張玉明 于春微 杜立銀 鄧清華*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，通遼028000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特010000)

泌乳開始后，奶牛對葡萄糖的需求增加，因?yàn)槠咸烟鞘呛铣膳Ｄ趟匦璧某煞?。母牛努力彌補(bǔ)能量不足并開始使用體脂肪?？焖俚闹|(zhì)動員導(dǎo)致非酯化脂肪酸(NEFA)的濃度增加，其中部分在轉(zhuǎn)移到肝臟后，轉(zhuǎn)化為能量(以ATP的形式)，供動物用于所有生命過程。然而，過量的NEFA一部分被代謝生成酮體[丙酮、乙酰乙酸和β-羥丁酸(BHBA)]外，其余部分則以甘油三酯的形式在肝臟中積累。產(chǎn)奶量增加會加劇能量不足和脂肪組織分解，酮體濃度不斷增加，最終導(dǎo)致酮癥。大多數(shù)高產(chǎn)奶牛在泌乳高峰期易發(fā)生高酮血癥，血漿BHBA濃度顯著升高。血漿酮體濃度的升高可增強(qiáng)傳染性疾病即子宮炎和乳腺炎的敏感性[1-2]。中性粒細(xì)胞(PMN)是先天免疫的第1道防線，并在病原感染的起始中起著重要作用[3]。越來越多的數(shù)據(jù)表明BHBA在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中具有很強(qiáng)的抗炎活性。體外試驗(yàn)表明，BHBA通過激活G蛋白偶聯(lián)受體109A(GPR109A)抑制巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、低密度脂蛋白攝取和趨化[4]。此外，BHBA可抑制脂多糖(LPS)刺激的單核細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)[5]。

據(jù)報(bào)道，與長鏈脂肪酸相比，短鏈脂肪酸具有一定的抗炎作用。BHBA是患酮癥奶牛脂肪酸在肝臟β-氧化的重要代謝產(chǎn)物，參與奶牛中性粒細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)。研究人員發(fā)現(xiàn)，BHBA對中性粒細(xì)胞功能有毒性作用，奶牛在產(chǎn)后負(fù)能量平衡狀態(tài)下，高濃度BHBA是導(dǎo)致中性粒細(xì)胞免疫功能抑制的主要誘因[6-7]。在LPS誘導(dǎo)的乳腺炎中，灌注BHBA和鹽水后，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、核因子-κB(NF-κB)和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著降低，這些結(jié)果表明BHBA具有抗炎效應(yīng)[8]。然而，尚不清楚BHBA對LPS誘導(dǎo)的奶牛中性粒細(xì)胞的抗炎作用的詳細(xì)機(jī)制。本研究假設(shè)BHBA具有抗炎作用，抑制NF-κBp65蛋白表達(dá)，從而抑制促炎細(xì)胞因子的分泌。因此，本研究以LPS誘導(dǎo)奶牛中性粒細(xì)胞炎癥為細(xì)胞模型，深入研究BHBA對LPS激活的NF-κB信號通路是否具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

肝素鈉，購于Sigma公司；TNF-α、IL-6和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，購于北京索萊寶科技有限公司；Pecoll，購于GE公司；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基，購自于Gibco公司；二十四孔板和濾器等，購自于Corning公司；核因子-κB抑制物激酶β(IKKβ)激酶活性檢測試劑盒，購于Genmend公司；LPS和BHBA粉末，購于Sigma公司；抗體NF-κBp65和磷酸化核因子-κBp65(p-NF-κBp65)，購于CST公司；化學(xué)發(fā)光溶液(ECL)，購于Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中性粒細(xì)胞分離

中性粒細(xì)胞分離于經(jīng)產(chǎn)奶牛(內(nèi)蒙古民族大學(xué))，具體操作如下：頸靜脈采血50 mL于含0.1 mL肝素作為抗凝劑離心管中，抗凝血用磷酸鹽緩沖液(PBS)1∶1稀釋，置于Percoll密度梯度分離液上，800×g離心25 min后，從上至下，液面分為4層，分別為血漿層、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞層、中性粒細(xì)胞層及紅細(xì)胞層，去除血漿、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞后，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，經(jīng)過2次洗滌后除去細(xì)胞碎片以及紅細(xì)胞內(nèi)容物，沉淀細(xì)胞即為中性粒細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，37 ℃、5% CO2預(yù)培養(yǎng)30 min，使用0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L BHBA處理細(xì)胞6 h后，添加LPS(100 ng/mL)作用1 h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液上清，用于RNA提取和指標(biāo)測定。同時(shí)設(shè)不進(jìn)行BHBA和LPS處理的對照組和僅進(jìn)行LPS處理的LPS組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平

中性粒細(xì)胞經(jīng)不同濃度BHBA和/或LPS處理后，收集細(xì)胞樣品，提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。根據(jù)GenBank中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κBp65和β-肌動蛋白(β-actin)基因序列和引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物。熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)如下：Rox 10 μL，上游引物1 μL,下游引物1 μL,模板cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。使用ABI7500型熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。

1.2.4 比色法測定IKKβ激酶活性

中性粒細(xì)胞經(jīng)不同濃度BHBA和/或LPS處理后，收集細(xì)胞樣品。在4 ℃條件下，使用清洗液以300×g離心清洗細(xì)胞2次，每次5 min；裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min；在4 ℃條件下16 000×g離心5 min，取細(xì)胞上清液用于IKKβ激酶活性檢測，按照IKKβ激酶活性檢測試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.5 ELISA法測定促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量

將1.2.2中收集的培養(yǎng)液上清1 000×g離心10 min，按照試劑盒說明檢測促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量。

1.2.6 Western blot法檢測NF-κBp65蛋白表達(dá)水平

中性粒細(xì)胞經(jīng)不同濃度BHBA和/或LPS處理后，收集細(xì)胞樣品。使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，按照20 μg上樣量分裝，并加入相應(yīng)的4×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)蛋白上樣緩沖液(SDS PAGE loading buffer)，1 000×g離心5 min，混勻后放入95 ℃水浴鍋中煮5 min使蛋白質(zhì)變性，12%分離膠進(jìn)行電泳，然后將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下，將膜在5%牛血清白蛋白(BSA)中封閉2 h，然后將膜與特定的抗體NF-κBp65和p-NF-κBp65孵育，4 ℃過夜，然后將膜與二抗孵育1 h，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光溶液檢測到免疫反應(yīng)帶，使用Protein Simple Imager分析條帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0軟件的單因素方差(one-way ANOVA)程序進(jìn)行方差分析和LSD多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，每個(gè)試驗(yàn)分組3個(gè)重復(fù)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BHBA抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛中性粒細(xì)胞促炎細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

如圖1所示，與對照組相比，LPS處理極顯著增加了IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)水平(P<0.01)。與LPS組相比，0.5 mmol/L BHBA+LPS組中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；1.0 mmol/L BHBA+LPS組中IL-1βmRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)，IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；2.0 mmol/L BHBA+LPS組和4.0 mmol/L BHBA+LPS組中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)水平均極顯著降低(P<0.01)。這些結(jié)果表明BHBA可能具有抗炎作用。

LPS:脂多糖；BHBA:β-羥丁酸。LPS組(0 mmol/L BHBA+100 ng/mL LPS)與對照組(0 mmol/L BHBA+100 ng/mL LPS)相比較：#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。LPS+BHBA組與LPS組相比較：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.2 BHBA抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛中性粒細(xì)胞IKKβ激酶活性和NF-κBp65 mRNA表達(dá)

如圖2所示，與對照組相比，LPS處理極顯著增加IKKβ活性和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。與LPS組相比較，0.5 mmol/L BHBA+LPS組中IKKβ激酶活性極顯著降低(P<0.01)，NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；1.0、2.0和4.0 mmol/L BHBA+LPS組中IKKβ激酶活性和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平均極顯著降低(P<0.01)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明BHBA可能通過抑制NF-κBp65信號通路發(fā)揮抗炎作用。

2.3 BHBA抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛中性粒細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)

如圖3所示，與對照組相比，LPS處理極顯著增加了NF-κBp65蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。與LPS組相比較，0.5 mmol/L BHBA+LPS組中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，1.0、2.0和4.0 mmol/L BHBA+LPS組中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平極顯著下降(P<0.01)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明BHBA可抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。

圖2 中性粒細(xì)胞中IKKβ激酶活性和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平

p-NF-κBp65: 磷酸化核因子-κBp65 phosphorylated nuclear factor-κBp65；NF-κBp65: 核因子-κBp65 nuclear factor-κBp65；β-actin：β-肌動蛋白。

2.4 BHBA抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛中性粒細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的分泌

如圖4所示，與對照組相比，LPS處理極顯著增加了IL-1β和TNF-α的分泌量(P<0.01)，顯著增加了IL-6的分泌量(P<0.05)。與LPS組相比較，0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L BHBA+LPS組中IL-1β和TNF-α分泌量均極顯著降低(P<0.01)；0.5和1.0 mmol/L BHBA+LPS組中IL-6分泌量顯著降低(P<0.05)，2.0和4.0 mmol/L BHBA+LPS組中IL-6分泌量極顯著降低(P<0.01)。這些結(jié)果進(jìn)一步確定了BHBA可以抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛中性粒細(xì)胞炎癥信號通路的激活。

圖4 中性粒細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量

3 討 論

酮癥是高產(chǎn)奶牛高發(fā)的營養(yǎng)代謝疾病，在圍產(chǎn)期表現(xiàn)出負(fù)能量平衡，其特征是血液中NEFA和BHBA濃度較高。根據(jù)有無臨床表現(xiàn)，酮癥通常分為臨床和亞臨床型酮癥[9]。酮癥主要發(fā)生在高產(chǎn)奶牛泌乳的第1階段，最初，酮癥病程較輕，沒有明顯的臨床癥狀，也稱為亞臨床酮癥，這僅通過血液中BHBA濃度的增加來證明血清和尿液中酮體的存在，通常涉及牛群中大約40%的奶牛，在極端情況下，它甚至可以涉及80%的奶牛[10-11]。亞臨床型酮癥在沒有適當(dāng)干預(yù)的情況下發(fā)展最終發(fā)展成臨床型酮癥，其特征是血液中的BHBA濃度增加，尿液和牛奶中存在酮體，以及其他癥狀，例如食欲不振、體重迅速下降、大便干燥、產(chǎn)奶量下降[12]。酮癥使奶牛對傳染病、代謝疾病和生殖障礙的易感性增加，從而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失?；加型Y的奶牛會出現(xiàn)食欲不振、產(chǎn)奶量減少和牛奶成分發(fā)生改變[13-15]。酮癥發(fā)生時(shí)，血液中BHBA的濃度會顯著增加，從而引起肝臟損傷、氧化應(yīng)激和一系列生理代謝紊亂。這些因素隨后影響奶牛的免疫功能和生殖能力，導(dǎo)致其他產(chǎn)后疾病[16]。血液中BHBA的濃度與傳染性疾病的炎癥反應(yīng)應(yīng)答能力有關(guān)，例如牛乳腺炎和子宮炎。研究還顯示，與子宮健康的母牛相比，圍產(chǎn)期患有產(chǎn)后和亞臨床子宮內(nèi)膜炎的母牛的血液中性粒細(xì)胞功能顯著受損，血液中BHBA濃度更高[17]。因此，BHBA對炎癥反應(yīng)應(yīng)答的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。

短鏈脂肪酸是脂肪酸分解代謝的重要中間體，據(jù)報(bào)道，未羥基化修飾的丁酸可有效治療多種炎性和自身免疫性疾病，例如結(jié)腸炎和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎[18-19]。體內(nèi)使用BHBA可以部分保護(hù)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)引起的多巴胺能神經(jīng)退行性病變和運(yùn)動功能障礙，從而改善線粒體呼吸和ATP的產(chǎn)生[20-21]。有研究者證明BHBA可以延長轉(zhuǎn)基因R6/2小鼠的壽命，減輕運(yùn)動功能障礙，并防止紋狀體組蛋白去乙?；痆22-23]。以上研究進(jìn)展足以說明BHBA具有正向活性調(diào)節(jié)功能。免疫學(xué)參數(shù)的改變?nèi)Q于BHBA的濃度，它們的濃度會隨著酮體濃度的增加而增加[11,24]。促炎細(xì)胞因子通常被用作炎癥標(biāo)志物，在評估這些標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，已經(jīng)證明炎癥和代謝性疾病之間存在相關(guān)性[25-28]。此外，炎癥和免疫反應(yīng)的標(biāo)志物作為奶牛健康的標(biāo)志物可能具有重要的預(yù)后功能[29-30]。疾病分期是在BHBA定量評價(jià)的基礎(chǔ)上確定的，根據(jù)文獻(xiàn)，BHBA是用于診斷和評價(jià)奶牛酮癥最有用、最可靠的酮體[15]。此外，疾病嚴(yán)重程度的評估是基于可見的酮癥臨床體征，這也是至關(guān)重要的，因?yàn)樗兄诩铀僭\斷和適當(dāng)?shù)闹委煶绦颉Ｔ诒狙芯恐?，關(guān)于酮體與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，比較驗(yàn)證了BHBA對炎癥評估參數(shù)的影響，表現(xiàn)出BHBA濃度是最重要的，隨著疾病的進(jìn)展(BHBA濃度增加)，免疫系統(tǒng)參數(shù)的研究有望取得進(jìn)展[31-32]。本研究中，qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，LPS處理極顯著上調(diào)了IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)，這證明了LPS可以激活炎癥信號通路；BHBA和LPS混合處理則表現(xiàn)出抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)，這證明了BHBA抑制炎癥信號通路的活化。

NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可調(diào)節(jié)重要生理過程，例如生存、炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)基因的表達(dá)。在正常細(xì)胞中，NF-κB以無活性的異二聚體形式存于細(xì)胞質(zhì)中，該異二聚體由2個(gè)亞基p50和p65組成，與其抑制蛋白(IκBα)形成復(fù)合物。當(dāng)細(xì)胞被某些炎癥刺激激活時(shí)，IκBα被磷酸化，引起快速降解，隨后NF-κB從IκBα上解離。磷酸化的IκBα被蛋白酶體迅速降解，從而導(dǎo)致NF-κBp65轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，并與靶基因啟動子中存在的特定DNA序列結(jié)合[33]。IKKβ激酶具有絲氨酸蛋白激酶的活性，可磷酸化底物IκBα，一旦活性增強(qiáng)，則可激活NF-κB信號通路，釋放促炎細(xì)胞因子。幾項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，酮癥與乳腺炎和子宮炎等傳染病的易感性增加之間存在關(guān)聯(lián)[34]。促炎細(xì)胞因子在激活全身炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，急性期蛋白已被用作炎癥的非特異性生物標(biāo)志物[35-36]。文獻(xiàn)資料顯示，IL-6和TNF-α可能影響多種疾病的發(fā)生，包括代謝性的和非代謝性的[37-39]。已有研究證明，IL-6濃度升高與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝受損、脂肪酸代謝受損甚至氧化應(yīng)激的發(fā)生存在嚴(yán)格的相關(guān)性。上述一種或所有過程的功能障礙可能導(dǎo)致酮癥發(fā)展、肝臟損害和衰竭[37]。有研究認(rèn)為，IL-6在分娩前33和23天出現(xiàn)升高，也可能導(dǎo)致奶牛其他產(chǎn)后疾病的發(fā)生，如真胃變位或胎盤滯留[38]。同樣，在人類中，TNF-α作為促炎細(xì)胞因子參與多種代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制，主要是慢性疾病，如糖尿病導(dǎo)致的胰島素抵抗和脂肪酸代謝紊亂[39]。在脂肪肝綜合征奶牛中，TNF-α濃度增加與胰島素抵抗和脂肪酸代謝紊亂之間的相關(guān)性已被描述[24,40]。此外，IL-6和TNF-α可能通過減少飼料消耗、誘導(dǎo)胰島素抵抗和直接啟動脂肪分解來刺激機(jī)體脂肪組織的分解[41]。這些過程與奶牛的酮癥發(fā)展密切相關(guān)。Zhang等[11]在奶牛分娩前4周發(fā)現(xiàn)血液中IL-6和TNF-α濃度升高，這表明，即使在分娩前，也就是酮癥發(fā)展之前，也存在急性期反應(yīng)。BHBA是GPR109A的生理配體，相關(guān)研究表明BHBA不能抑制TNF-α誘導(dǎo)GGPR109A-/-小鼠原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞IL-6的分泌，論證了BHBA可通過GPR109A發(fā)揮抗炎作用[42]，說明BHBA具有抗炎作用。本研究中，BHBA顯著抑制IKKβ活性及NF-κBp65蛋白的表達(dá)，這進(jìn)一步證明BHBA可抑制NF-κBp65的轉(zhuǎn)錄，從而抑制下游炎癥細(xì)胞因子的釋放。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)，高濃度BHBA抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞中NF-κB信號通路的激活，從而抑制炎癥反應(yīng)應(yīng)答，發(fā)揮抗炎作用。