唐 武 張旺宏 孔祥峰

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

新生仔豬宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)的發(fā)生率為6%～10%，早期死亡率高達75%，這給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失[1-2]。腸道屏障可通過機械、化學(xué)、免疫和生物屏障的互作，調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)，抵抗病原體和食源性抗原的入侵，對維持動物腸道健康至關(guān)重要[3]。因此，評價IUGR仔豬的小腸形態(tài)和屏障功能特征，可以為調(diào)控其腸道發(fā)育與健康提供依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，IUGR新生仔豬的腸道發(fā)育和屏障功能受損嚴(yán)重[4]。與正常出生體重(normal birth weight，NBW)仔豬相比，IUGR仔豬的小腸絨毛變短且數(shù)量較少、隱窩細(xì)胞凋亡增加、刷狀緣酶活性降低[5]；IUGR仔豬的緊密連接發(fā)育不完善，導(dǎo)致腸道屏障的通透性增加[6]；IUGR新生仔豬的小腸上皮杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量減少[7]，白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細(xì)胞因子的含量升高[8]。此外，IUGR仔豬腸黏膜上附著的總細(xì)菌數(shù)量增加[9]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，不同生長階段的IUGR豬，其腸道微生物多樣性顯著降低，且更易富集一些病原菌和條件致病菌，其腸道微生物屏障受損[10-11]。小腸絨毛、緊密連接蛋白和黏膜免疫細(xì)胞分別在腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收、通透性維持和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用，是評價小腸健康的重要指標(biāo)[12]。因此，本文比較了1～28日齡IUGR仔豬和NBW仔豬小腸形態(tài)、緊密連接蛋白和免疫細(xì)胞因子表達的差異，為IUGR仔豬腸道發(fā)育的調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

動物試驗在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所永安試驗基地開展。試驗選取“長白×大白”雜交新生仔豬24窩(第3～4胎次母豬生產(chǎn)，產(chǎn)仔數(shù)12頭左右)。稱取仔豬初生體重，統(tǒng)計產(chǎn)仔數(shù)，并計算窩重。根據(jù)Bauer等[13]的方法，從每窩初生重低于平均體重10%的仔豬中選取1頭IUGR仔豬(IUGR組，平均體重為0.98 kg)、從大于平均體重10%的仔豬中選取1頭NBW仔豬(NBW組，平均體重為1.68 kg)。所選仔豬均隨母豬自然哺乳，不調(diào)欄。5～21日齡補充商品教槽飼糧，21日齡斷奶后飼喂商品教槽飼糧至28日齡。飼喂、飲水、光照和免疫等飼養(yǎng)管理按養(yǎng)殖場規(guī)范操作。

1.2 樣品采集

分別于7、21和28日齡時選取IUGR仔豬和NBW仔豬各8頭(每窩選取1頭IUGR仔豬和1頭NBW仔豬)，空腹稱重，7、21和28日齡選取的IUGR仔豬和NBW仔豬平均體重分別為1.77和2.79 kg、4.71和6.45 kg、5.06和7.96 kg[10]。麻醉放血處死，取中段部位的空腸和回腸組織，用10%中性福爾馬林溶液固定，用于腸道形態(tài)學(xué)觀察。刮取中段部位的空腸和回腸黏膜，液氮速凍后-80 ℃保存，用于mRNA表達分析。

1.3 小腸形態(tài)觀察

取固定的小腸組織，經(jīng)修整、洗滌、脫水、透明、浸蠟和包埋等步驟后，再切片、蘇木精-伊紅(HE)染色和封片，并在顯微鏡下觀察空腸和回腸組織形態(tài)，測定絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.4 小腸黏膜屏障相關(guān)基因表達分析

取-80 ℃凍存的空腸和回腸黏膜樣品，液氮中研磨，并根據(jù)RNA TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定其濃度，用PrimeScript RT試劑盒將其反轉(zhuǎn)為cDNA。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因、cDNA為模板，利用ABI-7900HT RT PCR儀(Applied Biosystems，美國)測定小腸黏膜中緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、封閉蛋白-1(claudin-1)和閉合蛋白(occludin)，抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(IL-4)，以及促炎細(xì)胞因子IL-8、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α等基因的mRNA相對表達量。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1，根據(jù)2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行處理分析。

表1 引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2019初步整理后，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，小腸形態(tài)測量和黏膜基因mRNA相對表達量比較使用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 IUGR和NBW仔豬小腸形態(tài)的差異

由表2可知，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬7日齡時空腸絨毛高度、21日齡時空腸和回腸絨毛高度顯著降低(P<0.05)，28日齡時空腸隱窩深度顯著提高(P<0.05)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。由圖1和圖2可知，IUGR仔豬空腸和回腸黏膜出現(xiàn)不同程度的損傷。

2.2 IUGR和NBW仔豬小腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA表達的差異

由表3可知，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬7日齡時空腸黏膜ZO-1、claudin-1、occludin、IL-4和IL-8以及21日齡時空腸黏膜ZO-1和occludin、回腸黏膜ZO-1的mRNA相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)；28日齡時空腸黏膜TNF-α、回腸黏膜IL-1β的mRNA相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，回腸黏膜IL-4的mRNA相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。

表2 IUGR和NBW仔豬小腸形態(tài)的差異

3 討 論

腸道形態(tài)和功能的完整性對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收至關(guān)重要。小腸絨毛高度和隱窩深度是評定小腸形態(tài)的重要指標(biāo)。絨毛高度越高則小腸吸收表面積就越大，其吸收功能就越強；隱窩深度越小則小腸上皮細(xì)胞就越成熟，其分泌功能就越強[14]。本研究中，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬7日齡時空腸絨毛高度、21日齡時空腸和回腸絨毛高度顯著降低，28日齡時空腸隱窩深度顯著提高，提示IUGR仔豬小腸的吸收和分泌功能減弱。同樣，Su等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IUGR斷奶仔豬小腸絨毛高度和絨毛表面積顯著降低，隱窩深度顯著提高；Li等[16]報道，IUGR斷奶仔豬小腸絨毛高度顯著降低。這可能與IUGR胎兒優(yōu)先保障腦等重要器官的發(fā)育，腸道等相對次要器官的血流量供給減少，從而導(dǎo)致腸道隱窩-絨毛軸發(fā)育異常[17]。

腸黏膜的緊密連接是機體防御病原菌入侵的重要屏障[18]。當(dāng)緊密連接功能受損時，有害物質(zhì)進入血液循環(huán)引發(fā)機體炎癥甚至疾病[19]。ZO-1、封閉蛋白(claudin)和occludin等緊密連接蛋白是決定腸黏膜通透性的重要分子[20]。本研究中，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬7日齡時空腸黏膜ZO-1、claudin-1和occludin以及21日齡時空腸黏膜ZO-1和occludin、回腸黏膜ZO-1的mRNA相對表達量顯著下調(diào)，提示IUGR哺乳仔豬的腸黏膜完整性受損。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染時仔豬腸黏膜ZO-1的表達量顯著降低[21]；7～28日齡IUGR仔豬腸道菌群的多樣性降低，病原菌和條件致病菌豐度升高[10]。這可能與腸黏膜的緊密連接結(jié)構(gòu)受損、腸黏膜通透性提高有關(guān)。

圖1 IUGR和NBW仔豬空腸形態(tài)的差異

圖2 IUGR和NBW仔豬回腸形態(tài)的差異

細(xì)胞因子在維持機體免疫反應(yīng)和腸道屏障功能方面發(fā)揮著重要作用[22]。炎性細(xì)胞因子與緊密連接蛋白的改變密切相關(guān)[23]。本研究中，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬7日齡時空腸黏膜IL-4、28日齡時回腸黏膜IL-4的mRNA相對表達量顯著下調(diào)，28日齡時空腸黏膜TNF-α、回腸黏膜IL-1β的mRNA相對表達量顯著上調(diào)，提示IUGR仔豬腸道中存在炎癥反應(yīng)。Wang等[24]也報道，與同窩NBW仔豬相比，IUGR新生仔豬血液炎癥細(xì)胞因子和免疫球蛋白G含量顯著降低，7和14日齡IUGR仔豬的空腸上皮內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量顯著增加。這可能與腸道屏障受損有關(guān)；此外，本研究中，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬7日齡時空腸黏膜IL-8的mRNA相對表達量顯著下調(diào)，其原因仍有待進一步研究。

表3 IUGR和NBW仔豬小腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA表達的差異

4 結(jié) 論

IUGR仔豬的空腸和回腸形態(tài)受損，緊密連接蛋白基因表達下調(diào)，免疫細(xì)胞因子表達異常，進而影響了小腸屏障功能。