劉 輝 季海峰 王四新 張董燕 王 晶 張 偉 王雅民

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097)

為了減少濫用抗生素造成的藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等危害，維護(hù)動(dòng)物產(chǎn)品安全和公共衛(wèi)生安全，我國(guó)自2020年起全面禁止飼料中添加抗生素。因此，開(kāi)發(fā)安全、高效的飼用抗生素替代品已成為當(dāng)前飼料行業(yè)和養(yǎng)殖行業(yè)的熱點(diǎn)和共識(shí)，其中乳酸菌發(fā)酵飼料的研發(fā)與應(yīng)用備受關(guān)注。乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的一類益生菌，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能。乳酸菌在發(fā)酵飼料過(guò)程中可利用飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增殖，并代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、酶類、胞外多糖等代謝產(chǎn)物，能夠降低飼料pH，增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。大量研究證明，乳酸菌發(fā)酵飼料可以降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[1]，提高飼料的適口性和消化利用率[2]，維持動(dòng)物腸道的菌群平衡[3]，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[5-6]。目前關(guān)于乳酸菌發(fā)酵飼料在豬生產(chǎn)方面的研究和應(yīng)用多采用單一菌株作為發(fā)酵菌種[7-10]，而對(duì)以復(fù)合乳酸菌為菌種的固態(tài)發(fā)酵全價(jià)飼料的研究較少。為此，本試驗(yàn)以生長(zhǎng)豬全價(jià)飼料為底物，以乳酸片球菌和副干酪乳桿菌為菌種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，制備成復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料，研究其對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能、糞便菌群、血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響，旨在為復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料在生長(zhǎng)豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取90頭初始體重為(40.69±1.16) kg的健康“長(zhǎng)×大”二元生長(zhǎng)豬，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加1%和3%復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料(發(fā)酵飼料底物組成同基礎(chǔ)飼糧)?；A(chǔ)飼糧為參照NRC(2012)20～50 kg生長(zhǎng)豬營(yíng)養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，飼糧中未添加任何抗生素。預(yù)試期5 d，正試期34 d。試驗(yàn)期間，所有豬只自由采食、飲水，飼養(yǎng)管理按常規(guī)進(jìn)行。

1.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料的制備

采用本研究室制備保存的乳酸片球菌ZPA017凍干菌粉和副干酪乳桿菌ZLP018凍干菌粉(活菌數(shù)均為2.0×1010CFU/g)作為發(fā)酵菌種，與水和基礎(chǔ)飼糧按照質(zhì)量比0.2∶0.2∶800∶1 000進(jìn)行混合，混合均勻后分裝入發(fā)酵桶中密封，37 ℃發(fā)酵24 h后使用。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料每天配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品采集

1.3.1 糞樣

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇3頭豬，采集新鮮糞便，共計(jì)27個(gè)糞樣。每個(gè)糞樣混合均勻后再分成2份，一份分裝于50 mL無(wú)菌離心管中，放置于冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即處理，用于測(cè)定糞便菌群數(shù)量；另一份分裝于EP管中，經(jīng)干冰速凍后-80 ℃保存，用于測(cè)定糞便菌群多樣性。

1.3.2 血樣

試驗(yàn)結(jié)束的當(dāng)天早晨，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇3頭豬，前腔靜脈采血5 mL，置于血清管中促凝，3 000 r/min離心10 min，分離血清后-20 ℃保存待測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)期間，準(zhǔn)確記錄每個(gè)重復(fù)豬只的飼料消耗情況。分別于試驗(yàn)的第1天和第34天早上對(duì)所有試驗(yàn)豬只進(jìn)行空腹稱重，由此計(jì)算生長(zhǎng)豬的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4.2 飼料營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定

干物質(zhì)含量參照GB/T 6435—2006、粗蛋白質(zhì)含量參照GB/T 6432—2018、粗灰分含量參照GB/T 6438—2007、粗纖維含量參照GB/T 6434—2006、鈣含量參照GB/T 6436—2018、總磷參照GB/T 6437—2018、乳酸菌活菌數(shù)參照GB 4789.35—2016測(cè)定。pH的檢測(cè)：稱取25 g樣品置于225 mL滅菌生理鹽水中，混勻后在搖床上振蕩30 min，靜置，用pH計(jì)測(cè)定pH。乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸測(cè)試盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 糞便菌群數(shù)量

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定糞樣的菌群數(shù)量。其中，乳酸菌用改良MRS培養(yǎng)基、大腸桿菌用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、沙門(mén)氏菌用膽硫乳培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌用Baird-Parker培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。菌群數(shù)量以每克糞便中所含菌落形成單位的對(duì)數(shù)[lg(CFU/g)]表示。

1.4.4 糞便菌群多樣性

采用Qiagen DNA提取試劑盒提取糞便總DNA，提取步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。對(duì)提取的總DNA進(jìn)行純化及檢測(cè)濃度和純度。以糞便總DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用上游引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，下游引物為806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，DNA模板10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、切膠回收后，進(jìn)行Illumina MiSeq PE300高通量測(cè)序。對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾后，在97%的相似水平下進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類和生物信息統(tǒng)計(jì)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析，包括豐富度指數(shù)(ACE指數(shù)、Chao1指數(shù))、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))和覆蓋率(Coverage)；基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.5 血清生化、免疫和抗氧化指標(biāo)

血清總蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、鈣(Ca)和磷(P)含量采用日立7020自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量，所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bethyl公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后，再采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當(dāng)方差分析具顯著性差異時(shí)進(jìn)行Duncan氏法多重比較，以P<0.05作為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 全價(jià)飼料發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分變化

由表2可知，生長(zhǎng)豬全價(jià)飼料經(jīng)過(guò)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵后，干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗灰分、鈣、總磷含量未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)，pH顯著降低(P<0.05)，乳酸含量為55.37 g/kg。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料中乳酸片球菌和副干酪乳桿菌的活菌數(shù)分別為1.50×109和1.48×109CFU/g。

表2 全價(jià)飼料發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分變化(風(fēng)干基礎(chǔ))

2.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組生長(zhǎng)豬的ADG提高了9.42%(P<0.05)，F(xiàn)/G降低了7.75%(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組生長(zhǎng)豬的F/G降低了7.36%(P<0.05)。生長(zhǎng)豬的始重、末重、ADFI各組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響

2.3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬糞便菌群數(shù)量的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組生長(zhǎng)豬糞便中乳酸菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著減少(P<0.05)。生長(zhǎng)豬糞便中沙門(mén)氏菌數(shù)量各組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬糞便菌群數(shù)量的影響

2.4 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬糞便菌群組成的影響

2.4.1 α多樣性指數(shù)分析

由表5可知，各組OTU序列的Coverage均在0.99以上，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量高，得到的OTU序列對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果具有代表性。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組生長(zhǎng)豬糞便菌群的Shannon指數(shù)顯著增加(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組生長(zhǎng)豬糞便菌群的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著增加(P<0.05)，Simpson指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

表5 生長(zhǎng)豬糞便菌群α多樣性指數(shù)分析

2.4.2 糞便菌群組成分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，3組生長(zhǎng)豬糞便菌群在門(mén)水平上的相對(duì)豐度見(jiàn)圖1，在屬水平上的相對(duì)豐度見(jiàn)圖2。由圖1可知，除門(mén)水平上未命名的菌群外，3組糞樣中相對(duì)豐度大于0.1%的門(mén)共有4個(gè)，分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，80.74%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，13.32%)、螺旋體門(mén)(Spirochaetae，3.29%)和放線菌門(mén)(Actinobacteriota，1.07%)。方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組糞便中Firmicutes的相對(duì)豐度增加(83.29%、80.88% vs. 78.05%，P>0.05)，Bacteroidetes的相對(duì)豐度顯著降低(10.59%、13.95% vs. 15.41%，P<0.05)。由圖2可知，除屬水平上未命名的菌群外，3組糞樣中相對(duì)豐度大于1%的菌屬共有14個(gè)，分別為狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1，19.67%)、鏈球菌屬(Streptococcus，13.49%)、土孢桿菌屬(Terrisporobacter，6.62%)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus，5.87%)、克里斯滕森菌科R-7群屬(Christensenellaceae_R-7_group，3.99%)、密螺旋體屬(Treponema，3.69%)、顫螺旋菌科UCG-005屬(Oscillospiraceae_UCG-005，3.31%)、顫螺旋菌科NK4A214群屬(Oscillospiraceae_NK4A214_group，2.15%)、普雷沃氏菌屬(Prevotella，2.07%)、顫螺旋菌科UCG-002屬(Oscillospiraceae_UCG-002，2.06%)、毛螺菌科XPB1014群屬(Lachnospiraceae_XPB1014_group，2.01%)、理研菌科RC9腸道群屬(Rikenellaceae_RC9_gut_group，1.63%)、普雷沃氏菌科NK3B31群屬(Prevotellaceae_NK3B31_group，1.62%)和普雷沃氏菌科UCG-003屬(Prevotellaceae_UCG-003，1.29%)。方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組Clostridium_sensu_stricto_1的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅰ組Streptococcus的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

2.5 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬血清生化指標(biāo)的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組生長(zhǎng)豬的血清TP含量分別提高了9.50%(P<0.05)和13.33%(P<0.05)，GLB含量分別提高了16.25%(P<0.05)和12.92%(P<0.05)，ALT活性分別降低了27.68%(P<0.05)和22.74%(P<0.05)，UN含量分別降低了21.50%(P<0.05)和18.53%(P<0.05)，TC含量分別降低了24.55%(P<0.05)和14.29%(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組生長(zhǎng)豬的血清AST活性降低了32.29%(P<0.05)；生長(zhǎng)豬的血清ALB、TG、GLU、Ca、P含量各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Spirochaetae：螺旋體門(mén)；Actinobacteriota：放線菌門(mén)；Others：其他。

2.6 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組生長(zhǎng)豬的血清IgG含量分別提高了37.79%(P<0.05)和15.14%(P<0.05)，IgM含量分別提高了36.91%(P<0.05)和26.51%(P<0.05)，SOD活性分別提高了34.47%(P<0.05)和29.99%(P<0.05)，GSH-Px活性分別提高了37.07%(P<0.05)和31.99%(P<0.05)，MDA含量分別降低了25.39%(P<0.05)和20.74%(P<0.05)；生長(zhǎng)豬的血清IgA含量和T-AOC各組間差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響

有研究指出，乳酸菌發(fā)酵飼料中含有大量的乳酸菌和有機(jī)酸、酶、胞外多糖等代謝產(chǎn)物，可以增加飼料的適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，促進(jìn)腸道的健康和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，有利于動(dòng)物生長(zhǎng)性能的提高[11-12]。與單一菌種發(fā)酵相比，多菌種復(fù)合發(fā)酵飼料可以充分發(fā)揮乳酸菌菌種之間的協(xié)同作用，不僅能快速增菌和產(chǎn)酸，加快發(fā)酵進(jìn)程，而且可以豐富飼料中的代謝產(chǎn)物，提高發(fā)酵品質(zhì)，有望成為未來(lái)發(fā)酵飼料的發(fā)展趨勢(shì)[13-15]。王磊等[16]報(bào)道，以鼠李糖乳桿菌、乳酸片球菌和干酪乳桿菌為復(fù)合菌種制備的發(fā)酵飼料，可以極顯著降低八眉三元豬的ADFI，顯著降低其F/G。本試驗(yàn)中，乳酸片球菌和副干酪乳桿菌復(fù)合發(fā)酵飼料飼喂生長(zhǎng)豬，添加量為1%和3%時(shí)均能夠顯著降低生長(zhǎng)豬的F/G。有研究認(rèn)為，發(fā)酵飼料的促生長(zhǎng)效果與發(fā)酵飼料的菌種、發(fā)酵工藝、添加劑量、飼喂時(shí)間長(zhǎng)短、飼料的營(yíng)養(yǎng)成分、豬的生長(zhǎng)階段等密切相關(guān)[15,17-18]。由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料能夠降低生長(zhǎng)豬的F/G，其原因可能是復(fù)合乳酸菌發(fā)酵能夠增加飼料中的有益代謝產(chǎn)物，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率。此外，本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，當(dāng)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料添加量為1%時(shí)可顯著提高生長(zhǎng)豬的ADG，而3%的添加量對(duì)豬的ADG沒(méi)有顯著影響。此結(jié)果表明，本試驗(yàn)條件下制備的乳酸菌發(fā)酵飼料以添加1%較為適宜，過(guò)多添加未能取得更好的促增重效果，其原因可能是乳酸菌發(fā)酵飼料中含有較多的乳酸菌活菌，過(guò)多添加可能會(huì)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，或是額外增加微生物對(duì)腸道中部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，從而影響宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和生長(zhǎng)發(fā)育[19]。本研究結(jié)果提示，后續(xù)研究中還需進(jìn)一步對(duì)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物和添加劑量等進(jìn)行更深入地分析和明確，以期能夠更好地促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵飼料在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。

Clostridium_sensu_stricto_1：狹義梭菌屬1；Streptococcus：鏈球菌屬；Terrisporobacter：土孢桿菌屬；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群屬；Treponema：密螺旋體屬；Oscillospiraceae_UCG-005：顫螺旋菌科UCG-005屬；Oscillospiraceae_NK4A214_group：顫螺旋菌科NK4A214群屬；Prevotella：普雷沃氏菌屬；Oscillospiraceae_UCG-002：顫螺旋菌科UCG-002屬；Lachnospiraceae_XPB1014_group：毛螺菌科XPB1014群屬；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群屬；Prevotellaceae_NK3B31_group：普雷沃氏菌科NK3B31群屬；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃氏菌科UCG-003屬；Others：其他。

3.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬糞便菌群數(shù)量的影響

乳酸菌可以利用飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖、代謝。乳酸菌進(jìn)入動(dòng)物腸道后，能夠與大腸桿菌等有害菌競(jìng)爭(zhēng)腸道上皮的黏附位點(diǎn)，爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而乳酸等有機(jī)酸能夠降低腸道內(nèi)pH，增加有益菌數(shù)量，抑制有害菌的生長(zhǎng)[20-22]，有益于腸道內(nèi)微生物區(qū)系的平衡和腸道健康的改善。張錚等[10]研究結(jié)果顯示，給斷奶仔豬飼喂唾液乳桿菌發(fā)酵飼料可顯著提高糞便中乳酸菌數(shù)量和降低大腸桿菌數(shù)量。Van Winsen等[23]的研究結(jié)果也表明，植物乳桿菌液體發(fā)酵飼料顯著增加了生長(zhǎng)育肥豬糞便中乳酸菌數(shù)量，顯著減少了沙門(mén)氏菌和大腸桿菌數(shù)量。本試驗(yàn)中，生長(zhǎng)豬飼喂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料能夠顯著提高糞便中乳酸菌數(shù)量，顯著降低大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量，同時(shí)也有降低沙門(mén)氏菌數(shù)量的趨勢(shì)，與上述研究結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn)，生長(zhǎng)豬飼喂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料后，可增加腸道有益菌數(shù)量，減少有害菌數(shù)量，有效調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)腸道健康。

表6 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬血清生化指標(biāo)的影響

表7 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

3.3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響

動(dòng)物腸道是機(jī)體的消化器官和免疫器官，腸道菌群在維持宿主腸道的結(jié)構(gòu)功能、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和代謝以及調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能等方面具有重要的作用[24]。研究認(rèn)為，添加乳酸菌可以改變豬腸道的菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善腸道的消化吸收和機(jī)體健康[25-26]。

α多樣性指數(shù)可反映樣本中微生物群落的豐富度和多樣性，分析其變化有助于從宏觀上評(píng)估復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)豬腸道菌群的影響。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)可反映物種的種類和豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可反映物種的多樣性和均勻度，受樣本豐富度和均勻度的影響，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明群落的物種多樣性越高。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌能夠顯著增加斷奶仔豬腸道菌群的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)。Tajima等[27]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌液體發(fā)酵飼料可以顯著提高斷奶仔豬糞便菌群的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)。本試驗(yàn)中，生長(zhǎng)豬飼喂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料后，糞便菌群的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著增加，Simpson指數(shù)顯著降低。從該結(jié)果可以看出，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料進(jìn)入生長(zhǎng)豬腸道后可以影響腸道菌群，能夠提高腸道菌群的物種豐富度和多樣性，有利于腸道健康和機(jī)體健康。

本試驗(yàn)中，生長(zhǎng)豬糞便菌群在門(mén)水平上主要為Firmicutes和Bacteroidetes，相對(duì)豐度占比在90%以上，并且乳酸菌發(fā)酵飼料可顯著降低糞便菌群中Bacteroidetes的相對(duì)豐度，這與諸多研究結(jié)果[28-29]相似。Bacteroidetes是腸道中數(shù)量最大的革蘭氏陰性菌，主要參與飼糧中多糖的降解，其相對(duì)豐度降低的原因可能是，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低腸道內(nèi)pH，從而抑制了Bacteroidetes等革蘭氏陰性菌的定植和繁殖。進(jìn)一步在屬水平上分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料顯著增加了生長(zhǎng)豬糞便中Clostridium_sensu_stricto_1的相對(duì)豐度，顯著降低了Streptococcus的相對(duì)豐度，這與Wang等[30]的研究結(jié)果類似。Clostridium_sensu_stricto_1是豬腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，與蛋白質(zhì)代謝有關(guān)[31]，其相對(duì)豐度升高的原因可能是，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵可以增加飼料中的粗蛋白質(zhì)含量或氨基酸濃度，由此提高了腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵底物的氮源濃度。Streptococcus是動(dòng)物腸道內(nèi)的條件致病菌，具有誘導(dǎo)發(fā)病的潛在風(fēng)險(xiǎn)，其相對(duì)豐度降低的原因可能與復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料能夠降低腸道內(nèi)pH或是乳酸菌的拮抗作用有關(guān)。

3.4 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可以間接反映機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)代謝和組織器官的功能。血清TP由肝臟合成，可反映機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收情況以及與體液免疫的關(guān)系，而GLB由漿細(xì)胞分泌，可反映機(jī)體的免疫狀況和抵抗力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料后，生長(zhǎng)豬血清中TP和GLB含量顯著升高，說(shuō)明該發(fā)酵飼料可以增強(qiáng)生長(zhǎng)豬的蛋白質(zhì)合成能力和免疫力。血清TC是血脂的重要組成部分，可反映肝臟脂肪代謝情況。Lye等[32]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可通過(guò)調(diào)控體內(nèi)膽鹽水解酶的活性和同化膽固醇的途徑來(lái)降解血液中膽固醇含量。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組血清TC含量顯著低于對(duì)照組，揭示乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬的脂代謝具有促進(jìn)作用。血清UN是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)氨基酸平衡良好時(shí)，其含量會(huì)下降[33]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組血清UN含量顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料有利于機(jī)體蛋白質(zhì)的合成和代謝，可增加機(jī)體氮沉積量，促進(jìn)生長(zhǎng)，其原因可能與乳酸菌發(fā)酵改善了飼料的氨基酸組成有關(guān)。血清ALT和AST常被用作肝功能檢測(cè)的敏感指標(biāo)，其活性過(guò)高時(shí)提示肝臟細(xì)胞可能受到損傷[34]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組血清中ALT和AST活性較對(duì)照組降低，說(shuō)明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬的肝臟具有一定的保護(hù)作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和吸收，有利于生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.5 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)豬血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

乳酸菌發(fā)酵飼料中的乳酸菌和代謝產(chǎn)物，可以作為獨(dú)立抗原刺激腸道黏膜、上皮細(xì)胞和相關(guān)淋巴組織，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[35-36]。血清中的免疫球蛋白是體液免疫的主要抗體，主要包括IgG、IgM和IgA，其含量可在一定程度上反映機(jī)體的免疫水平。Mizumachi等[37]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌液體發(fā)酵飼料可以提高斷奶仔豬的血清IgM和IgG含量。張秀江等[6]研究顯示，植物乳桿菌液體發(fā)酵飼料可顯著升高育肥豬血液中IgA和IgG含量。本研究顯示，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料顯著提高了生長(zhǎng)豬的血清IgG、IgM含量，表明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和免疫力的提高，對(duì)豬群的健康狀況有利。

氧化應(yīng)激是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的一種負(fù)面影響，過(guò)量的氧自由基會(huì)損傷細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂類和核酸等，引起機(jī)體衰老與疾病[38]。機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)(如T-AOC、SOD、GSH-Px等)具有清除活性氧自由基的功能，是維持動(dòng)物健康的重要防線。T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化功能的綜合指標(biāo)，SOD和GSH-Px是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶，而MDA含量可反映機(jī)體受損的程度。Gilbert等[36]和劉志云等[39]的研究均發(fā)現(xiàn)，飼料經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后含有豐富的有益代謝產(chǎn)物(維生素、小肽、消化酶等)，能夠提高飼料的抗氧化功能。李濤等[40]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌發(fā)酵飼料可以顯著提高生長(zhǎng)豬血清中SOD和GSH-Px活性，顯著降低MDA含量。本試驗(yàn)也得到了相同的結(jié)果，表明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飼料能夠增強(qiáng)生長(zhǎng)豬對(duì)體內(nèi)活性氧自由基的清除能力，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，從而有益于生長(zhǎng)豬的健康。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加1%的復(fù)合乳酸菌固態(tài)發(fā)酵飼料能夠提高生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能，改善腸道菌群組成和腸道健康，并能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和抗氧化功能。