王立改 曾延清,2 汪 波,3 譚 朋 陳睿毅 竺奇慧 徐冬冬*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，舟山316000；2.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，舟山316000；3.中國海洋大學(xué)，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266003)

腸道不僅是魚類消化吸收的重要器官，也是其免疫系統(tǒng)的重要組成部分，直接影響魚體健康。魚類腸道由多種細(xì)胞組成，其中，腸道上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell，IECs)是腸道的主要功能細(xì)胞，參與腸道內(nèi)食物的消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等。因此，腸道上皮細(xì)胞是研究腸道生理功能、藥物代謝及病理變化的重要細(xì)胞模型[1]。其中，體外培養(yǎng)腸道上皮細(xì)胞是研究外源物質(zhì)(如營養(yǎng)素)對(duì)腸道上皮細(xì)胞作用及各種致病因素導(dǎo)致腸黏膜病理改變的發(fā)病機(jī)制的重要途徑[2]。因此，建立魚類腸道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法具有非常重要的意義。

目前，魚類腸道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法在多種海、淡水魚類中已有相關(guān)報(bào)道，如斑帶副鱸(Paralabraxmaculatofasciatus)[3]、鯽魚(Carassiusauratus)[1]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[4]、大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[5]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[6]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]等。尤其在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中，Kawano等[8]首次建立了呈上皮樣形態(tài)的腸道細(xì)胞系——RTgutGC細(xì)胞系，已經(jīng)成功傳代100次以上。建立腸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法可為研究魚類腸道健康問題提供重要的體外試驗(yàn)材料。一些學(xué)者利用體外培養(yǎng)的腸道上皮細(xì)胞分析了不同抗?fàn)I養(yǎng)因子[4,6]或植物化學(xué)成分[9]對(duì)其細(xì)胞活力、形態(tài)及功能的影響；在大西洋鱈魚中，學(xué)者們利用腸道上皮細(xì)胞研究了益生菌和海藻酸對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用[5,10]；Antony等[11]則利用虹鱒RTgutGC細(xì)胞系進(jìn)行了魚類營養(yǎng)吸收機(jī)制的研究。因此，體外培養(yǎng)腸道上皮細(xì)胞在魚類營養(yǎng)學(xué)、免疫學(xué)及生理生化等方面的研究中具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

黃姑魚(Nibeaalbiflora)隸屬于鱸形目(Perciformes)，石首魚科(Sciaenidae)，黃姑魚屬(Nibea)，是我國東南沿海重要的海水養(yǎng)殖魚類。其養(yǎng)殖規(guī)模在福建省、浙江省不斷擴(kuò)大，已經(jīng)成為網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要品種。目前，在黃姑魚營養(yǎng)飼料研發(fā)中，我們發(fā)現(xiàn)高比例豆粕飼料會(huì)造成黃姑魚食源性腸道損傷[12]，此外，集約化養(yǎng)殖環(huán)境下腸道病菌性感染經(jīng)常引發(fā)黃姑魚的大量死亡，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。然而，由于缺乏黃姑魚腸道上皮細(xì)胞模型，限制了黃姑魚腸道上皮細(xì)胞的生理功能和病菌致病機(jī)制的進(jìn)一步研究。盡管已經(jīng)在一些魚類上建立了腸道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，但是由于魚種的不同，其所用的細(xì)胞培養(yǎng)條件和方法亦有所不同，所以需要針對(duì)特定的魚種進(jìn)行腸道上皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)條件的摸索工作。因此，本研究旨在建立一種快速有效的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法，為開展黃姑魚腸道功能和病理機(jī)制等研究提供體外腸道上皮細(xì)胞模型，并為海水魚類腸道功能及其相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用黃姑魚取自浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒漁業(yè)科技島，體重為(40.5±2.5) g。取健康活潑的試驗(yàn)魚飼養(yǎng)于含抗生素的水體中，禁食2 d后用于本試驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(371，美國Thermo公司)、倒置顯微成像系統(tǒng)(DMi8，德國Leica公司)、正置熒光顯微鏡(Eclipse C1，日本Nikon公司)、脫色搖床(TSY-B，武漢賽維爾生物科技有限公司)、分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，美國Thermo公司)。

主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國Gibco公司)、Penicillin-Streptomycin雙抗(美國Hyclone公司)、膠原蛋白酶(美國Worthington公司)、透明質(zhì)酸酶(美國Worthington公司)、胰蛋白酶(美國Worthington公司)、DNAase Ⅰ(日本TaKaRa公司)、青霉素G鈉鹽和硫酸鏈霉素(上海生工生物工程有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，G0002，武漢賽維爾生物科技有限公司)、破膜工作液(G1204，武漢賽維爾生物科技有限公司)、牛血清白蛋白(BSA，G5001，武漢賽維爾生物科技有限公司)、一抗[兔來源細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)，武漢賽維爾生物科技有限公司]、二抗[山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG) H&L(Alexa Fluor?488)，武漢賽維爾生物科技有限公司]、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)(G1012，武漢賽維爾生物科技有限公司)、抗熒光淬滅封皮劑(G1401，武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)材料前處理及細(xì)胞分離

黃姑魚腸道上皮細(xì)胞分離方法參照宋增福等[1]和Zhang等[7]的方法，并經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)后作了一定修改。具體方法如下：1)在無菌室中，取禁食2 d后的黃姑魚于托盤中，敲打頭部致死，體表及魚體周圍用70%酒精消毒；2)取出腸道，剪除腸系膜，縱行剪開腸壁，浸沒在含有Penicillin-Streptomycin雙抗的PBS溶液中沖洗數(shù)次，然后加適量DMEM/F12培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下去除腸道上脂肪和腹膜等；3)將腸道轉(zhuǎn)移至加適量(可完全浸沒腸道組織)DMEM/F12培養(yǎng)基的小燒杯中，將腸道組織剪碎至小于1 mm3的組織塊；4)用約3倍體積的DMEM/F12培養(yǎng)基清洗腸道組織塊，4 ℃、200×g離心5 min，重復(fù)3次；5)加入約4倍體積的蛋白酶消化液[胰蛋白酶0.25%、膠原蛋白酶1 mg/mL、透明質(zhì)酸酶0.16 mg/mL、胎牛血清(FBS)5%、DNase Ⅰ 0.05%溶于DMEM/F12培養(yǎng)基]到15 mL離心管中，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中27 ℃消化；分別在0、20、40、60、80 min時(shí)，用槍輕輕吹打混勻，取適量混勻消化液用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞，在顯微鏡下檢查消化情況，并將同一時(shí)間點(diǎn)殘留的腸道組織取出適量進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察腸道消化后的情況，以確定最佳消化終止時(shí)間；6)用30 μm細(xì)胞篩過濾消化液至50 mL離心管中，4 ℃、200×g離心5 min，重復(fù)2次；最后棄上清，加1 mL DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

1.4 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)：將重懸的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，并將細(xì)胞接種到鋪有Ⅰ型膠原蛋白的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL[含表皮生長(zhǎng)因子(EGF)0.01 mg/L、胎牛血清5%、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.02 mg/mL、胰島素220 U/L、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)70 ng/mL、肝素100 mg/mL、Penicillin-Streptomycin雙抗100 U/mL]，接種后在27 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的貼壁時(shí)間不同，成纖維細(xì)胞貼壁速度比上皮細(xì)胞快，在培養(yǎng)90 min后，把培養(yǎng)液連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。在原代培養(yǎng)過程中，每48 h更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d后基本鋪滿底壁。

傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)7～9 d后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)特征，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%或鋪滿底壁時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時(shí)移去培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化液；在倒置顯微鏡下觀察，1～2 min后當(dāng)細(xì)胞回縮、變圓、成團(tuán)的漂浮于消化液中時(shí)立即用DMEM/F12含5%血清終止消化，稍傾斜6孔板，加入適量培養(yǎng)液，輕柔吹打直至細(xì)胞完全脫離孔板；收集細(xì)胞，200×g離心5 min，棄上清，PBS清洗2次；加入適量傳代細(xì)胞培養(yǎng)基(含EGF 0.01 mg/L、胎牛血清5%、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.02 mg/mL、胰島素220 U/L、IGF-Ⅰ 70 ng/mL、肝素100 mg/mL、Penicillin-Streptomycin雙抗100 U/mL)，根據(jù)細(xì)胞密度以1∶2繼續(xù)接種到新的培養(yǎng)板進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5 生長(zhǎng)曲線繪制

用噻唑藍(lán)(MTT)法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞以6.0×104個(gè)/mL的密度接種于24孔板中，置于27 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第2天起，每天在同一時(shí)間分別在24孔板中取3孔細(xì)胞，用MTT細(xì)胞增殖試劑盒測(cè)定在490 nm處的吸光度(OD)值，連續(xù)取8 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值的平均值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.6 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞CK-18鑒定

將傳代的細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的密度接種至6孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行細(xì)胞爬片。具體操作如下：將蓋玻片用洗潔劑清洗干凈，然后用自來水將洗潔劑沖洗干凈，再用純水沖洗3遍，浸泡在75%的酒精中靜置10 min；用鑷子夾起蓋玻片在酒精燈上將酒精燒干(溫度不可過高)；將燒干的蓋玻片放在6孔板中，待冷卻后將細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/mL)滴加在蓋玻片上；5 h后輕輕補(bǔ)加1 mL培養(yǎng)基，置27 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼在玻片上良好生長(zhǎng)，且細(xì)胞間留有空隙，未連接成片，此時(shí)棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min后，倒掉，然后用PBS清洗3次，每次5 min；爬片稍甩干后加50～100 μL破膜工作液，室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min；然后滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；輕輕甩掉封閉液，在細(xì)胞孔板里滴加一抗(1∶500稀釋)，細(xì)胞培養(yǎng)板平放于濕盒內(nèi)4 ℃冰箱過夜孵育；細(xì)胞孔板置于脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。稍甩干后滴加二抗(1∶400稀釋)覆蓋組織，室溫孵育50 min；爬片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min；用抗熒光淬滅封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞表面標(biāo)志性蛋白熒光定量表達(dá)分析

待傳代的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到90%以上時(shí)，提取細(xì)胞總RNA，并用分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度，保證RNA樣品吸光度(OD)260/280的值在1.8～2.0。提取總RNA樣品通過凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。提取的總RNA樣品使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)結(jié)束后cDNA樣品保存-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

以黃姑魚β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為持家基因，根據(jù)課題組獲得的黃姑魚轉(zhuǎn)錄組結(jié)果設(shè)計(jì)封閉蛋白(Claudin)、閉合蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein-1，ZO-1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)和上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)的引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，引物序列如表1所示。使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)。qPCR程序如下：94 ℃下預(yù)變性10 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體積10 μL。Claudin、Occludin、ZO-1、AKP和E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt方法[13]計(jì)算。

表1 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的qPCR引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞分離

本試驗(yàn)采用胰蛋白酶、膠原蛋白酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化法對(duì)黃姑魚腸道組織進(jìn)行不同時(shí)間(0、20、40、60、80 min)的消化分離，對(duì)所分離的細(xì)胞進(jìn)行了臺(tái)盼藍(lán)染色，用以檢測(cè)所得細(xì)胞活性，并對(duì)消化不同時(shí)間點(diǎn)的殘留腸道組織進(jìn)行HE染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1)，消化0 min時(shí)便可以得到少量的腸道上皮細(xì)胞，但是此時(shí)未見細(xì)胞團(tuán)的出現(xiàn)；消化20 min時(shí)得到的腸道上皮細(xì)胞也較少；消化40 min時(shí)腸道上皮細(xì)胞逐漸增多，較小的細(xì)胞團(tuán)開始出現(xiàn)；消化60和80 min時(shí)，得到的腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)最多，細(xì)胞團(tuán)也較大。相應(yīng)的HE染色分析可以很好地解釋細(xì)胞的分離結(jié)果，消化20 min時(shí)腸道組織的一些腸絨毛被消化下來，但仍有大部分腸絨毛未被消化，消化40 min時(shí)腸道組織的絨毛已經(jīng)有較多的部分被消化下來，消化60 min和80 min時(shí)腸道組織的絨毛近乎全部從腸道基膜上消化下來。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞團(tuán)數(shù)目上分析，本研究建議在40～60 min終止細(xì)胞消化。

2.2 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)

取消化50 min的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)90 min后，把培養(yǎng)液連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)3 d時(shí)，黃姑魚腸道上皮細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，多數(shù)細(xì)胞單個(gè)生長(zhǎng)(圖2-a)；在培養(yǎng)5 d時(shí)，細(xì)胞開始鋪展開來，呈“鋪路石”狀(圖2-b)；在培養(yǎng)7 d時(shí)，黃姑魚腸道上皮細(xì)胞匯合成片，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈致密單層排列，細(xì)胞鋪滿80%底壁，并呈明顯的鋪路石狀(圖2-c)。傳代至第5代培養(yǎng)結(jié)果表明，細(xì)胞呈圓形，種類較為單一且細(xì)胞界限清晰(圖3)。

2.3 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

利用MTT細(xì)胞增殖試劑盒測(cè)得的OD值作腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，結(jié)果如圖4所示，腸道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈“S”形，在第4天開始呈指數(shù)期生長(zhǎng)，到第7天趨于平緩。

2.4 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞CK-18蛋白熒光鑒定

CK-18屬于上皮細(xì)胞特異性抗原成分之一。本試驗(yàn)用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)方法來鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞類型。檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5)，CK-18在傳代細(xì)胞中的表達(dá)呈陽性，表明本試驗(yàn)所培養(yǎng)的傳代細(xì)胞為腸道上皮細(xì)胞。

2.5 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的基因表達(dá)

本研究分析了腸道上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin、Claudin、Occludin、ZO-1和AKP在傳代細(xì)胞中的表達(dá)，qPCR分析顯示這些基因在傳代培養(yǎng)的細(xì)胞中均有表達(dá)，進(jìn)一步證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是黃姑魚腸道上皮細(xì)胞。

3 討 論

3.1 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞消化分離及原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立

腸道上皮細(xì)胞是魚類腸道的主要功能細(xì)胞，本研究利用酶消化分離法成功從黃姑魚腸道獲得連續(xù)生長(zhǎng)的腸道上皮細(xì)胞。腸道組織中的隱窩具有增殖分化能力，能支持細(xì)胞持續(xù)增殖，是腸道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。消化酶可以將腸黏膜消化成包含隱窩的黏膜細(xì)胞團(tuán)。宋增福等[1]利用膠原蛋白酶Ⅰ 0.2 g/L、乙二胺四乙酸(EDTA)0.02%和膠原蛋白酶Ⅳ 0.2 g/L的消化液，28 ℃水浴振蕩消化20 min獲得了較多的鯽魚腸上皮絨毛隱窩單位和細(xì)胞團(tuán)；姚仕彬等[6]利用膠原蛋白酶Ⅰ和Ⅳ聯(lián)合消化液，28 ℃水浴振蕩消化30 min得到了較多的草魚腸黏膜上皮細(xì)胞團(tuán)。與上述魚類腸道細(xì)胞的分離方法相比，本研究在黃姑魚腸道上皮細(xì)胞分離過程中，除使用了膠原蛋白酶外，還聯(lián)合使用了胰蛋白酶和透明質(zhì)酸酶，這樣可以加速隱窩的分離并保持隱窩的完整性和細(xì)胞活力，減少腸道上皮細(xì)胞分離時(shí)的損傷[14]，獲得了大量的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)。然而，席柔[15]在雞胚盲腸道上皮細(xì)胞分離中發(fā)現(xiàn)膠原蛋白酶Ⅰ要顯著高于膠原蛋白酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化獲得的腸道上皮細(xì)胞，此結(jié)果與本研究結(jié)果不同的原因可能是因?yàn)轸~類和雞的腸道上皮細(xì)胞的特性有一定的差別[16]。此外，研究表明酶的消化時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的損傷就會(huì)越大，胰蛋白酶會(huì)破壞細(xì)胞膜表面的鈣黏蛋白和層黏蛋白，致使細(xì)胞無法貼壁而死亡[17-18]。然而，酶消化時(shí)間太短則不能得到大量的腸道上皮細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)。因此，確定腸道上皮細(xì)胞最佳消化時(shí)間至關(guān)重要。本試驗(yàn)通過設(shè)定不同消化時(shí)間，聯(lián)合使用胰蛋白酶(0.25%)、膠原蛋白酶(1 mg/mL)和透明質(zhì)酸酶(0.16 mg/mL)消化黃姑魚腸道上皮細(xì)胞，得出在消化40～60 min時(shí)，可以獲得大量的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)。

成纖維細(xì)胞是腸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)的主要污染細(xì)胞，一般采用機(jī)械刮除法[19]、反復(fù)貼壁法[1,19]及胰蛋白酶消化排除法[14,19]等方法進(jìn)行純化。本試驗(yàn)根據(jù)成纖維細(xì)胞貼壁速度比上皮細(xì)胞快的特點(diǎn)，在培養(yǎng)90 min后，把培養(yǎng)液連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)[1]，得到了生長(zhǎng)良好的貼壁腸道上皮細(xì)胞。此外，本試驗(yàn)在黃姑魚腸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中也添加了適當(dāng)濃度的EGF[1]、轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素[20]、IGF-Ⅰ[21]及肝素[22]，這些營養(yǎng)素可以促進(jìn)腸道細(xì)胞快速貼壁增殖，并有效抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)的原代腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

a、c、e、g、i分別為腸道組織消化0、20、40、60和80 min時(shí)殘留腸道組織HE染色圖，b、d、f、h、j分別為腸道組織消化0、20、40、60和80 min時(shí)所得細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色圖。黃色箭頭為腸道上皮細(xì)胞，紅色箭頭為腸道上皮細(xì)胞團(tuán)。

a：培養(yǎng)3 d的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞；b：培養(yǎng)5 d的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞；c：培養(yǎng)7 d的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞。

圖3 傳代至第5代培養(yǎng)的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞

3.2 黃姑魚腸道上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)及鑒定

胰酶可以降低非上皮細(xì)胞的貼壁能力，所以細(xì)胞在傳代培養(yǎng)時(shí)一般用胰酶處理。本研究采用0.25%胰酶消化原代培養(yǎng)的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞后獲得了連續(xù)生長(zhǎng)的傳代細(xì)胞，這與Patkaew等[23]結(jié)果一致。而古少鵬等[24]采用0.25%胰酶與0.02% EDTA聯(lián)合消化，并發(fā)現(xiàn)加入EDTA后可以降低胰酶對(duì)雞胚盲腸道上皮細(xì)胞損傷，傳代培養(yǎng)細(xì)胞活性高。后續(xù)研究可加入EDTA進(jìn)一步優(yōu)化黃姑魚腸道上皮細(xì)胞傳代條件。本研究中，傳代后的黃姑魚腸道上皮細(xì)胞呈“鋪路石”樣，傳代至第5代培養(yǎng)結(jié)果表明，細(xì)胞呈圓形，種類較為單一且細(xì)胞界限清晰。

相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

體外培養(yǎng)腸道上皮細(xì)胞的鑒別方法主要有形態(tài)學(xué)觀察[25]、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)法[18,22]和電子顯微鏡觀察[1,14]等方法。本研究中，傳代培養(yǎng)的腸道上皮細(xì)胞呈明顯圓形的上皮細(xì)胞特征，細(xì)胞生長(zhǎng)呈鋪路石狀[1,25]，并利用MTT法檢測(cè)傳代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示培養(yǎng)的傳代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線符合上皮細(xì)胞典型的“S”形生長(zhǎng)特性。CK-18是一種特異性細(xì)胞骨架蛋白，是上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及成熟的特征性標(biāo)志物[26-27]。本研究利用特異性抗原細(xì)胞CK-18對(duì)傳至第5代的細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，傳代后的黃姑魚腸道細(xì)胞免疫熒光呈陽性，說明傳代的細(xì)胞仍為腸道上皮細(xì)胞[18]。腸型AKP存在于腸道上皮細(xì)胞刷狀緣上，是腸道上皮細(xì)胞標(biāo)志酶；E-cadherin、Claudin、Occludin和ZO-1均是參與形成和維持上皮細(xì)胞之間的重要的連接蛋白。本研究通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)這些腸道上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白在培養(yǎng)的傳代細(xì)胞中均有表達(dá)，進(jìn)一步證明本試驗(yàn)中培養(yǎng)的傳代細(xì)胞為黃姑魚腸道上皮細(xì)胞[18,22]。

a：CK-18顯色結(jié)果為綠色；b：DAPI細(xì)胞核染色為藍(lán)色；c：CK-18和DAPI共顯色位置。

圖6 傳代培養(yǎng)細(xì)胞中腸道上皮

4 結(jié) 論

本研究建立了黃姑魚腸道上皮細(xì)胞的原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)方法，為黃姑魚腸道功能研究及病理機(jī)制的研究提供體外細(xì)胞模型試驗(yàn)材料，并為其腸道上皮細(xì)胞系的建立奠定了基礎(chǔ)，也可為海水魚類腸道功能的研究提供技術(shù)支撐。