右的組織的骨改建是種植體成敗的關(guān)鍵，種植體的骨結(jié)合失敗和種植體松動脫落常與該部位的骨改建密切相關(guān)[23]。因此，本研究選取種植體周圍1.0 mm的鹿角組織進(jìn)行骨計(jì)量學(xué)分析。研究結(jié)果表明：隨著術(shù)后時間的延長，種植體周圍的鹿角組織逐漸長入種植體螺紋，種植體周圍鹿角組織的BV/TV，Tb.Th 和Tb.N 值均逐漸增加，而Tb.Sp 值則不斷減小。這說明隨著愈合時間的增加種植體周圍的鹿角組織的骨形成逐漸活躍。加載組和未加載組比較結(jié)果可見，同一時間點(diǎn)，加載組種植體周圍1.0 mm 的鹿角組織的BV/TV，Tb.Th和Tb.N值均大于未加載組，其中二組的Tb.Th值以及4周的Tb.N值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而加載組Tb.Sp 值則小于未加載組，其中4 周時未加載和加載組的Tb.Sp 值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。這說明，種植體植入后即刻可控的小力值加載有利于種植體周圍的骨改建和骨形成，可能可以在早期加速種植體與周圍骨組織的骨整合形成。本研究結(jié)果BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和Tb.N的范圍值與其他動物模型的研究結(jié)果具有相似之處。HUANG等[24]運(yùn)用Micro-CT 以比格犬下頜骨為植入床比較富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）和貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）對種植體周圍骨改建的作用，結(jié)果表明術(shù)后各組BV/TV 值范圍為（41.0 ± 10.7）%～（72.9 ± 5.5）%；Tb.Th 值范圍為（0.18 ± 0.01）mm～（0.24 ± 0.03）mm；Tb.Sp 值范圍為（0.22 ± 0.04）mm～（0.51±0.11）mm。TAN 等[25]以兔的脛骨為植入床探討辛伐他丁對種植體周圍骨改建的作用，結(jié)果表明術(shù)后1周各實(shí)驗(yàn)組BV/TV 值范圍為（37.23±2.48）%～（58.77± 4.20）%；Tb.Th 值范圍為（0.14 ± 0.01）mm～（0.16 ±0.01）mm；Tb.N 值范圍為（2.66 ± 0.44）mm-1～（5.64 ±0.26）mm-1；Tb.Sp 值范圍為（0.26 ± 0.01）mm～（0.41 ±0.02）mm。

本研究也有其局限性，首先作為一個探索性研究，其樣本量不多。其次鹿角的獲取和飼養(yǎng)相對于鼠、兔、狗等其他動物而言，需要專門的場所，且梅花鹿多為野外放養(yǎng)。后期的研究我們將加大樣本量，并增加組織學(xué)、分子生物學(xué)等研究手段。

4 結(jié)論

本研究成功建立了鹿角這一新型的、可再生的、可控的和易操作的動物模型，并進(jìn)一步用于即刻加載種植體及其周圍骨改建研究，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)動物模型的建立提供了新思路。同時，研究進(jìn)一步證實(shí)了可控的適當(dāng)?shù)募纯碳虞d可以促進(jìn)種植體周圍的骨改建和骨結(jié)合，這為指導(dǎo)臨床種植修復(fù)體加載策略奠定了基礎(chǔ)。

（利益沖突：無）