羅 嫚 SIHOMCHANH Bounpheng 何 瓊 譚輝華 李雪生 吳海燕*

（1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，廣西南寧 530004；2 國家農(nóng)林研究院園藝研究所，老撾萬象 7071）

番茄（）是廣泛種植的蔬菜作物，具有較高的營養(yǎng)價值，種植面積居世界第2 位，僅次于馬鈴薯，且居加工蔬菜第1 位（Lal et al.，2017）。近年來，隨著設(shè)施番茄的種植面積持續(xù)增加，經(jīng)土壤傳播的番茄枯萎病亦發(fā)生嚴重，成為制約番茄設(shè)施生產(chǎn)的瓶頸問題（禇新培 等，2020）。番茄枯萎病是由尖孢鐮孢菌番茄?；停╢.sp.）侵染引起的，在番茄幼苗期到成株期均可發(fā)生（詹發(fā)強等，2013；賀宏偉 等，2018；Manikandan et al.，2018）。多年連作的地塊發(fā)病率高達20%～40%，并呈逐年加重的趨勢，番茄采收前期和中期發(fā)病均會出現(xiàn)嚴重的減產(chǎn)現(xiàn)象（Anitha &Rabeeth，2009；閆敏 等，2013）。

廣西百色市田陽縣位于中國華南地區(qū)，露地大面積冬種番茄。近年來，隨著番茄生產(chǎn)的規(guī)模化和集約化，病害發(fā)生越來越嚴重，番茄枯萎病、灰霉病、細菌性斑點病等為害造成的損失逐年增加（李寶聚 等，2014；張靜潔 等，2021）。其中番茄枯萎病常與根結(jié)線蟲協(xié)同侵染，加重病情，是該地區(qū)的主要病害之一。生產(chǎn)上防治枯萎病最經(jīng)濟有效的方法是選育抗病品種，但抗枯萎病的番茄種質(zhì)資源有限，且抗枯萎病番茄品種因產(chǎn)量低而未被廣泛種植（Landa et al.，2004）。目前，化學(xué)防治仍是防治枯萎病的主要手段，但由于單一藥劑的長期使用或不合理使用，病原菌容易產(chǎn)生抗藥性。在草莓枯萎病菌對多菌靈和戊唑醇的抗性研究中發(fā)現(xiàn)，利用含上述兩種藥劑的培養(yǎng)基分別繼代培養(yǎng)草莓枯萎病菌到45 代和36 代后，枯萎病菌對多菌靈和戊唑醇的抗藥性分別增加到53.91 倍和34.22 倍；對抗性菌株的遺傳穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn)，該病菌在連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)8 代后抗藥性穩(wěn)定性較強，對多菌靈和戊唑醇的抗性能夠通過無性繁殖遺傳（顧春波，2010）。因此，如何降低枯萎病菌對農(nóng)藥的抗藥性仍是生產(chǎn)上亟待解決的問題。前人研究表明，通過相關(guān)藥劑復(fù)配可提高防病效果，延緩病原菌對單一藥劑的抗藥性。比如，田間使用1%申嗪霉素懸浮劑與40%咪鮮胺水乳劑復(fù)配，對小麥赤霉病的防效達84.65%，顯著高于單劑防效（侯昌亮 等，2014）。本試驗在前期獲得的咪鮮胺和咯菌腈最佳濃度（10 mg · L）和復(fù)配比（2∶8）基礎(chǔ)上（李丙雪 等，2021），進一步開展盆栽試驗和藥劑殘留檢測，以期為延緩枯萎病菌抗藥性產(chǎn)生，減少用藥量等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株是2018 年2 月分離于廣西百色市田陽縣番茄種植基地采集的番茄枯萎病病株，在廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室采用常規(guī)組織分離法對樣本進行病原菌的分離、培養(yǎng)和純化，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子鑒定為（基因登錄號為：MN240928）。供試番茄品種為改良毛粉802 F，購自廣州亞蔬園藝種苗有限公司。采用的基質(zhì)為全價育苗基質(zhì)（有機質(zhì)+腐殖酸≥50%），長春益農(nóng)賽世泥炭開發(fā)有限責任公司生產(chǎn)。

參試藥劑：96.8%咪鮮胺原藥，99.2%咯菌腈原藥，均為山東濰坊潤豐化工有限公司生產(chǎn)；復(fù)配劑為咪鮮胺原藥和咯菌腈原藥按照2∶8（體積比）配制，其中單劑的有效成分含量均為10 mg · L，前期試驗結(jié)果表明該復(fù)配劑對番茄枯萎病菌的抑菌率達91.1%（李丙雪 等，2021）。

試驗儀器：GXZ 型恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠生產(chǎn)；Sigma 3K13 離心機，德國Sigma 公司生產(chǎn)；Agilent 7890A 氣相色譜儀，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，Eclipse Plus C18 液相色譜柱（50 mm × 2.1 mm，1.8 μm），美國Agilent 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 枯萎病防治試驗 將10 g 大麥粒裝入250 mL 三角瓶，共裝15 瓶，加無菌蒸餾水過夜，高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后再次滅菌30 min。預(yù)先準備好PDA 平板培養(yǎng)7 d 的番茄枯萎病菌，用直徑6 mm 的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到大麥培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。在培養(yǎng)過程中，每天搖動2 次以確保菌絲體在大麥種子上均勻生長。

2019 年5 月，將番茄種子播于規(guī)格為38 cm ×28 cm × 5 cm 的育苗盤中，在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室中育苗；幼苗3～5 葉期移栽至裝有300 g 基質(zhì)的花盆（直徑15 cm）中，每盆1 株。移栽5 d 后，用玻璃棒在距離番茄根莖2 cm 處打3 cm 深的孔，接種帶菌大麥種子，每株幼苗接種10 g，然后用基質(zhì)覆蓋。接種枯萎病菌10 d 后，進行藥劑處理。設(shè)置5 個處理：①96.8%咪鮮胺和99.2%咯菌腈復(fù)配劑（2∶8）；② 96.8%咪鮮胺單劑10 mg · L；③99.2%咯菌腈單劑10 mg · L；④ 清水對照；⑤以未接種枯萎病菌的植株為空白對照。采用完全隨機排列，2 次重復(fù)，每重復(fù)15 盆。采用灌根的方式施藥，每盆用量100 mL，未接種枯萎病菌的植株澆灌100 mL 清水。施藥后定期定量澆水，常規(guī)管理。分別在施藥后10、20、30、40、50 d 調(diào)查枯萎病發(fā)病情況，觀察植株長勢，并拍照記錄。

番茄枯萎病分級標準參考馬欣等（2016）的方法：0 級，健康植株，葉片無癥狀；1 級，1 片或2片子葉明顯變黃，以致脫落；2 級，1 片或2 片真葉變黃或全株發(fā)黃，葉片萎蔫下垂；3 級：全株明顯萎蔫或真葉嚴重變黃，植株生長受抑制、矮化；4 級：全株嚴重萎蔫以致枯死。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)／總株數(shù)× 100%

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）× 100

防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)× 100%

施藥后50 d，每處理分別輕取感病植株15株，采用卷尺測量株高（莖基部到主莖頂部的距離）、根長、莖部病斑長度（根部最上面發(fā)根處到病斑延伸末端之間的距離）（Ndeve &Roberts，2019）。

1.2.2 咪鮮胺殘留測定 施藥后50 d，每處理隨機選取15 盆，用剪刀剪取莖（莖基部5 cm）、葉片，并取土樣（即花盆中的基質(zhì)），分別裝袋、記錄，置于-20 ℃冰箱中暫存。稱取莖、葉片以及土壤樣品各100 g，每處理3 次重復(fù)，分別用組織搗碎機粉碎。然后稱取5 g 樣品于研缽中，研磨后置于50 mL 離心管中，再加入2 mL 鹽酸（1 mol · L）、5 mL 飽和氯化鈉、40 mL 丙酮，振蕩1 h 后，4 800 r · min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)至濃縮瓶中，濃縮去除丙酮后轉(zhuǎn)至分液漏斗，加入40 mL 飽和氯化鈉、60 mL 去離子水，用二氯甲烷萃取2 次，每次用量20 mL，取有機相過無水硫酸鈉于濃縮瓶中濃縮近干，再用5 mL 二氯甲烷沖洗一并轉(zhuǎn)至20 mL具塞試管中，氮氣吹干后加入5 g 吡啶鹽酸鹽，于220 ℃沙浴進行衍生化處理2 h，冷卻后待凈化。依次用20、20、10 mL 去離子水沖洗試管，將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)至分液漏斗中，加入5 mL 鹽酸（1 mol ·L），用石油醚萃取2 次，每次用量20 mL，取有機相過無水硫酸鈉后，用20 mL 石油醚沖洗無水硫酸鈉，濃縮近干，最后用正己烷定容至5 mL，待GC-μECD（氣相色譜微池電子捕獲檢測器）檢測。

咪鮮胺標準曲線的制作：咪鮮胺在環(huán)境中的降解產(chǎn)物有多種，但最終都會降解成對環(huán)境影響較大的2，4，6-三氯苯酚，因此用2，4，6-三氯苯酚配制成濃度為0.01、0.05、0.50、1.00、5.00 μg · mL的5 個系列標準溶液，以峰面積為縱坐標，濃度（μg ·mL）為橫坐標進行線性回歸分析。在最佳試驗條件下檢測咪鮮胺及其最終代謝產(chǎn)物2，4，6-三氯苯酚殘留量。

1.2.3 咯菌腈殘留測定 樣品前處理同1.2.2。稱取2.5 g 已粉碎的樣品置于離心管中，土壤、莖、葉片樣品中分別加入10、5、5 mL 超純水，渦旋5 min 后，加入5 mL 乙腈，再次渦旋5 min，然后加入3 g 無水硫酸鎂、2 g 氯化鈉，蓋上蓋子混勻，繼續(xù)渦旋3 min 后，4 000 r · min離心3 min，吸取1.5 mL 有機相于2 mL 離心管中，轉(zhuǎn)移到上機小瓶中，備用。

儀器檢測條件：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，Eclipse Plus C18 液相色譜柱。操作條件：乙腈∶水=80∶20；流速：0.4 mL · min；運行時間：2 min。離子源參數(shù)為：氣簾氣溫度350 ℃，氣簾氣流速11 mL · min，去簇電壓4 000 V，其他質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 咯菌腈的質(zhì)譜檢測參數(shù)

咯菌腈標準曲線的制作：配制濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg · mL的6 個系列標準溶液，搖勻，按照儀器檢測條件，以峰面積為縱坐標，濃度（μg · mL）為橫坐標進行線性回歸分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.5（DPSSOFTDPSW.TXT）軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用LSD 最小顯著性法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑對番茄枯萎病發(fā)病情況的影響

從表2 可以看出，接種枯萎病菌的番茄植株均發(fā)病，但不同處理的發(fā)病率和病情指數(shù)有所差異。咪鮮胺和咯菌腈對番茄枯萎病均有治療效果，尤其復(fù)配劑的治療效果更明顯，施藥后30～50 d 植株的發(fā)病癥狀不再擴展，原來的病葉脫落，其他葉片及新葉表現(xiàn)正常；3 個藥劑處理的枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)均隨藥劑施用時間呈先上升后下降的變化趨勢，施藥后50 d 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑處理的枯萎病發(fā)病率為33.33%，病情指數(shù)為28.33，明顯低于各單劑處理。

表2 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑對番茄枯萎病發(fā)病情況的影響

2.2 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑對番茄枯萎病的防治效果

從表3可以看出，濃度為10mg·L的 咪鮮胺、咯菌腈單劑以及兩者的復(fù)配劑對番茄枯萎病均具有防治效果，施用咪鮮胺和咯菌腈單劑后10～50 d 的防治效果分別為18.90%～60.61%和24.17%～53.33%，施用復(fù)配劑后10～50 d 后的防治效果為36.53%～71.67%；施藥20 d 后，咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑的防治效果高于單劑。

表3 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑對番茄枯萎病的防治效果

2.3 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑對番茄莖部病斑長度、株高和根長的影響

施藥50 d 后，咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑、咪鮮胺單劑和咯菌腈單劑處理的番茄植株莖部病斑長度分別為0.2、1.1、1.4 cm，均顯著低于清水對照，復(fù)配劑處理的莖部病斑長度還顯著小于咯菌腈單劑處理；株高分別為32.1、27.1、26.9 cm，復(fù)配劑處理與未接種病菌空白對照的株高差異不顯著，但2個單劑處理的株高顯著低于空白對照；根長分別為8.0、7.7、7.2 cm，均顯著低于未接種病菌的空白對照（表4、圖1）。

表4 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑對番茄莖部病斑長度、株高和根長的影響

圖1 咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑對接種枯萎病菌的番茄植株生長的影響

2.4 咪鮮胺及咯菌腈殘留測定

2.4.1 咪鮮胺標準曲線 以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，建立線性方程。2，4，6-三氯苯酚在0.01～5.00 μg · mL范圍內(nèi)，其濃度咯菌腈與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系，線性方程=2 307.6+203.9，=0.999 3。

2.4.2 咯菌腈標準曲線 以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，建立線性方程?？┚嬖?.01～5.00 μg · mL范圍內(nèi)，其濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系，線性方程=2 350.9+3.475，=0.999 4。

2.4.3 咪鮮胺及咯菌腈殘留分析 從表5 可以看出，施用咪鮮胺單劑、咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑50 d 后，在番茄莖和葉片中均沒有檢測出咪鮮胺及其最終代謝物2，4，6-三氯苯酚；土壤中咪鮮胺的最終殘留量分別為0.30～0.40 mg · kg和0.10 mg · kg，2，4，6-三氯苯酚的最終殘留量分別為0.60～0.90 mg · kg和0.20～0.30 mg · kg。施用咯菌腈單劑、咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑50 d 后，咯菌腈在番茄葉片中的最終殘留量均小于0.01 mg · kg，在莖中的最終殘留量分別為0.03～0.04 mg · kg和0.01～0.06 mg · kg，在土壤中的最終殘留量分別為2.11～2.28 mg · kg和1.56～1.67 mg · kg，均小于GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定的咯菌腈在番茄中最大殘留限量3 mg · kg。

表5 咪鮮胺、2，4，6-三氯苯酚和咯菌腈在土壤、番茄莖和葉片中的最終殘留量

3 結(jié)論與討論

目前，咪鮮胺和咯菌腈單劑或復(fù)配劑常用于防治番茄枯萎病，比如用0.4 mg · mL咪鮮胺防治大棚水培番茄枯萎病，防治效果為69.6%（Song et al.，2004）；80%乙蒜素乳油與25 g · L咯菌腈懸浮種衣劑或30%嘧菌酯懸浮劑的復(fù)配劑比單劑的防治效果更好，校正防效高達93.6%、89.1%（林輝 等，2018）。本試驗結(jié)果表明，盆栽番茄施藥后50 d，濃度均為10 mg · L的咪鮮胺和咯菌腈按2∶8配制的復(fù)配劑對番茄枯萎病的防效為71.67%，明顯高于咪鮮胺單劑和咯菌腈單劑對番茄枯萎病的防效（52.50%和53.33%）。試驗過程發(fā)現(xiàn)，施藥后10～50 d，番茄枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)均呈先升高后降低的變化趨勢，這是因為施藥處理是在接種枯萎病菌10 d 后進行的，藥劑處理前病原菌已侵染番茄植株，逐漸表現(xiàn)出枯萎病癥狀，藥效發(fā)揮作用后發(fā)病程度較輕的病葉脫落，新葉不再發(fā)病，部分發(fā)病植株恢復(fù)健康，再次統(tǒng)計發(fā)病情況時成為健康植株，說明該復(fù)配劑在一定時間有治療番茄枯萎病的作用，但并不能說明復(fù)配藥劑的持效期可達50 d。陳莉等（2012）在篩選防治稻曲病的藥劑試驗中發(fā)現(xiàn)，1 mg · mL烯唑醇和咪鮮胺復(fù)配劑（1∶10）對稻曲病菌的毒力作用強，30.0%烯唑醇和咪鮮胺可濕性粉劑復(fù)配的田間防效為79.2%，高于單劑。本試驗中，在施用咪鮮胺和咯菌腈復(fù)配劑30～50 d 后，番茄枯萎病的病情指數(shù)從58.33 下降到28.33，均明顯低于咪鮮胺單劑和咯菌腈單劑處理，說明復(fù)配劑對番茄枯萎病的防治起到了增效的作用。

目前我國《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）規(guī)定咯菌腈在番茄中的最大殘留限量為3 mg · kg，咪鮮胺在旱糧類、黃瓜、蘋果和蘑菇中的最大殘留限量值分別為2、1、2、2 mg · kg，但尚未制定咪鮮胺在番茄上的最大殘留限量標準。本試驗中，施用咪鮮胺、咯菌腈單劑及其復(fù)配劑50 d 后，在番茄莖和葉片中均未檢出咪鮮胺及其最終代謝物2，4，6-三氯苯酚，咯菌腈的最終殘留量分別小于0.06 mg · kg和0.01 mg · kg，使用安全，可以為防治番茄枯萎病農(nóng)藥減量增效提供重要依據(jù)。