徐藹宣 于 耀 王鈺明 解競靜 鄒 軼 譚會澤 黃艷玲 趙 峰*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用重點實驗室，成都610041；2.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；3.溫氏食品集團股份有限公司，云浮527400)

在體外模擬雞對蛋白質的消化試驗中，模擬小腸液(simulated small intestinal fluid，SSIF)相對于體內小腸液(endogenous small intestinal fluid，ESIF)的仿真程度對整個胃-小腸的仿生消化有著重要的影響。比較2種小腸液在體外對飼料消化后蛋白質分子量分布的差異是檢驗SSIF是否接近ESIF的重要基礎。在體外模擬蛋白質的消化試驗中，SSIF通常采用試劑級胰液素配制[1-3]，體外模擬消化的效果通過其氨基酸消化率與體內法測值的接近程度或相關性判斷[1-4]。然而，僅從氨基酸消化率的差異仍難以說明體外消化對蛋白質的水解程度與體內消化程度的相似性。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是分離、鑒定蛋白質的通用方法[5]。在飼料蛋白質、消化酶與植酸的互作[6]，瘤胃液對不同保護處理豆粕蛋白質的降解[7]，酶菌復合處理對麩皮蛋白質降解的影響[8]等研究中，SDS-PAGE可以清晰地分辨試驗處理對蛋白質分子量變化的影響。多個實驗室間同時采用SDS-PAGE分析胃蛋白酶體外消化食品后產物的分子量分布，獲得測定結果的一致性最高達91%[9]。近年來，在體外模擬飼料或食品蛋白質的消化中，消化液水解蛋白質后的上清液采用凝膠電泳可以進一步分析不同處理條件下蛋白質降解后的分子量大小分布，并可根據(jù)分子量鑒定蛋白質片段的性質[10-12]。因此，通過凝膠電泳鑒別體外模擬消化后未消化物中蛋白質片段大小的相似性，可以用于比較模擬消化液與體內消化液對蛋白質水解特性的差異。為此，本試驗采用雞ESIF和SSIF分別對5種常用蛋白質飼料原料進行仿生消化后，通過SDS-PAGE分析殘渣中蛋白質片段分布的差異，以明確SSIF對ESIF水解蛋白質程度的代表性。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用兩樣本比較試驗設計，即小腸液設2個處理，分別為雞ESIF和SSIF。ESIF為在卵黃囊憩室附近安裝空腸套管的成年京星黃羽肉雞(中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種)收集食糜后在4 ℃、1 250×g下離心10 min獲得的上清小腸液；SSIF是將成年京星黃羽肉雞的小腸液根據(jù)黨方坤[13]的方法純化消化酶蛋白質，經凍干成粉劑后，加入少量的胰蛋白酶(Amresco 0785)和糜蛋白酶(Amresco 0164)制備而成。按Dahlqvist[14]、Rick等[15-16]描述的方法分別測定淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，然后，根據(jù)與雞體內空腸液消化酶的活性相等的原則，配制SSIF。ESIF和SSIF中淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性分別為401、26和14 U/mL。以豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉(由溫氏食品集團股份有限公司提供)和酪蛋白(由甘肅華羚乳品股份有限公司提供)為蛋白質飼料原料的代表性底物。在SDS-Ⅱ單胃動物仿生消化系統(tǒng)(湖南中本智能科技發(fā)展有限公司生產)中以2種小腸液對每個飼料原料進行仿生消化，每個處理5個重復，每個重復1根消化管。

1.2 飼料原料及其營養(yǎng)水平

采集飼用豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉及食品級酪蛋白作為小腸液仿生消化的底物。按GB/T 6435—2014[17]測定樣品中水分含量并計算其干物質含量，分別按GB/T 6432—2018[18]、GB/T 6433—2006[19]、GB/T 20806—2006[20]和NY/T 1459—2007[21]測定樣品中粗蛋白質、粗脂肪、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量；飼料原料總能(GE)的測定根據(jù)ISO 9831∶19982[22]的方法進行。5種飼料原料的營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料原料的營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.3 雞小腸仿生消化

雞仿生消化過程參照Zhao等[23]的描述進行。將1 g蛋白質飼料原料裝入透析袋中，然后加入20 mL小腸液。在仿生消化系統(tǒng)中，溫度設置為41 ℃，小腸前段消化4 h，小腸后段消化4 h。其中小腸前段緩沖液為0.2 mol/L、pH為6.50的磷酸鹽溶液，小腸后段緩沖液為0.2 mol/L、pH為7.99的磷酸鹽溶液。消化結束后，將透析袋殘渣轉移至培養(yǎng)皿中，經冷凍干燥機干燥后制備成樣品，裝入15 mL離心管中-20 ℃保存。

1.4 仿生消化殘渣蛋白質SDS-PAGE分析

仿生消化殘渣中蛋白質的提?。簠⒄崭凳绾甑萚24]的方法，從每個仿生消化的殘渣樣品中取0.2 mg加入5 mL 0.15 mol/L的生理鹽水，在室溫下回旋混合30 min后，以1 000×g離心10 min，取上清液再以2 700×g離心10 min，得到上清液，用于凝膠電泳。

SDS-PAGE分析：將160 μL蛋白質提取液與40 μL SDS-PAGE Loading buffer(CWBIO，貨號：CW0027S)混合成200 μL，95 ℃金屬浴加熱裂解5 min，恢復至室溫后取30 μL注入膠孔。將凝膠(GenScript，4%～20% Mops分離膠)保持在110 mA的恒定電流下，直到buffer染料到達凝膠底部為止。使用考馬斯亮藍溶液完成蛋白質染色。使用500 mL脫色液(50 mL甲醇+50 mL乙酸+400 mL蒸餾水)溶液脫色，然后使用GS-900 Calibrated Densitometer(Bio-Red Laboratories，Inc)圖像系統(tǒng)進行凝膠成像。通過和標準蛋白(BiostepTMPrestained Protain Marker,Tanon,180-6003)SDS-PAGE的結果進行比較，即可獲得仿生消化殘渣中蛋白質分子量的分布情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Quantity One 4.2軟件對小腸液消化的飼料殘渣蛋白質提取液進行SDS-PAGE后的蛋白質分子量分布的相似性進行比較(Dice相似性系數(shù))。使用Image Lab 5.2.1(Bio-Red Laboratories，Inc)軟件獲得不同分子量蛋白質的占比，采用SAS 9.2的MEANS模塊計算基本統(tǒng)計量，t檢驗模塊對每一個飼料原料用2種小腸液消化后殘渣蛋白質分子量分布的占比進行兩樣本比較。

2 結果與分析

2.1 雞ESIF和SSFI對飼料仿生消化殘渣蛋白質片段的相似性比較

由圖1可知，在雞ESIF和SSIF淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性都一致的條件下，對豆粕消化殘渣的蛋白質提取液通過SDS-PAGE后，蛋白質片段均分布在132 ku以下，其中ESIF的消化殘渣共計分布了10個條帶[5個重復相似性變異系數(shù)(CV)=6.92%]，SSIF的消化殘渣共計分布了11個條帶(5個重復相似性CV=4.94%)，兩者的相似性為69.9%；棉籽粕消化殘渣的蛋白質提取液通過SDS-PAGE后，蛋白質片段均分布在190 ku以下，其中ESIF的消化殘渣共計分布了8個條帶(5個重復相似性CV=7.72%)，SSIF的消化殘渣共計分布了9個條帶(5個重復相似性CV=6.57%)，兩者的相似性為30.8%；菜籽粕消化殘渣的蛋白質提取液通過SDS-PAGE后，蛋白質片段均分布在126 ku以下，其中ESIF的消化殘渣共計分布了10個條帶(5個重復相似性CV=4.84%)，SSIF的消化殘渣共計分布了12個條帶(5個重復相似性CV=1.96%)，兩者的相似性為90.1%；玉米蛋白粉消化殘渣的蛋白質提取液通過SDS-PAGE后，蛋白質片段均分布在122 ku以下，其中ESIF的消化殘渣共計分布了7個條帶(5個重復相似性CV=5.01%)，SSIF的消化殘渣共計分布了8個條帶(5個重復相似性CV=4.03%)，兩者相似性為77.7%；酪蛋白消化殘渣的蛋白質提取液通過SDS-PAGE后，蛋白質片段均分布在118 ku以下，其中ESIF的消化殘渣共計分布了9個條帶(5個重復相似性CV=10.91%)，SSIF的消化殘渣共計分布了10個條帶(5個重復相似性CV=1.61%)，兩者的相似性為74.2%。

2.2 雞ESIF和SSFI對飼料仿生消化殘渣蛋白質分子量分布的差異比較

由表2可知，在小腸液對飼料仿生消化后的殘渣蛋白質提取液中，ESIF消化豆粕殘渣中分子量為21～22 ku、24～25 ku和63～74 ku的蛋白質片段占比極顯著高于SSIF(P<0.01)，而為118～132 ku的蛋白質片段占比極顯著低于SSIF(P<0.01)；ESIF消化棉籽粕殘渣中分子量為118～132 ku的蛋白質片段占比極顯著低于SSIF(P<0.01)；ESIF消化菜籽粕殘渣中分子量為39～43 ku和63～74 ku的蛋白質片段占比顯著或極顯著高于SSIF(P<0.05或P<0.01)，而為104～117 ku和118～132 ku的蛋白質片段占比極顯著或顯著低于SSIF(P<0.01或P<0.05)；ESIF消化玉米蛋白粉殘渣中分子量為13～15 ku和24～25 ku的蛋白質片段占比極顯著或顯著高于SSIF(P<0.01或P<0.05)；ESIF消化酪蛋白殘渣中分子量為13～15 ku和24～25 ku的蛋白質片段占比顯著或極顯著高于SSIF(P<0.05或P<0.01)，而為17～20 ku、53～57 ku和84～94 ku的蛋白質片段占比顯著或極顯著低于SSIF(P<0.05或P<0.01)。

3 討 論

3.1 利用SDS-PAGE分析小腸液對飼料消化后殘渣中蛋白質片段分布的可行性

在比較雞SSIF與ESIF對飼料消化能力的差異上，傳統(tǒng)的方法是在體外模擬消化下比較兩者對同一個飼料樣品能量[25-27]或蛋白質[28]水解率的差異。然而，飼料中的供能物質或蛋白質均是由不同組分的有機物組成，SSIF相對于ESIF消化能力的差異僅從對飼料養(yǎng)分的水解率來比較仍難以說明水解后底物分子變化的差異。在飼料蛋白質的消化中，分子量由大變小，通過SDS-PAGE可以較好地檢測蛋白質分子量的分布情況。由于凝膠中十二烷基硫酸鈉使蛋白質樣品帶上了大量的負電荷，從而掩蓋了蛋白質分子原有的電荷量，因此，通過SDS-PAGE可以使不同分子量的蛋白質分離。Rosa-Sibakov等[11]、Duodu等[29]、Collier等[30]和Nurfaidah等[31]就利用SDS-PAGE鑒別生化反應途徑中蛋白質的釋放量、加工工藝對飼料蛋白質變化的影響以及動物糞便中不同分子量蛋白質排泄量的變化。由此可見，在飼料蛋白質的消化過程研究中，SDS-PAGE正成為鑒別不同大小蛋白質的手段。在SDS-PAGE分離飼料來源的蛋白質分子中，如何提取蛋白質非常關鍵。從植物性飼料原料或食物中提取蛋白質的處理因樣品的特性不同可能需要采用不同的方式，如Sousa等[12]從小麥麩、高粱、花生、木豆和乳清中提取蛋白質的方法在溶劑的選擇、蛋白質的沉淀等步驟上各不相同。本試驗也曾采用Elkin等[32]的方法，對仿生消化殘渣中的蛋白質用緩沖液(0.012 5 mol/L硼酸鈉、1%十二烷基硫酸鈉、10 mmol/L苯甲基磺酰氟、2%β-巰基乙醇，pH=10)在室溫下震蕩提取2 h，再10 000×g離心20 min后取上清液。然而，SDS-PAGE染色后未出現(xiàn)任何蛋白質條帶，而采用傅淑宏等[24]的方法以生理鹽水溶液提取仿生消化殘渣則能顯示蛋白質條帶?？紤]到本試驗比較2種小腸液對飼料樣品進行消化后殘渣中蛋白質片段的差異，雖然生理鹽水沒有提取殘渣中所有的蛋白質，但在相同的提取條件下，可以說明2種小腸液對飼料消化后殘渣中溶解于生理鹽水的蛋白質分子量大小的差異。

圖中第1條和第12條泳道為參照標記(marker)，第2、3、4、5和6泳道為雞ESIF消化殘渣，第7、8、9、10和11泳道為雞SSIF消化殘渣。圖1-1a、圖1-2a、圖1-3a、圖1-4a和圖1-5a分別為豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉和酪蛋白消化殘渣蛋白質的電泳條帶。圖1-1b、圖1-2b、圖1-3b、圖1-4b和圖1-5b分別為豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉和酪蛋白消化殘渣蛋白質的電泳條帶通過Quantity One軟件進行相似性分析。No.:條帶總數(shù)；Mw：分子量。

表2 雞ESIF和SSFI對飼料仿生消化殘渣蛋白質分子量分布的差異比較

3.2 SSIF對ESIF的仿真程度

在動物體內消化中，小腸是飼料養(yǎng)分消化吸收的主要場所。目前，研究人員通常采用胰液素[33-34]或幾種單一消化酶試劑[23]混合后制備SSIF，而對SSIF與ESIF在酶學特性及消化能力的差異鮮見相關報道。Zhang等[35]采用從鴨空腸液提取消化酶制備SSIF，相對于鴨ESIF對玉米、小麥、豆粕和棉籽粕能量消化率的比值為96%～101%，其中2種腸液對棉籽粕的能量消化率相差稍大(比值為96%～98%)。任立芹[36]研究表明，采用淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶制備的SSIF對16個雞飼料樣品進行胃-小腸2階段模擬消化后的氨基酸消化率比體內消化率約低8.5%。而SSIF相對于ESIF對飼料水解后蛋白質分子量變化的差異，尚顯見相關報道。本研究中，SSIF與ESIF對5個飼料樣品進行水解后，豆粕、菜籽粕、玉米蛋白粉和酪蛋白消化殘渣中蛋白質分子量分布的相似性為69.9%～90.1%，而棉籽粕殘渣中蛋白質分子量分布的相似性僅為30.8%。這主要是由于ESIF水解飼料后殘渣中分子量相對低的蛋白質占比高，而SSIF水解殘渣中分子量相對高的蛋白質占比高，這一現(xiàn)象在棉籽粕中尤為明顯。上述結果表明，SSIF與ESIF對飼料蛋白質水解后分子量分布的差異可能遠大于仿生消化法測定蛋白質消化率的差異。ESIF水解飼料后殘渣的蛋白質分子量比SSIF更低，且對不同的飼料原料表現(xiàn)的差異不一致，這也部分說明了Zhang等[35]的試驗中SSIF與ESIF在棉籽粕的消化率上差異大于其他飼料，以及任立芹[36]的試驗中模擬消化測定的雞飼料氨基酸消化率低于體內法測值。在本研究的關聯(lián)試驗中，雖然SSIF與ESIF在消化液蛋白質的分子量分布相似性高，對玉米淀粉和小麥淀粉中淀粉水解動力學及大豆?jié)饪s蛋白和酪蛋白的蛋白質水解動力學也比較接近，但對飼料粗蛋白質的消化率的差異仍因飼料不同而異(豆粕，3.87%；棉籽粕，3.35%；菜籽粕，-0.32%；玉米蛋白粉，-0.70%；酪蛋白，-1.01%)，且消化率的差異程度與本試驗中消化殘渣蛋白質分子量分布的相似性高低相對應，但粗蛋白質消化率的差異程度遠低于消化殘渣蛋白質分子量分布的相似性。這也表明制備SSIF的消化酶來源及酶學特性與ESIF的細微差異可能會引起蛋白質水解程度較大的差異。

4 結 論

ESIF與SSIF水解飼料后殘渣中蛋白質分子量分布的相似性因飼料來源的不同而呈現(xiàn)較大的差異。ESIF水解飼料后殘渣中分子量相對低的蛋白質占比高，而SSIF水解殘渣中分子量相對高的蛋白質占比高。