陳蘭洲，吳萬(wàn)銀，李昌虎，何凡，張玉克

（武漢大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，武漢 430074）

廢棄礦山的尾礦中含有大量的重金屬，其滲濾液容易污染礦山周邊的土壤，并且會(huì)對(duì)周邊居民的健康以及生態(tài)環(huán)境造成影響［1］.因此，對(duì)廢棄礦山進(jìn)行修復(fù)變得極為重要和迫切.目前，物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)以及生物修復(fù)技術(shù)是常用的礦山修復(fù)方法，其中，無(wú)額外污染、經(jīng)濟(jì)有效的微生物修復(fù)技術(shù)逐漸受到研究者的關(guān)注［2］.

微生物修復(fù)技術(shù)是指利用人工馴化或者土著微生物的自身特性和新陳代謝作用來(lái)吸附重金屬、降低重金屬毒性以及改善土壤質(zhì)地的修復(fù)技術(shù)［3］.微生物細(xì)胞壁中帶有負(fù)電的官能團(tuán)，展現(xiàn)出了較好的與重金屬結(jié)合的能力，此外，微生物代謝的各種小分子有機(jī)酸也是微生物修復(fù)重金屬污染土壤的重要物質(zhì)，這些有機(jī)酸能夠改變基質(zhì)酸堿度以及結(jié)合重金屬降低其毒性［4］.合適的微生物物種選擇則是微生物修復(fù)成功的關(guān)鍵，與異位微生物相比，原位微生物更加有優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在對(duì)生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性和相關(guān)重金屬的耐受性上［5］，然而目前對(duì)特定場(chǎng)地的微生物修復(fù)物種的相關(guān)耐受性、污染物去除機(jī)理、作用機(jī)制等方面的研究尚有欠缺.

因此，本研究以銅尾礦庫(kù)篩選出的一株土著真菌為對(duì)象，研究了其對(duì)重金屬銅的耐受、去除能力，并進(jìn)一步分析了其耐受的機(jī)理和其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的改變能力，以期為選擇金屬礦區(qū)污染土壤修復(fù)的微生物物種提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試真菌為Aspergillussp.TDC-1，分離自云南湯丹的一處銅礦尾礦庫(kù)，經(jīng)純化鑒定后（NCBI檢索號(hào)：MZ221492）保存于武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院生態(tài)學(xué)與環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室.將保存的菌種接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，在平板中倒入無(wú)菌去離子水，使用滅菌的接種環(huán)將孢子輕輕劃入無(wú)菌水中，然后將孢子懸浮液吸出備用.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將含有200 mL PDA 液體培養(yǎng)基的錐形瓶高溫滅菌，冷卻至室溫后加入CuSO4·5H2O 儲(chǔ)備液，分別配置成Cu2+濃度為0、5、25、50、100、150、200 mg·L-1的培養(yǎng)基.然后接種2 mL孢子懸浮液，設(shè)置3個(gè)平行，最后置于震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（27 ℃，150 r/min），培養(yǎng)14 d 后使用0.45 μm 水膜過(guò)濾，收集菌絲體和濾液用于后續(xù)分析.

1.3 菌絲掃描電鏡觀(guān)察

將新鮮菌絲體洗滌后使用FAA 固定液（50%乙醇、丙三醇、甲醛、冰醋酸的體積比為18∶1∶1∶1）固定過(guò)夜，固定后，使用20%的乙醇對(duì)菌絲進(jìn)行處理，時(shí)間為15 min，然后離心收集菌絲，之后依次使用濃度為50%、80%、100%的乙醇各處理一次.處理結(jié)束后加入叔丁醇，并放于-20 ℃冰箱進(jìn)行樣品固化，然后在冷凍干燥機(jī)中凍干樣品，凍干時(shí)長(zhǎng)為12 h，凍干后使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀(guān)察菌絲的形態(tài).

1.4 菌絲生理生化指標(biāo)

將收集到的新鮮菌絲體用去離子水洗滌2～3次，放入70 ℃烘箱中烘干至恒重，然后稱(chēng)量菌絲體的干重.真菌的生長(zhǎng)抑制率按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算.

式中，m0為未受脅迫處理組的真菌干重，mc為受脅迫處理組的真菌干重.

在研缽中加入0.1～0.2 g 新鮮菌絲、適量石英砂和2 mL 0.05 mol/L 的磷酸緩沖溶液（含有體積分?jǐn)?shù)為1%的聚乙烯吡咯烷酮并且調(diào)節(jié)pH到7.8），研磨，待研磨成勻漿后吸出勻漿液并定容到10 mL，然后離心10 min（4 ℃，8000 r/min），取上清液并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量菌絲中的蛋白質(zhì)含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性［6］.然后另取0.1～0.2 g 新鮮菌絲于研缽中，以2 mL 0.05 mol·L-1的磷酸緩沖溶液（pH為7.8）為提取液，研磨離心后取上清液測(cè)量菌絲中的丙二醛（MDA）的含量［6］.

1.5 pH和有機(jī)酸含量的測(cè)定

使用pH 計(jì)直接測(cè)量培養(yǎng)液的pH.用0.1 mol·L-1的H2SO4酸化濾液，并用0.22 μm 濾膜進(jìn)行二次過(guò)濾，然后用高效液相色譜進(jìn)行有機(jī)酸的檢測(cè).以草酸、乙酸、抗壞血酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸和蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和峰面積作為對(duì)照，對(duì)培養(yǎng)液中有機(jī)酸的成分和濃度進(jìn)行分析.色譜條件為：0.01 mol/L 的磷酸二氫鉀緩沖液（pH 為2.8）與甲醇混合液（緩沖液與甲醇的體積比為95∶5）作為流動(dòng)相，色譜柱為Agilent SB-C18，進(jìn)樣量為200 μL，柱溫設(shè)置為25 ℃，流速為1 mL/min，分析波長(zhǎng)為210 nm.

1.6 Cu2+去除率的測(cè)定

濾液中的Cu2+濃度通過(guò)火焰原子吸收法進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量前使用0.22 μm 濾膜對(duì)濾液進(jìn)行二次過(guò)濾.培養(yǎng)液中Cu2+的去除率按照公式（2）計(jì)算.

式中，ρ0為培養(yǎng)初期培養(yǎng)液的Cu2+濃度，ρc為培養(yǎng)結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液的Cu2+濃度.

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和計(jì)算；使用Origin 2021 繪圖；使 用IBM SPSS Statistics 26 進(jìn) 行單因子方差分析，顯著性水平設(shè)置為α=0.05，多重比較方法選擇Duncan′s multiple range test，用不同的小寫(xiě)字母表示處理之間存在顯著差異（P＜0.05）；使用R 語(yǔ)言的corrplot 和Hmisc 程序包進(jìn)行相關(guān)性分析，用*表示顯著（P＜0.05），用**表示極顯著（P＜0.01）.

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+脅迫對(duì)真菌TDC-1生物量的影響

如圖1 所示，真菌的干重隨著Cu2+脅迫濃度的升高而降低，與未受脅迫的處理組（CK）相比，5、25和50 mg·L-1的Cu2+脅迫對(duì)真菌干重?zé)o顯著影響（P＞0.05），其 生 長(zhǎng) 抑 制 率 分 別 為3.35%、12.44% 和10.72%；而100 和150 mg·L-1的脅迫濃度使真菌干重顯著降低（P＜0.05），其生長(zhǎng)抑制率分別為31.73%和39.29%；當(dāng)脅迫濃度為200 mg/L 時(shí)真菌干重最小，其生長(zhǎng)抑制率高達(dá)82.62%.

圖1 Cu2+脅迫對(duì)真菌TDC-1干重的影響Fig.1 Effect of Cu2+stress on the dry weight of fungus TDC-1

2.2 Cu2+脅迫對(duì)TDC-1 菌絲可溶性蛋白質(zhì)、MDA 含量和SOD活性的影響

如圖2（a）所示，菌絲可溶性蛋白質(zhì)含量隨著Cu2+脅迫濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì).與CK 相比，5～50 mg·L-1的Cu2+脅迫對(duì)菌絲的蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著影響（P＞0.05），而100～200 mg·L-1的脅迫下菌絲的蛋白質(zhì)含量顯著降低（P＜0.05），其中，當(dāng)脅迫濃度為150 和200 mg·L-1時(shí)菌絲的蛋白質(zhì)含量分別降低了49.91%和55.51%.

由圖2（b）可以看出，Cu2+脅迫引起了真菌TDC-1 的MDA 含量變化，并且隨著脅迫濃度的升高，其MDA 含量也在不斷升高.其中，除5 和50 mg·L-1的Cu2+脅迫處理組對(duì)真菌細(xì)胞的MDA 含量無(wú)顯著影響（P＞0.05），其余處理組的真菌MDA 含量與CK 相比有顯著的增加（P＜0.05），同時(shí)在脅迫濃度為200 mg·L-1時(shí)觀(guān)察到了最大的MDA 含量增加，為CK的2.51倍.

如圖2（c）所示，Cu2+脅迫下真菌菌絲的SOD 活性顯著增加（P＜0.05），同時(shí)5～150 mg·L-1處理組之間的SOD 活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）.然而，真菌在200 mg/L Cu2+脅迫下未檢測(cè)到SOD活性.

圖2 Cu2+脅迫對(duì)真菌TDC-1生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of Cu2+stress on the biochemical indexes of fungus TDC-1

2.3 Cu2+脅迫對(duì)真菌TDC-1形態(tài)的影響

圖3 展示了不同濃度Cu2+脅迫下真菌TDC-1 的形態(tài).低濃度（5 mg·L-1）的Cu2+對(duì)真菌TDC-1 幾乎沒(méi)有影響，隨著脅迫濃度（25～150 mg·L-1）的升高，菌絲體受到損傷的同時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)菌絲縮小、斷裂的現(xiàn)象，并且在高濃度（200 mg·L-1）時(shí)發(fā)生菌絲膨大以及真菌破裂死亡的現(xiàn)象.

圖3 Cu2+脅迫對(duì)真菌TDC-1形態(tài)的影響Fig.3 Effect of Cu2+stress on the morphology of fungus TDC-1

2.4 Cu2+脅迫對(duì)培養(yǎng)液中pH和有機(jī)酸含量的影響

對(duì)培養(yǎng)液pH 的測(cè)定結(jié)果顯示，隨著Cu2+脅迫濃度的升高，培養(yǎng)液的pH 值出現(xiàn)先增大后降低的現(xiàn)象（圖4（a）），并且在脅迫濃度為50 mg·L-1時(shí)達(dá)到了最大值（6.21），在150 mg·L-1時(shí)有最小值（4.37）.同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液中7 種有機(jī)酸的檢測(cè)中僅檢出了3 種有機(jī)酸，分別為草酸、乙酸和琥珀酸（圖4（b）），其中，在Cu2+脅迫濃度為50 mg·L-1時(shí)觀(guān)察到了3 種有機(jī)酸的最小值，在200 mg·L-1處理組中觀(guān)察到了3種有機(jī)酸的最大值.與CK 相比，50 mg·L-1處理組的草酸、乙酸和琥珀酸含量分別降低了72.79%、57.06%和55.23%；而200 mg·L-1處理組的草酸和琥珀酸含量分別提升了213.30%和534.65%.就有機(jī)酸的總量而言，與CK 相比，50 mg·L-1處理組的總量降低了61.31%，而200 mg·L-1處理組的總量增加了184.72%.

圖4 Cu2+脅迫對(duì)培養(yǎng)液中pH和有機(jī)酸含量的影響Fig.4 The effect of Cu2+stress on pH and organic acid content in culture broth（a）pH；（b）有機(jī)酸含量

2.5 不同脅迫濃度下真菌對(duì)Cu2+去除率的變化

對(duì)培養(yǎng)液中Cu2+的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨著初始Cu2+濃度的升高，去除率也在逐漸下降（圖5）.其中，真菌在Cu2+脅迫濃度為5、25、50 和100 mg·L-1的脅迫下有超過(guò)60% 的去除率，分別為99.24%、88.73%、74.65%和68.06%.

2.6 不同濃度Cu2+脅迫下真菌生理生化指標(biāo)和有機(jī)酸的相關(guān)性分析

圖6展示了脅迫下真菌生理生化指標(biāo)和有機(jī)酸之間的相關(guān)性.其中，脅迫濃度與pH、菌絲干重和蛋白質(zhì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDA、草酸和琥珀酸濃度呈極顯著正相關(guān)；培養(yǎng)液中的pH 與草酸和琥珀酸的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與蛋白質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)；MDA 與菌絲干重和蛋白質(zhì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與琥珀酸和草酸含量呈極顯著正相關(guān).

圖6 不同濃度Cu2+脅迫下真菌生理生化指標(biāo)和有機(jī)酸的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between physiological and biochemical indexes and organic acids of fungi under different concentrations of Cu2+Stress

3 討論

真菌干重的大小可在一定程度上反映Cu2+脅迫對(duì)真菌TDC-1 的影響程度，真菌TDC-1 的生長(zhǎng)抑制率（圖1）表明：TDC-1至少可以耐受50 mg·L-1的Cu2+脅迫.SEM 的圖像分析（圖3）則發(fā)現(xiàn)，50 mg·L-1的Cu2+脅迫下TDC-1 形態(tài)良好僅部分菌絲出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象，而隨著Cu2+濃度的升高，菌絲縮小加劇，并出現(xiàn)膨大死亡的現(xiàn)象.同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液中Cu2+的測(cè)量（圖5）發(fā)現(xiàn)，TDC-1 在100 mg·L-1的脅迫濃度下仍有較好的Cu2+去除率.因此，本研究說(shuō)明：真菌TDC-1能夠較好地耐受濃度50 mg·L-1以下的Cu2+脅迫，并且有著較好的Cu2+去除作用.

圖5 不同脅迫濃度下真菌TDC-1對(duì)Cu2+的去除率Fig.5 Removal rate of Cu2+by fungus TDC-1 under different stress concentrations

生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)有參與重金屬的解毒，增強(qiáng)生物對(duì)各種脅迫耐受的能力，而不同的生物在脅迫下所表達(dá)出的可溶性蛋白質(zhì)有所不同，通過(guò)對(duì)可溶性蛋白質(zhì)總量的分析，可以更好地了解真菌對(duì)Cu2+脅迫的抵御機(jī)制［7］.真菌TDC-1在Cu2+脅迫下總體蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)（圖2（a）），可能是可溶性蛋白質(zhì)在抵御Cu 脅迫中并非起到主導(dǎo)作用的原因［8］.此外，真菌在重金屬脅迫下活性氧和蛋白質(zhì)酶含量會(huì)增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)破裂和降解的速率加快，也可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量下降［9］.

MDA 是細(xì)胞膜受損后的產(chǎn)物，因此MDA 的含量成為了判斷真菌細(xì)胞膜受損程度的手段之一［10］.研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cu2+脅迫濃度的升高，真菌TDC-1 受到的損傷越大（圖2（b）），Cu2+濃度超過(guò)100 mg·L-1就能觀(guān)察到較明顯的損傷現(xiàn)象（圖3）.活性氧自由基（ROS）是真菌在受到外界脅迫時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)之一，如果不對(duì)多余的ROS 進(jìn)行清除，真菌的生長(zhǎng)發(fā)育就會(huì)受到影響，而SOD 可以通過(guò)清除ROS 以應(yīng)對(duì)非生物脅迫［11］.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cu2+脅迫下，菌絲體內(nèi)的SOD 活性增加（圖2（c）），但SOD 的活性隨著脅迫濃度的升高有下降的趨勢(shì)，表明TDC-1 對(duì)脅迫的耐受有一定的限度［12］.

在有毒金屬礦物存在的情況下，真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量的有機(jī)酸（如乙酸、檸檬酸和草酸）以應(yīng)對(duì)脅迫［13］.有機(jī)酸可以通過(guò)螯合作用結(jié)合重金屬使其從離子態(tài)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或是低毒性的螯合態(tài)［14］.研究發(fā)現(xiàn)，草酸和琥珀酸的含量與脅迫濃度呈極顯著的正相關(guān)，說(shuō)明有機(jī)酸的分泌是TDC-1 抵抗Cu2+脅迫的重要手段之一；此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸的分泌量與培養(yǎng)液的pH 有顯著的相關(guān)性，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果類(lèi)似［15］.

當(dāng)脅迫濃度較低時(shí)（0～50 mg/L），TDC-1 受到的損害較小，生物量和菌絲形態(tài)與CK 相比無(wú)顯著改變，此時(shí)抗氧化酶系統(tǒng)可能是其耐受Cu2+的主要機(jī)制，而有機(jī)酸則在真菌受到脅迫和吸附重金屬離子的過(guò)程中含量降低［16］，溶液中的pH 也因此增加。當(dāng)脅迫濃度較高時(shí)（50～200 mg/L），TDC-1 受到的損害增大，生物量降低并且發(fā)生嚴(yán)重的形態(tài)改變，而SOD 活性也有所降低，此時(shí)有機(jī)酸可能是其耐受Cu2+的主要機(jī)制，因此培養(yǎng)液中有機(jī)酸含量大量增加，pH 降低.但關(guān)于真菌TDC-1 有機(jī)酸分泌的具體機(jī)制，還需要代謝和基因組學(xué)的驗(yàn)證.

綜上所述，真菌TDC-1 能夠耐受至少50 mg·L-1的Cu2+脅迫，并且對(duì)培養(yǎng)液中的Cu2+有較好的去除效率，是優(yōu)秀的銅礦區(qū)修復(fù)微生物物種.此外，真菌TDC-1 主要依賴(lài)抗氧化系統(tǒng)和分泌有機(jī)酸來(lái)應(yīng)對(duì)Cu2+脅迫，SOD活性的提高和有機(jī)酸的分泌可能是其減輕銅毒害、提高銅耐受性的潛在機(jī)制.