張 卓 聶德超 趙 琛 李艷玲

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

在畜牧業(yè)生產(chǎn)體系中，抗生素的濫用不僅會(huì)引發(fā)超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，其殘留亦會(huì)造成畜產(chǎn)品安全和環(huán)境污染問(wèn)題[1]。此外，一些抗生素對(duì)腸道微生物具有廣譜抗菌活性，不僅能殺死有害菌，同時(shí)也能殺死有益菌，因此，長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)降低動(dòng)物微生物群體的多樣性，增加病原體在腸道內(nèi)定植的機(jī)會(huì)[2]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[3]。在這樣的背景下，尋找能夠替代抗生素的綠色飼料添加劑顯得尤為迫切。植物精油由于其具有顯著的抗菌活性，被認(rèn)為是有潛力的抗生素替代品[4]。柑橘類植物精油(citrus essential oils，CEOs)是生產(chǎn)量最大、商業(yè)化程度最高的植物精油之一，因其成本相對(duì)較低，更益于廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)[4]。據(jù)報(bào)道，CEOs具有選擇性抗菌活性，對(duì)有益菌[如乳酸桿菌(Lactobacillus)]的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)影響較小，而對(duì)有害菌[如大腸桿菌(Escherichiacoli)]的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)影響較大[5]，利用這一特性應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中將具有非常重要的價(jià)值。本文著重介紹了CEOs的抗菌活性及其作用機(jī)制，為其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 CEOs簡(jiǎn)介

CEOs是一種從柑橘類植物中提取的芳香類混合物，具有天然綠色、無(wú)毒無(wú)害、無(wú)殘留和無(wú)刺激等特點(diǎn)[6]，主要包括甜橙精油、葡萄柚精油、檸檬油、佛手柑精油、橘子精油和苦橙葉精油等[7]。CEOs來(lái)源于植物的不同部分，如葉、花、果實(shí)和果皮等[8]。提取、加工CEOs的常用方法有蒸餾法、溶劑法、壓榨法、超臨界二氧化氮萃取法和分子蒸餾法等，其中蒸餾法是最常用、最潔凈的方法，95%的植物精油均可以用蒸餾法萃取獲得[9]。CEOs具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抗氧化和抗炎等[7]；且由于其可以阻礙畜禽舍中霉菌的生長(zhǎng)，抑制或殺滅大腸桿菌、沙門(mén)氏菌(Salmonella)等有害菌群，提高環(huán)境清潔度和畜禽舒適度[6]，在畜禽上具有良好的應(yīng)用前景。隨著替抗研究的深入和人們對(duì)綠色、無(wú)公害、無(wú)殘留的天然抗菌劑的要求，對(duì)CEOs抗菌生物活性的研究越來(lái)越多，尤其是其選擇性抗菌活性的研究引起了本課題組的關(guān)注，擬開(kāi)展更多深入的研究。

2 CEOs的化學(xué)組成

CEOs是復(fù)雜的碳?xì)浠衔铮彩禽祁惡头禽祁惖暮跹苌锏幕旌衔?，由功能基團(tuán)組成，包括醛、醇、酮和其他復(fù)雜分子，如酯和有機(jī)酸[10]。CEOs的組成因品種、季節(jié)和地理位置以及果實(shí)成熟期而異[11]，包含多種化合物，如檸檬烯(limonene)、α-蒎烯(α-pinene)、β-蒎烯(β-pinene)、γ-松油烯(γ-terpinene)、檜烯(sabinene)、β-月桂烯(β-myrcene)和芳樟醇(linalool)等(圖1)[7]。通常，每種CEOs都含有20～60種化合物[12]，其中，揮發(fā)性化合物占85%～99%，主要包括單萜類(monoterpene)、倍半萜烯類(sesquiterpenes)和倍半萜類(sesquiterpenoids)[13]。而單萜烯是最主要的揮發(fā)性化合物，主要由2個(gè)異戊二烯(C5H8)組成[11]。D-檸檬烯屬于單萜烯，是CEOs的主要活性成分，具體含量因CEOs的種類而異。例如，佛手柑精油中D-檸檬烯含量為32%～45%，檸檬油中D-檸檬烯含量為45%～76%，甜橙油中D-檸檬烯含量為68%～98%[14-15]。通過(guò)了解CEOs的化學(xué)組成，有利于進(jìn)一步研究CEOs發(fā)揮生物活性的有效活性成分。

圖1 CEOs的一些重要化合物

3 CEOs的抗菌活性

植物精油以其顯著的廣譜抑菌活性以及殘留毒性小的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在抑菌性能上得到了廣泛關(guān)注[16]。CEOs及其大部分化合物均具有抗菌活性，例如，D-檸檬烯具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌的作用[17-18]，α-蒎烯和β-蒎烯具有抗菌、抗炎和抗氧化的作用[19]，且近年來(lái)關(guān)于CEOs抗菌活性的研究也越來(lái)越多。因此，本文重點(diǎn)介紹了幾種主要的CEOs的抗菌活性。

3.1 幾種主要CEOs的抗菌活性

3.1.1 甜橙精油

甜橙精油是少數(shù)有鎮(zhèn)靜作用的精油之一，有著甜橙香味。甜橙精油可抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌等(Salmonellatyphimurium)[20-22]；以及幾種真菌，如黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、土曲霉(Aspergillusterreus)等[23-25]。

3.1.2 檸檬油

檸檬油為淡黃色液體，具有柑橘類的香氣，清爽而新鮮。檸檬油對(duì)蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)等具有有效的抗菌活性[26]，對(duì)黑曲霉(Aspergillusniger)、疣狀青霉(Penicilliumverrucosum)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)等具有抗真菌作用[25]。

3.1.3 葡萄柚精油

葡萄柚性涼，具有清熱、止渴之效。葡萄柚精油氣味清新、香甜，有柑橘的果香味。葡萄柚精油是以新鮮果皮為原料的，采用冷榨方法，出油率在0.5%～1.0%。葡萄柚精油對(duì)蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等均有較強(qiáng)的抗菌活性；對(duì)黑曲霉、白色念珠菌(Candidaalbicans)等具有較強(qiáng)的抗真菌活性[27-28]。

3.1.4 佛手柑精油

佛手柑精油萃取自佛手柑的果皮，精油呈翠綠色，味道較清新，類似甜橙和檸檬。佛手柑精油抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門(mén)氏菌等[29]，對(duì)漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)、脆壁克魯維酵母和白色念珠菌等具有抗真菌活性[29-30]。

3.1.5 橘子精油

橘子精油除了具有獨(dú)特的柑橘皮味之外，還帶有少許幽幽花香。橘子精油以其廣譜抗菌和抗真菌作用而聞名。它能抑制幾種細(xì)菌的生長(zhǎng)，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌[31-32]；抑制幾種真菌的生長(zhǎng)，包括意大利青霉(Penicilliumitalicum)、黃曲霉和鏈格孢菌(Alternariaalternata)等[32-33]。

3.2 不同CEOs的抗菌能力比較

不同的CEOs由于其化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)的差異性，使得它們具有不同的抗菌效果，其抗菌能力與其不同的活性成分及活性成分間的互作有關(guān)[1]。金如月[33]研究表明，CEOs中不同的化學(xué)成分具有不同的抗菌能力。眾多活性成分中，酚類的抗菌性最強(qiáng)，其次是醛類、醇類、酮類、酯類和烴類[34]。此外，大量研究表明，羥基(—OH)、甲氧基(—OCH3)、烯烴鍵以及親脂性化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)精油抗菌能力有著重要作用，可提高其抗菌能力[35-36]。在抗菌評(píng)價(jià)體系中，最低抑菌濃度(MIC)是衡量抗菌效果的常用指標(biāo)之一，MIC值越小，說(shuō)明其抗菌效果越好[1]。表1列出了幾種常見(jiàn)CEOs的MIC值，比較其抗菌能力[25,33,37-38]。從表中可以發(fā)現(xiàn)，不同的CEOs對(duì)同一種細(xì)菌具有不同的抗菌力，同一種CEOs對(duì)不同的細(xì)菌也具有不同的抗菌力?？傮w而言，表1中所列5種常見(jiàn)的CEOs，佛手柑精油和檸檬油的抗菌效果較佳。

表1 不同CEOs的MIC值

3.3 CEOs的選擇性抗菌活性

CEOs具有選擇性抗菌活性。研究報(bào)道，CEOs可以抑制病原菌活性，如李斯特菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌[20,30]，同時(shí)刺激有益微生物發(fā)揮作用，如豬的乳酸桿菌[39]。CEOs對(duì)大腸桿菌具有較高的抑菌活性，而對(duì)乳酸桿菌的抑菌活性很小甚至沒(méi)有影響，且CEOs的抑制作用存在劑量依賴性[2]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CEOs作用于細(xì)菌時(shí)，乳酸桿菌的MIC值是大腸桿菌的2倍多，最低殺菌濃度(MBC)值是大腸桿菌的4倍多[2]。以上研究均表明，CEOs對(duì)有害菌和有益菌具有選擇性抗菌活性。

CEOs的選擇性抗菌活性可能與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有關(guān)。目前CEOs對(duì)大腸桿菌和乳酸桿菌的選擇性抗菌活性已有一定的研究報(bào)道。通常認(rèn)為，植物精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原菌的抑制效果高于革蘭氏陰性病原菌[40]，這2種細(xì)菌對(duì)植物精油敏感性的差異被認(rèn)為是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)存在差異造成的，因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性菌缺乏革蘭氏陰性菌所具有的外膜，這種外膜含有極性末端和跨膜通道的脂多糖(LPS)，它允許親水性溶質(zhì)通過(guò)，使疏水性化合物如植物精油組分難以擴(kuò)散到細(xì)胞中。因此，這將使革蘭氏陰性菌對(duì)植物精油更具有耐藥性[41]。然而，在Ambrosio等[2]的研究中卻得到了相反的結(jié)果，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，乳酸桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，但是，大腸桿菌比乳酸桿菌對(duì)CEOs更敏感，因?yàn)椋参锞涂咕V取決于職務(wù)精油化合物官能團(tuán)對(duì)單個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)的特異性。一些精油的化合物能夠分解大腸桿菌的外膜，釋放與這層膜相關(guān)的物質(zhì)并穿透細(xì)胞，從而引發(fā)破壞效應(yīng)，達(dá)到抑菌效果[42]。CEOs中的化合物可能也具有這種能力，從而使得CEOs對(duì)大腸桿菌更敏感。此外，Viuda-Martos等[43]研究揭示了CEOs只有在高濃度下才能抑制乳酸桿菌，這也在一定程度上證明了CEOs對(duì)大腸桿菌和乳酸桿菌的選擇性抑菌活性。然而，對(duì)于CEOs選擇性抗菌活性機(jī)制有待更深入的研究。

4 CEOs的抗菌作用機(jī)制

CEOs具有高度疏水性，能夠促進(jìn)其與細(xì)菌脂質(zhì)雙分子層互作，從而影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性和功能，并且精油能夠在脂質(zhì)雙分子層中大量積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂，使細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制包括以下幾個(gè)方面。

4.1 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的影響

CEOs可以通過(guò)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的影響，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)從細(xì)胞中流出，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到抑菌效果。Tang等[44]通過(guò)掃描電鏡觀察不同濃度精油處理對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組細(xì)菌細(xì)胞呈規(guī)則形狀，內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，無(wú)損傷；經(jīng)CEOs處理后，與CEOs接觸的細(xì)菌細(xì)胞表面呈現(xiàn)不規(guī)則狀、皺縮和粗糙，表明CEOs可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的損傷，從而影響細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性和完整性。

4.2 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的影響

植物精油可以抑制并破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，其與細(xì)菌細(xì)胞膜作用，使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，引起膜的膨脹和不穩(wěn)定，增加膜的流動(dòng)性和滲透性，從而達(dá)到抗菌效果[34]。膜的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的流失，致使細(xì)菌死亡。CEOs一般主要通過(guò)3種方式對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜造成破壞，從而對(duì)致病菌活性產(chǎn)生抑制作用。

1)影響細(xì)胞膜滲透性。細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性用相對(duì)電導(dǎo)率(relative electric conductivity)表示，膜滲透性的破壞，會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏，相對(duì)電導(dǎo)率增加。Ambrosio等[4]研究表明，用CEOs處理大腸桿菌U21后其相對(duì)電導(dǎo)率升高，表明細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性被破壞。此外，用佛手柑精油處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其相對(duì)電導(dǎo)率均有所增加，且金黃色葡萄球菌相對(duì)電導(dǎo)率高于大腸桿菌，這說(shuō)明佛手柑精油會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性破壞，且對(duì)金黃色葡萄球菌作用效果更明顯[37]。

2)影響細(xì)胞膜完整性。蛋白質(zhì)和核酸是細(xì)胞內(nèi)極其重要的大分子，涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和遺傳信息[45]，核酸和蛋白質(zhì)在260 nm處的吸光度是膜完整性的一個(gè)指標(biāo)[37]。Bajpai等[46]研究發(fā)現(xiàn)，用佛手柑精油處理過(guò)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的吸光度值顯著增加，表明佛手柑精油影響了膜的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。

3)影響細(xì)胞膜電位。細(xì)菌細(xì)胞膜電位用熒光強(qiáng)度表示。膜電位的變化會(huì)影響細(xì)菌的代謝活性，因此，可以通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜電位的變化判斷細(xì)菌是否凋亡。Song等[47]研究表明，CEOs處理金黃色葡萄球菌，會(huì)使金黃色葡萄球菌的熒光強(qiáng)度顯著下降，導(dǎo)致細(xì)胞代謝活動(dòng)異常，掃描電子顯微鏡圖像也顯示出柑橘精油處理金黃色葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞。由此可見(jiàn)，CEOs可通過(guò)直接接觸細(xì)菌細(xì)胞，使細(xì)胞膜發(fā)生變化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)抑菌作用。

4.3 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏的影響

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞接觸到植物精油時(shí)，會(huì)使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，使得細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)，比如蛋白質(zhì)、核酸和ATP等泄漏，從而加劇細(xì)菌死亡。因此，直接測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外大分子物質(zhì)的含量，也是檢測(cè)植物精油是否具有抗菌活性的方法之一。

1)對(duì)細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸的影響。用CEOs處理金黃色葡萄球菌后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞的胞外蛋白質(zhì)和核酸含量顯著增加，而細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸含量明顯下降，這表明CEOs作用于細(xì)菌，會(huì)使其胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸泄漏，致使細(xì)菌失活[47]。

2)對(duì)細(xì)菌ATP的影響。ATP對(duì)細(xì)菌細(xì)胞功能至關(guān)重要，包括能量轉(zhuǎn)換要求、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加工和運(yùn)輸、結(jié)構(gòu)大分子的合成和各種酶的分泌[46]，通過(guò)ATP濃度的測(cè)定可以判斷是否具有抑菌效果。用CEOs處理金黃色葡萄球菌后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞的胞內(nèi)ATP濃度顯著下降[47]，這說(shuō)明胞內(nèi)的ATP泄漏，表明CEOs具有抑菌作用。

5 小 結(jié)

CEOs產(chǎn)量豐富、無(wú)毒無(wú)害且安全有效，具有選擇性抗菌活性，可抑制有害細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，對(duì)有益菌不敏感，且不同的CEOs具有不同的抗菌能力，在畜牧生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，今后還有待進(jìn)一步研究其選擇性抗菌活性的作用機(jī)制。