鄧旭坤，戴晨曦，段歡，劉釗，阿爾斯拉·玉蘇甫，舒廣文*

（1 中南民族大學 藥學院& 民族藥學國家級實驗教學示范中心，武漢 430074；2 中南民族大學 學報編輯部，武漢 430074）

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP），又稱撲熱息痛，是國內、外常用的非甾體抗炎止痛藥，廣泛用于感冒、疼痛、發(fā)熱病癥的治療［1］.目前市場上已知的暢銷感冒藥物，如快克、泰諾、白加黑等的主要成分均為APAP，而這些感冒藥大多為OCT 藥物由患者自行購買或使用.臨床報道顯示：由于患者用藥知識的匱乏，超劑量或者同時服用多種主含成分相近的感冒藥，會引起APAP 攝入過量而導致嚴重的藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）.目前臨床上治療APAP 肝損傷的有效藥物和措施不多［2］.因此，尋找理想的解決APAP 超劑量服用所致的肝損傷是一個亟待解決的問題.

竹節(jié)參（Panax japonicusC.A.Mey.）是五加科人參屬多年生植物，由于其同時具有人參補氣和三七補血的功效，素有“草藥之王”的稱號［3］.竹節(jié)參主要含有多糖和皂苷兩大活性成分，前期的研究發(fā)現竹節(jié)參多糖具有增強小鼠抗腫瘤免疫反應的能力［4］，同時竹節(jié)參總皂苷（total saponins fromPanax japonicusC.A.Mey.，PJST）可改善乙醇誘導的小鼠肝損傷［5］，還對高脂飼料誘導的小鼠肝纖維化也有抑制作用［6］.但PJST在干預APAP誘導的肝損傷方面的研究和報道較少，故本文從體內和體外研究PJST 干預APAP引起急性肝損傷的作用及其潛在的分子機制.

1 材料

1.1 藥物

竹節(jié)參采集于湖北恩施土家族自治州，經中南民族大學藥學院萬定榮教授鑒定，為五加科人參屬植物竹節(jié)參，憑證標本（NO. SC-2012054）現保存在中南民族大學藥學院.竹節(jié)參總皂苷（PJST）的提取制備按照參考文獻［7］進行，1 kg的竹節(jié)參根莖獲得約130 g的PJST.

1.2 動物

SPF級昆明種小鼠（雌雄各半，6～8周齡，18～22 g）40 只，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號為SCXK（鄂）：2016-0089.在本文中，動物實驗管理的相關方案均已通過中南民族大學實驗動物倫理委員會（批準號：2018-SCUEC-AEC-014）的審批.

1.3 細胞株及細胞培養(yǎng)

人HepG2 肝癌細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學），使用DMEM 培養(yǎng)基（含有10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素）于培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中常規(guī)培養(yǎng).

1.4 藥品與試劑

人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 的標準品購自成都普瑞法科技公司；對乙酰氨基酚（APAP）購自上海源葉生物科技公司；胎牛血清（FBS）購自武漢普諾賽生物公司；DMEM、甲基噻唑基四唑（MTT）購自美國Hyclone公司.

肝功能檢測試劑盒丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）購自南京建成生物技術研究所；炎癥因子ELISA 試劑盒白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購自武漢愛博泰克生物科技公司；核纖層蛋白B（Lamin B）、核因子B 亞基p65 親和肽（NF-κB p65）、Ser276 位磷酸化核因子B 亞基p65 親和肽（P-NF-κB p65）、HPR 標記山羊抗兔IgG（H+L）購自武漢三鷹生物科技公司；BCL2-Associated X（Bax）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、β-Actin、細胞核和細胞質蛋白提取試劑盒、超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）；Hoechst 33258 熒光染料、DAPI 染色液（DAPI dihydrochloride，staining solution）和TUNEL 細胞凋亡檢測（一步法）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司.

2 方法

2.1 竹節(jié)參總皂苷提取物的主要成分分析

參考文獻［8］中的方法，對竹節(jié)參總皂苷進行成分和含量的分析.

色譜條件：Agilent C18柱（4.6 cm×25 cm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，5%～5%A；5～20 min，5%～30%A；20～30 min，30%～30% A；30～50 min，30%～85% A；50～60 min，85%～85% A；流速1.0 mL·min-1；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL.

2.2 竹節(jié)參總皂苷對APAP 誘導HepG2 細胞凋亡的干預作用

取對數生長期細胞鋪板，待細胞貼壁后，加入不同劑量的PJST（終濃度為30 μg·mL-1，100 μg·mL-1）孵育24 h.再加入APAP（終濃度為10 mmol·L-1）孵育24 h.在倒置顯微鏡下，觀察并進行細胞形態(tài)學分析，采用MTT 法檢測細胞活力［9］，Hoechst 33258 熒光染色法對HepG2細胞的凋亡形態(tài)進行研究.

2.3 動物實驗及生化指標檢測

取6～8周齡昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機分為空白組、模型組、PJST低、高劑量組（50、100 mg·kg-1）.各組小鼠灌胃給藥（空白組和模型組給予0.9%NaCl 溶液，給藥組給予對應劑量的PJST），每天1 次，連續(xù)7 d.末次給藥2 h 后，除空白組外每組小鼠腹腔均注射APAP溶液（400 mg·kg-1），12 h后將小鼠摘眼球取血于離心管，室溫放置30 min后，離心（3000 r·min-1）15 min，吸取上清液按試劑盒說明書規(guī)定的操作方法，測定小鼠血清中ALT、AST 及LDH 的含量.然后采取頸椎脫臼法處死小鼠，取部分肝小葉組織于4%甲醛溶液中固定用于免疫組化，剩余組織立即放入-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)指標測定，用ELISA試劑盒測定肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-β的含量.

2.4 組織病理學分析，細胞凋亡染色和免疫組化染色

將甲醛固定后的肝組織包埋在石蠟中制成蠟塊并切成5 μm 厚的切片.按照參考文獻［10］，對組織切片進行HE 染色、Hoechst 33258 染色和免疫組化染色.TUNAL 的染色根據試劑盒說明書的指示進行.

2.5 細胞核蛋白抽提

使用細胞核和細胞質蛋白抽提試劑盒提取細胞核蛋白.首先使用細胞漿蛋白抽提試劑，在低滲透壓條件下，細胞漲破釋放細胞漿蛋白，后離心得到細胞核沉淀.最后通過高鹽的細胞核蛋白抽提試劑抽提得到細胞核蛋白.

2.6 Western-blot分析

取上述冷凍的肝臟組織適量和抽提的細胞核蛋白，參考文獻［11］中的方法進行免疫印跡的檢測和分析.

2.7 統(tǒng)計分析

所有實驗數據均以±s表示.使用GraphPad Prism 6.0，通過單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計學分析；采取Image-Pro plus 6.0 對Western-bolt 圖像的灰度值進行對比分析，P＜0.05 說明組間差異具有統(tǒng)計學意義.

3 結果

3.1 竹節(jié)參總皂苷提取物的成分分析

采取峰面積歸一化法計算出竹節(jié)參總皂苷提取物中各個皂苷成分的相對含量，如圖1所示，竹節(jié)參總皂苷中主要含有一下幾個主要成分：人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa，其相對含量分別為87.3、77.2、441.0、227.1、75.0 μg·mg-1.

圖1 竹節(jié)參總皂苷的成分分析（HPLC法）Fig.1 Component Analysis of PJST（HPLC）

3.2 PJST對APAP誘導的HepG2細胞凋亡的影響

形態(tài)學分析和MTT 細胞活力試驗顯示（圖2（a）、圖2（b））PJST 改善了APAP 誘導的HepG2 細胞死亡（P＜0.01）.此外如圖2（c）、圖2（d）所示，Hoechst 33258染色試驗表明APAP 10 mmol·L-1時，HepG2細胞顯示出明顯的核固縮、邊集、核碎裂的細胞凋亡形態(tài)，而PJST 的預保護給藥抑制了APAP 引起的HepG2 細胞凋亡.這些結果表明，PJST 能夠緩解APAP對HepG2細胞的毒性作用.

圖2 PJST對APAP誘導的HepG2細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of PJST on APAP-induced Apoptosis of HepG2 cells

3.3 PJST對APAP誘導小鼠肝毒性的影響

小鼠血清中的ALT、AST和LDH能直接反映小鼠的肝損傷程度.如圖3（a）、圖3（b）和圖3（c）所示，注射APAP后血清ALT、AST和LDH顯著升高，而PJST可以顯著地減輕這些異常（P＜0.01）.此外，APAP破壞了正常的肝組織，病理學分析顯示模型組小鼠肝臟出現大量的炎性細胞浸潤以及出血的情況，而這些炎癥被PJST所改善（圖3（d））.APAP攝入過量同時也會引起肝細胞的大量凋亡性死亡，如圖3（e）、圖3（f）所示，Hoechst 33258的小鼠肝臟染色結果與HepG2細胞染色結果相對應，模型組小鼠中的肝細胞也顯示出明顯的核固縮、邊集、核碎裂的細胞凋亡形態(tài)，而PJST給藥組小鼠的肝細胞凋亡情況得到了改善；TUNAL染色作為檢測細胞凋亡的經典方法，TUNAL 染色法的結果（圖3（g）、圖3（h））也進一步證明了PJST可以預防和保護APAP誘導小鼠的肝毒性.

圖3 PJST對APAP誘導小鼠肝毒性的影響Fig.3 Effect of PJST on APAP-induced hepatotoxicity in mice

3.4 PJST對APAP誘導肝損傷小鼠肝細胞中Bax和Bcl-2表達的影響

Bax 和Bcl-2 的表達是細胞發(fā)生凋亡程度的指標之一，本文采用Western blot 和免疫組化的方法檢測了Bax 和Bcl-2 在各組小鼠肝組織中表達的差異情況，結果見圖4（a）、圖4（b），圖中顯示模型組小鼠肝臟細胞中Bax 的表達明顯高于空白組小鼠，而PJST的預處理組小鼠肝組織中Bax的表達顯著低于模型組.Bcl-2 的結果與之相反，在模型組小鼠肝細胞中，Bcl-2 的表達顯著降低，而在PJST 給藥保護組中，Bcl-2 的表達被恢復；免疫組化染色的結果更加直觀的驗證了以上現象（如圖4（c）、圖4（d））.以上結果充分說明APAP 會提高小鼠肝臟組織當中Bax的表達，抑制Bcl-2 的表達而引起肝細胞的凋亡，經過PJST 的預保護，可以阻止這一現象的發(fā)生，起到肝保護作用.

圖4 PJST對APAP誘導肝損傷小鼠肝細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響Fig.4 Effect of PJST on the expression of Bax and Bcl-2 protein in APAP-induced liver injury mice

3.5 PJST 對APAP 誘導肝損傷小鼠炎癥反應的影響

APAP 誘導的急性肝損傷會引起肝內炎癥并影響肝組織中炎癥因子的產生與釋放.如圖5（a）、圖5（b）、圖5（c）所示，模型組小鼠肝組織中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平較空白組相比出現顯著上調的情況（P＜0.01），而PJST 預保護組小鼠肝臟內的TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平被顯著抑制了（P＜0.05 或P＜0.01）. Western-blot 檢測了肝組織中P-NF-κB p65 和核內NF-κB p65 蛋白的表達水平結果見圖5（d）和圖5（e），可見在模型組小鼠肝組織中，P-NF-κB p65 以及細胞核內NF-κB p65 的表達水平較空白組顯著增加（P＜0.01），而PJST 可以顯著下調P-NF-κB p65 和核內NF-κB p65 的表達水平（P＜0.01）.以上結果說明APAP 可以通過促進肝組織內炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的產生與釋放，并上調肝組織細胞P-NF-κB p65 及核內NFκB p65 的表達水平，而引發(fā)小鼠肝臟的炎癥反應產生肝損傷.PJST 通過對抗APAP 的上述作用，而有效緩解其誘導小鼠的肝臟炎癥反應而發(fā)揮肝保護作用.

圖5 PJST對APAP誘導肝損傷小鼠炎癥反應的影響Fig.5 Effect of PJST on inflammatory response in APAP-induced liver injury mice

4 討論

過量服用APAP 會產生大量的APAP 代謝產物N-乙酰-P-苯醌亞胺（NAPQI），該產物會在耗竭肝臟中的谷胱甘肽（GSH）后與細胞生物大分子反應并形成共價鍵，導致肝細胞內線粒體損傷，炎癥以及細胞凋亡的發(fā)生［12］.近年來，從植物來源的天然產物中尋找潛在的治療肝損傷的藥物的研究日益成為熱點方向.竹節(jié)參因其較高的藥用價值而逐漸成為藥用植物學家研究的關注對象，作為其主要活性成分竹節(jié)參皂苷具有較高的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗氧化的活性［13-14］.在此基礎之上，本文構建了APAP 誘導的肝損傷模型，以評估竹節(jié)參總皂苷的保肝護肝作用及其可能機制.

血清中ALT、AST 和LDH 水平是評價動物肝功能的經典指標［15］.本文中APAP 引起了小鼠血清中ALT、AST和LDH水平的顯著增加，PJST的預處理能顯著抑制APAP 誘導的上述肝功能指標的異常升高.組織病理學的結果也進一步說明在組織形態(tài)學方面PJST發(fā)揮了良好的保護作用.

肝細胞凋亡在APAP 肝損傷模型中起著重要作用，病理情況下的肝細胞凋亡會加速肝臟衰竭.Hoechst 33258 熒光染色和TUNEL 法是常見的細胞凋亡檢測方法.Bcl-2 家族是一類調控細胞凋亡的關鍵蛋白，成員眾多，其中Bax 是一種促凋亡蛋白，通過誘導線粒體膜透化并釋放細胞色素c 誘導細胞凋亡；而Bcl-2 具有明顯抑制細胞凋亡的作用，可增強肝細胞對大多數DNA 損傷因子的抵抗性［16］.在APAP 誘導的HepG2 細胞死亡實驗和APAP 誘導的小鼠肝損傷實驗中均出現凋亡情況.同時，體內實驗中模型組小鼠肝組織中Bax的表達上調而抗Bcl-2的表達受到抑制，以上情況顯示APAP 誘導的肝損傷啟動了肝細胞的凋亡性死亡.而PJST 的預處理組細胞凋亡明顯減少，Bax的異常表達被抑制，Bcl-2的表達也恢復到了正常水平，由此證明PJST的預保護可以有效預防APAP誘導的肝細胞凋亡.

APAP 誘導肝細胞內的線粒體損傷，會導致細胞內容物（如核蛋白、核DNA 片段、ATP、尿酸等）的釋放［17］.這些損傷相關分子模式（DAMPs）的存在可能通過toll 樣受體激活NF-κB p65.NF-κB p65 信號通路的傳導會增強一系列促炎細胞因子（如TNF-α、IL-1 和IL-6）的表達，而這些炎癥因子反過來又會加劇APAP 誘導的肝損傷造成惡性循環(huán)［18］.本研究結果顯示，APAP模型組中這些炎性細胞因子的表達顯著高于空白組，上調P-NF-κB p65，并且促進NF-κB p65的入核，而PJST 預保護組不僅抑制了上述炎癥因子的上調，也下調了NF-κB p65 的磷酸化水平和NF-κB p65 的核內表達.以上結果表明PJST 可能通過抑制肝臟內的炎癥反應產生了對APAP 誘導肝損傷的干預效果.

本文結果表明：PJST 可以通過減少肝細胞的凋亡和炎癥來抵抗APAP 誘導的肝損傷.PJST 通過降低肝組織中Bax 的表達并上調Bcl-2 的表達作為抗凋亡的保護機制；同時，PJST 還通過抑制NF-κB p65的磷酸化和入核，降低肝組織中炎癥因子的表達水平作為抗炎的保護機制.綜上，PJST 可能是通過抑制凋亡和抗炎作用發(fā)揮干預APAP DILI 的作用，這為竹節(jié)參皂苷在抗APAP DILI的藥物研發(fā)和應用中提供相關的實驗依據.